周玄博，馮　虎，金　鵬，胡媛媛，李　寧，陳玉丙*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.胸外科；2.放療科，吉林 長(zhǎng)春130041)

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非小細(xì)胞肺癌患者血清外泌體的分離與鑒定

周玄博1，馮虎2，金鵬2，胡媛媛2，李寧2，陳玉丙2*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.胸外科；2.放療科，吉林 長(zhǎng)春130041)

外泌體最初是由Johnstone等在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)并命名[1-6]。后來的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在細(xì)胞內(nèi)形成小囊泡，可以通過胞吐釋放到周圍環(huán)境中，并能夠在血液、尿液等多種體液中檢測(cè)到[7]。外泌體中攜帶著它本身來源的細(xì)胞的多種成分，如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂質(zhì)等[8]。因此，建立穩(wěn)定的外泌體分離方法是外泌體以及后續(xù)相關(guān)研究的前提。超速離心分離外泌體的方法是當(dāng)前外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究利用超速離心的方法分離并鑒定非小細(xì)胞肺癌患者血清中的外泌體，同時(shí)也為研究非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及早期篩查提供新的切入點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗CD9、CD63單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光液(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；高速離心機(jī)、超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；透射電子顯微鏡(美國(guó)FET公司)；微孔板分光光度儀(美國(guó)BioTek公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Image Quant LAS4010)。

1.2方法

1.2.1收集血清獲得非小細(xì)胞肺癌患者的知情同意后，從患者外周靜脈血取5 ml，室溫靜置30 min后，4℃、 1000×g離心10分鐘，取上層血清1 ml裝于1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2外泌體的提取取1 ml上述血清至10 ml一次性離心管中，加9 ml 1×PBS液稀釋，上下顛倒混勻，以4℃、2 000×g的條件離心30分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到干凈的超速離心管中，以4℃、12 000×g的條件離心45分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到干凈的超速離心管中，以4℃、110 000×g的條件離心2小時(shí)，棄掉上清。用9 ml PBS液重懸沉淀，用0.22 μm濾器過濾上述重懸液，濾液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的超速離心管。以4℃、110 000×g的條件離心70分鐘，棄掉上清液。用500 μl PBS液重懸沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，-80℃保存。

1.2.3蛋白定量將0.5 mg /mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12， 16，20 μl順序加到96孔板中，各孔加入PBS 補(bǔ)充到20 μl；外泌體蛋白樣品取1μl加到96孔板中，加PBS補(bǔ)足到20 μl；各孔加入200 μl BCA工作液，用加樣槍輕輕吹打混勻，37℃孵育45 min后放入酶標(biāo)儀，于595 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。

1.2.4外泌體的鑒定

1.2.4.1外泌體形態(tài)的觀察取一干凈的100目載樣銅網(wǎng)置于封口膜上，將新鮮得到的外泌體溶液20 μl用等體積PBS稀釋后滴加到銅網(wǎng)上，室溫靜置1分鐘，室溫晾干。然后用3%(w/v)磷鎢酸鈉溶液20 μl滴到銅網(wǎng)上負(fù)染，1分鐘后用濾紙將多余液體輕輕吸去。將銅網(wǎng)放到透射電鏡下觀察，照相。

1.2.4.2外泌體表面特異性分子標(biāo)志的檢測(cè)取上述分離得到的外泌體500 μl，加入100 μl細(xì)胞裂解液，將混合物依次放入-80℃、37℃反復(fù)凍融三次1 h。BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白與5×SDS上樣緩沖液混勻(體積比4∶1)，煮10 min,12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min。每孔加入10 μg蛋白的樣品上樣至15%的SDS聚丙烯凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉，按預(yù)染Marker 標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入兔抗人CD63、CD9單克隆抗體(1∶700 ) ，4℃搖床上過夜。TBST (10 mmol /L Tris，pH 7.4，150 mmol /L NaCl和0.1%Tween 20) 洗滌3 次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次后ECL 法顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)照相。

2　結(jié)果

2.1外泌體的形態(tài)

從非小細(xì)胞肺癌患者血清中提取到一些泡狀物，透射電鏡下觀察可見其大小較為均一，形態(tài)呈杯口狀，直徑30-120 nm，有完整膜，內(nèi)有低電子密度小顆粒。見圖1。

2.2外泌體特異性分子標(biāo)志物的表達(dá)

從非小細(xì)胞肺癌患者血清中提取的囊泡表達(dá)了外泌體特異性分子標(biāo)志物CD63 和CD9，進(jìn)一步證明了該泡狀物可能為外泌體。見圖2。

圖1　非小細(xì)胞肺癌血清來源外泌體的形態(tài)

圖2　非小細(xì)胞肺癌血清來源外泌體表面標(biāo)志蛋白的表達(dá)

3　討論

外泌體是一種細(xì)胞來源的小囊泡，大小30-120 nm，幾乎存在于所有的生物體液中。外泌體能夠穩(wěn)定表達(dá)某些能夠參與抗原遞呈的蛋白質(zhì)，如CD63、CD9及TSG101等[9-12]。外泌體上攜帶了多種其來源細(xì)胞的生物大分子，如蛋白質(zhì)、RNA、質(zhì)脂，能夠揭示其來源細(xì)胞的分子指紋和細(xì)胞狀態(tài)[13]。同時(shí)研究表明，外泌體的組成和功能與其來源的細(xì)胞是有關(guān)的[14]。

許多細(xì)胞在正常和病理情況下都可以分泌外泌體。他們可以運(yùn)載一些預(yù)示著病理生理狀態(tài)的核酸和蛋白，其對(duì)臨床診斷標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)有著重要的作用。許多的研究表明外泌體中包含與腫瘤、神經(jīng)組織退化、新陳代謝、感染以及其他疾病相關(guān)的核酸和蛋白[15-17]。2009年 Rabinowits等完成了一個(gè)關(guān)于肺腺癌的研究，這一研究比較了肺腺癌患者和對(duì)照組人群中的腫瘤來源外泌體的循環(huán)水平、外泌體小RNA、特異性外泌體miRNA的表達(dá)水平，他們發(fā)現(xiàn)了循環(huán)外泌體和肺腺癌活檢樣品中miRNA的表達(dá)是相似的，而對(duì)照組卻有著顯著的不同。這也就暗示了循環(huán)外泌體miRNA在肺腺癌篩查檢測(cè)中可能會(huì)發(fā)揮重要的作用[18]。Tanaka等報(bào)道了食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清外泌體miR-21的表達(dá)水平比良性腫瘤無(wú)全身感染患者中要高。而且，外泌體miR-21與腫瘤進(jìn)展和侵襲性是及其相關(guān)的?？傊?，越來越多的發(fā)現(xiàn)表明外泌體可以成為許多疾病的一種可能性的生物標(biāo)志，為疾病基因的靶向治療提供依據(jù)。

外泌體的分離純化一直是科研工作者關(guān)注的問題，獲得高純度的外泌體對(duì)后續(xù)的研究至關(guān)重要。目前外泌體分離提取的方法有超速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、磁珠免疫法、PEG-base沉底法、試劑盒提取等。超離法具有操作簡(jiǎn)單，獲得的囊泡數(shù)量較多的優(yōu)點(diǎn)，因此，超速離心成為了研究者最常用的外泌體分離純化的手段，是目前外泌體分離純化的金標(biāo)準(zhǔn)。但是不可否認(rèn)，超速離心的方法過程比較費(fèi)時(shí)，且回收率不穩(wěn)定(可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān))，純度也受到質(zhì)疑。

本研究利用超速離心法從非小細(xì)胞肺癌患者血清中分離得到大小較為均一內(nèi)含電子致密物的泡狀物，透射電鏡觀察其形態(tài)，通過 Western blot技術(shù)分析泡狀物的外泌體特異性分子標(biāo)記的表達(dá)，證實(shí)了該泡狀物為外泌體。超速離心法、Western blot以及透射電鏡技術(shù)的綜合運(yùn)用建立了穩(wěn)定分離鑒定血清外泌體的方法。

綜上所述，本研究證實(shí)了非小細(xì)胞肺癌患者血清中存在外泌體，并建立了一套穩(wěn)定分離鑒定血清外泌體的方法。為進(jìn)行大樣本血清外泌體蛋白、核酸檢測(cè)以及非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及早期篩查研究奠定基礎(chǔ)。

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吉林省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20160101104JC)

1007-4287(2016)09-1439-03

2015-10-17)