何　江，曹建佳，陳柯宏，王德林△，盛　夏,李文賓,黃亮亮

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院消化神經(jīng)中心　401331;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科　400016)

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論著·基礎(chǔ)研究

CCM聯(lián)合HCPT對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞YAP、TEAD1表達(dá)及生物學(xué)功能的影響*

何江1，曹建佳2，陳柯宏2，王德林2△，盛夏2,李文賓2,黃亮亮2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院消化神經(jīng)中心401331;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科400016)

目的探討姜黃素(CCM)聯(lián)合羥基喜樹(shù)堿(HCPT)對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞中YAP、TEAD1表達(dá)及凋亡的作用。方法CCM和HCPT分別單獨(dú)與聯(lián)合用藥處理膀胱癌BIU-87細(xì)胞。免疫組織化學(xué)檢測(cè)膀胱癌組織及癌旁組織中YAP和TEAD1表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；RT-PCR和Western blot檢測(cè)YAP及TEAD1基因的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果YAP和TEAD在膀胱癌組織及癌旁組織中均有陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CCM和HCPT均可有效誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞BIU-87的凋亡。CCM組和HCPT組BIU-87細(xì)胞中YAP及TEAD1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合用藥組YAP及TEAD1 mRNA和蛋白表達(dá)更低(P<0.05)。結(jié)論CCM和HCPT聯(lián)合用藥抗癌機(jī)制可能是通過(guò)抑制Hippo信號(hào)通路中YAP癌基因表達(dá)，下調(diào)TEAD1，并誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。

姜黃素；膀胱腫瘤；羥基喜樹(shù)堿；YAP；TEAD1

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占90%～95%，居全球惡性腫瘤的第9位[1]。治療主要以早期手術(shù)或聯(lián)合膀胱灌注化療、晚期姑息化療為主，但目前化療機(jī)制尚不清楚，化療緩解率較低，因此，尋找抑制膀胱癌生長(zhǎng)的藥物及探討其抑癌機(jī)制成為當(dāng)務(wù)之急。

姜黃素(CCM)為姜黃的重要活性物質(zhì)之一，具有多種藥物價(jià)值，如抗炎、抗突變、抗腫瘤[2-4]。喜樹(shù)堿中提取出的羥基喜樹(shù)堿(HCPT)為抗癌作用最強(qiáng)的化合物，具有抗癌特性獨(dú)特，高效低毒，抗癌譜面廣，與多種抗腫瘤藥無(wú)交叉耐藥等特點(diǎn)，并對(duì)某些具有耐藥性的腫瘤仍具有抗癌性。新發(fā)現(xiàn)的Hippo信號(hào)通路異常調(diào)控與人類(lèi)腫瘤密不可分[5]，YAP是Hippo信號(hào)通路中下游的關(guān)鍵因子之一，YAP不能直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄，需結(jié)合共轉(zhuǎn)錄因子TEAD1影響細(xì)胞增殖和凋亡[6]。目前姜黃素與羥基喜樹(shù)堿聯(lián)合用藥對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞的研究報(bào)道較少，因此，本研究將探討姜黃素與羥基喜樹(shù)堿聯(lián)合對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞中癌基因YAP、下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD1增殖和凋亡的影響，旨在為臨床化療提供新的方法，并闡明其抑癌機(jī)制。

1　材料與方法

1.1組織學(xué)資料標(biāo)本為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科2009年2月至2012年6月36例患者手術(shù)切取的膀胱癌組織及癌旁組織(切取距腫瘤組織大于3 cm的正常膀胱黏膜為癌旁組織)。男25例，女11例，平均年齡57.3歲，均為無(wú)放化療治療史的初發(fā)病例。膀胱癌組織病理類(lèi)型：乳頭狀膀胱癌27例，浸潤(rùn)性膀胱癌9例。

1.2實(shí)驗(yàn)材料BIU-87細(xì)胞受贈(zèng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科王德林教授；CCM、二甲基亞砜(DMSO)均為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；HCPT由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室曹維國(guó)副教授惠贈(zèng)；CCK-8試劑盒購(gòu)自重慶海韻生物公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。YAP、TEAD1及GADPH引物由博培生物工程技術(shù)有限公司合成；總RNA提取試劑RNAiso、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Tap酶購(gòu)自Takara大連寶生物工程有限公司；兔抗人YAP、TEAD1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗人β-actin抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、RIPA蛋白裂解液等試劑均購(gòu)自四正柏生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理BIU-87用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在5% CO237 ℃飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約至90%時(shí)，用0.25%的胰酶將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化、傳代。實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(未加藥)、CCM組(CCM 10 μmol/L)、HCPT組(HCPT 1 μg/mL)和聯(lián)合用藥組(CCM 10 μmol/L +HCPT 1 μg/mL)。

1.3.2免疫組織化學(xué)標(biāo)本首先用4%多聚甲醛固定，再經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度為3～4 μm，選擇鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶三步法進(jìn)行YAP、TEAD1表達(dá)水平檢測(cè)。具體步驟：石蠟切片脫蠟，70%～100%梯度乙醇脫水，枸櫞酸緩沖液高溫修復(fù)3次，冷卻至室溫，洗片3 min×3次；3%H2O2室溫孵育20 min，洗片，5%山羊血清37 ℃封閉30 min，傾去不洗；滴加一抗工作液，4 ℃過(guò)夜，洗片，加二抗工作液， 37 ℃孵育30 min，洗片，滴加少許辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育30 min，洗片；DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中棕黃色出現(xiàn)為陽(yáng)性染色：細(xì)胞中胞質(zhì)棕黃色范圍大于50%，胞核棕黃色范圍大于10%和胞質(zhì)胞核中均有棕黃色反應(yīng)3種情況為高表達(dá)(++)；單純胞質(zhì)棕黃色范圍小于50%，胞核棕黃色范圍小于10%為低表達(dá)(+)；胞核和胞質(zhì)棕黃色范圍均小于10%的為不表達(dá)(-)[7]。

1.3.3細(xì)胞凋亡率檢測(cè)待培養(yǎng)瓶細(xì)胞密度為90%左右時(shí)，棄掉培養(yǎng)液， 0.25%胰酶適度消化，吹打均勻，接種2×105/mL于培養(yǎng)瓶。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在CCM濃度為10 μmol/L、HCPT濃度為1 μg/mL時(shí)抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞效率較高。各組培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，均勻吹打成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，分別加入AnnexinⅤ和PI，室溫避光孵育15 min后，F(xiàn)CM測(cè)定凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4RT-PCR檢測(cè)YAP及TEAD1的mRNA收集上述各組細(xì)胞，用RNAiso按說(shuō)明書(shū)提取各組約106個(gè)細(xì)胞總RNA，用紫外線(xiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)純度和濃度后，將RNA濃度調(diào)成一致并取等量模板，將逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。YAP上游引物：5′-TGA ACA AAC GTC CAG CAA GAT AC-3′,下游引物：5′-CAG CCC CCA AAA TGA ACA GTA G-3′，165 bp;GAPDH內(nèi)參上游引物：5′-ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG-3′，下游引物：5′-CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3′,500 bp ；TEAD1上游引物：5′-TGA ATC AGT GGA CAT TCG TCA-3′，下游引物：5′-GCC ATT CTC AAA CCT TGC ATA-3′,280 bp。擴(kuò)增基因條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以YAP或TEAD1與內(nèi)參GADPH片段的條帶光密度(OD)作半定量值比較作為YAP或TEAD1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5Western blot檢測(cè)YAP及TEAD1的蛋白表達(dá)提取各處理組細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每孔上樣60 μg在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離后，將含有目的蛋白的凝膠條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶200稀釋)于4 ℃冰箱中過(guò)夜。TBST洗膜10 min，共3次，然后加HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)稀釋?zhuān)?7 ℃ 2 h，再次用TBST洗膜10 min，共3次，放置于凝膠成像儀中免疫印跡化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，暗室下曝光，以YAP或TEAD1與內(nèi)參β-actin條帶密度比值表示YAP或TEAD1相對(duì)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)　　果

2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)YAP、TEAD1在膀胱癌和癌旁組織中表達(dá)36例膀胱癌組織中YAP的陽(yáng)性率為83.3%(30/36)，棕黃色樣陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于胞核和胞質(zhì)，染色深；癌旁組織的陽(yáng)性率為13.9%(5/36)，染色淺，表達(dá)多為胞質(zhì)內(nèi)，YAP在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TEAD1的陽(yáng)性表達(dá)率為63.9%(23/36)，主要位于胞核，染色明顯且深，癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率為13.9%(3/36)，染色較淺，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

A:YAP在膀胱癌組織的表達(dá)；B：YAP在癌旁組織的表達(dá);C:TEAD1在膀胱癌組織的表達(dá)；D:TEAD1在癌旁組織的表達(dá)。

圖1免疫組織化學(xué)檢測(cè)YAP、TEAD1在膀胱癌和癌旁組織中表達(dá)(×400)

A：對(duì)照組;B：CCM組;C：HCPT組;D：聯(lián)合用藥組。

圖2　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率細(xì)胞凋亡率：對(duì)照組(3.82±0.11)%，CCM組(12.18±0.33)%，HCPT組(10.83±0.14)%，聯(lián)合用藥組(37.25±1.88)%。各組細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組顯著高于其他組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3RT-PCR檢測(cè)YAP、TEAD1 mRNA表達(dá)水平CCM組、HCPT組及聯(lián)合用藥組中YAP、TEAD1 mRNA表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組中YAP、TEAD1 mRNA表達(dá)顯著低于CCM組、HCPT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、4。

1：對(duì)照組；2：CCM組；3；HCPT組；4：聯(lián)合用藥組。

圖3各組YAP mRNA表達(dá)變化

2.4Western blot檢測(cè)YAP、TEAD1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比，其余3組YAP和TEAD1蛋白表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組比單獨(dú)用藥組下降更明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

1：對(duì)照組；2：CCM組；3；HCPT組；4：聯(lián)合用藥組。

圖4各組TEAD1 mRNA表達(dá)變化

圖5　　各組YAP、TEAD1蛋白表達(dá)變化

3　討　　論

膀胱癌發(fā)病率位居泌尿系惡性腫瘤首位，其發(fā)生的具體機(jī)制不明。Hippo信號(hào)通路可能參與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。Li等[8]用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)YAP在膀胱癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，不同病例表達(dá)強(qiáng)度也不同，陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)86.8%，在癌組織及正常組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示YAP在移行上皮細(xì)胞腫瘤中發(fā)揮致癌作用。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)YAP和TEAD1在膀胱癌及癌旁組織中分別為高表達(dá)和低表達(dá)，說(shuō)明YAP和TEAD1在膀胱癌中具有腫瘤特異性,其可能參與了膀胱癌細(xì)胞的增殖調(diào)控作用。

目前膀胱癌主要治療方法仍依靠手術(shù)切除，對(duì)于保留膀胱的患者，術(shù)后灌注化療是一種可預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的有效、可靠手段[9]。臨床上，CCM治療腫瘤主要通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)，這在以前有類(lèi)似報(bào)道。Chauhan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期食用姜黃的地區(qū)，其大腸癌及尿路上皮細(xì)胞癌的患病率顯著低于其他地區(qū)。HCPT是發(fā)現(xiàn)的喜樹(shù)堿衍生物，具有抗癌活性高、毒性低等價(jià)值，是臨床上用于膀胱癌化療的重要藥物。羥基喜樹(shù)堿影響生物體內(nèi)TopⅠ的活性能力，此酶在調(diào)節(jié)超螺旋、連鎖、去連鎖等一系列包括核酸解節(jié)作用方面發(fā)揮作用，作用于DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，引起相關(guān)細(xì)胞走向死亡。凋亡與基因的激活、表達(dá)和調(diào)控等有關(guān)，所以說(shuō)是生物清除危害機(jī)體細(xì)胞的主要手段，在生物發(fā)育成長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)成熟、穩(wěn)定組織及衰老中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。中藥是目前研究腫瘤機(jī)制及治療的熱點(diǎn)，開(kāi)發(fā)抑制增殖、促腫瘤細(xì)胞凋亡的中藥是未來(lái)研究方向。研究表明，化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這一抗癌機(jī)制將會(huì)被認(rèn)為是控制癌癥生長(zhǎng)及增殖的最佳途徑[12-13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCM和HCPT誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為膀胱癌的聯(lián)合用藥方案提供了可行性實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單藥組及聯(lián)合用藥組均可誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細(xì)胞凋亡，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著高于單藥組(P<0.05)，說(shuō)明CCM和HCPT聯(lián)合用藥方案對(duì)膀胱癌可產(chǎn)生更好的療效。在RT-PCR與Western blot檢測(cè)中觀察到單藥組和聯(lián)合用藥組，YAP、TEAD1表達(dá)量均下降明顯(P<0.05)。CCM和HCPT都干擾了YAP、TEAD1的表達(dá)，而聯(lián)合用藥作用更明顯。其機(jī)制可能為藥物通過(guò)作用癌基因YAP，進(jìn)而干擾下調(diào)TEAD1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，Hippo信號(hào)通路中YAP和TEAD1表達(dá)與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能成為腫瘤新的生物標(biāo)志物之一，為膀胱癌基因靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，指明新的方向。CCM和HCPT均能誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細(xì)胞凋亡，兩藥聯(lián)用具有疊加效應(yīng)，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制YAP進(jìn)而阻斷TEAD1的表達(dá)來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。至于CCM和HCPT如何抑制Hippo信號(hào)通路核心因子YAP，以及對(duì)下游產(chǎn)生連鎖的一系列影響，從而誘導(dǎo)膀胱癌凋亡，以后將進(jìn)一步去深究證實(shí)。

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Effects of curcumin combined with hydroxycamptothecin on the expression of YAP，TEAD1 gene and biological function in human bladder cancer cell line BIU-87*

HeJiang1,CaoJianjia2,ChenKehong2,WangDelin2△,ShengXia2,LiWenbin2,HuangLiangliang2

(1.GastroenterologyandNeurologyCenter,University-TownHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China;2.DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo investigate the expression of curcumin (CCM) combined with hydroxycamptothecin (HCPT) on YAP，TEAD1 and apoptosis in human bladder cancer cell line BIU-87.MethodsCCM and HCPT were separately treatment and combined treatment of bladder cancer BIU-87 cells.Immunohistochemical(IHC) method was used to detect expression of YAP and TEAD1 in bladder cancer and tissue adjacent to carcinoma;Apoptosis rate of the human bladder cancer cell BIU-87 was detected by flow cytometry(FCM) instruments after CCM and HCPT were administered alone or in combination;Detection of YAP,TEAD1 gene mRNA and protein expression changes was depended on RT-PCR and Western blot.ResultsThe results showed that YAP and TEAD1 had positive expressions in bladder cancer and tissue adjacent to carcinoma (P<0.05)，the difference had obvious significance.The results of detection by FCM showed that CCM and HCPT both induced apoptosis of bladder cancer cell BIU-87 effectively.The mRNA and protein expression of YAP and TEAD1 in human bladder cancer cell BIU-8 significantly reduced in both CCM group and HCPT group,and mRNA and protein expression of YAP and TEAD1 was lower in the combination group(P<0.05).ConclusionCCM and HCPT combination anti-cancer mechanism may be through inhibiting the Hippo signaling pathway in YAP cancer gene expression,cut TEAD1,and induce bladder cancer cell apoptosis.

curcumin；urinary bladder neoplasms；hydroxycamptothecinm；YAP；TEAD1

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972999)。

何江(1974-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事泌尿系腫瘤基礎(chǔ)和臨床方面的研究。

，E-mail：dlwangws@sina.com。

R737.14

A

1671-8348(2016)25-3462-04

2016-03-20

2016-06-08)