畢學(xué)成　劉久敏　馮自衛(wèi)　吳永定

1　廣東省人民醫(yī)院泌尿外科(廣州 510080)2　廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(廣州 510180)

Bi Xuecheng, Liu Jiumin, Feng Ziwei.

Department of Urology, Guangdong General Hospital, Guangzhou 510080, China

Wu Yongding.

School of Public Health, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China

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·論著·

miR-221在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對增殖的影響

畢學(xué)成1劉久敏1馮自衛(wèi)1吳永定2

1廣東省人民醫(yī)院泌尿外科(廣州 510080)2廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(廣州 510180)

目的研究前列腺癌細(xì)胞中miR-221的表達(dá)情況及其對癌細(xì)胞增殖的影響。方法運用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-221在前列腺正常細(xì)胞株與前列腺癌細(xì)胞株中表達(dá)的差異情況，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-221過表達(dá)LNCaP和DU145細(xì)胞株，再通過CCK8細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖情況的變化。結(jié)果qRT-PCR檢測細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)miR-221在PC3、LNCaP和DU145三種前列腺癌細(xì)胞株中表達(dá)量均比前列腺正常細(xì)胞株P(guān)rEC低 (F=254.197，P<0.001)，其中兩兩比較差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建的miR-221過表達(dá)LNCaP和DU145細(xì)胞株，經(jīng)qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-221在LNCaP和DU145細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯升高(LNCaP,倍數(shù)變化=2.24,t=3.46,P<0.01；Du145,倍數(shù)變化=2.24,t=4.29,P<0.01)。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)了miR-221的LNCaP(P<0.001)和DU145(P<0.001)細(xì)胞生長速度慢于對照組。結(jié)論實驗證明miR-221表達(dá)過度能減慢前列腺癌細(xì)胞的增殖，miR-221有可能成為前列腺腫瘤治療的生物學(xué)標(biāo)志物。

前列腺癌miR-221細(xì)胞增殖

BiXuecheng,LiuJiumin,FengZiwei.

DepartmentofUrology,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China

WuYongding.

SchoolofPublicHealth,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是歐美國家最重要的男性惡性腫瘤之一，在亞洲地區(qū)發(fā)病率僅次于肺癌，且近20年來發(fā)病率不斷呈現(xiàn)上升趨勢，是男性癌死亡的主要原因之一[1]。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與環(huán)境的刺激和基因的變異有密切關(guān)聯(lián)[2]。從現(xiàn)代分子生物學(xué)水平出發(fā)，尋找與前列腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性更密切的標(biāo)記物，并應(yīng)用于臨床實踐的指導(dǎo)，是一項對臨床和社會都有重大意義的任務(wù)。目前臨床上對前列腺癌的篩查或早期診斷，主要通過血清前列腺特異性抗原(PSA)水平。但是PSA作為早期診斷的標(biāo)記物，仍缺乏最佳的敏感性和特異性。所以尋找新的前列腺癌分子診斷標(biāo)記物來輔助或最終替代PSA作為前列腺癌的早期診斷標(biāo)記，一直是腫瘤研究的熱點[3]。

Brio等運用基因芯片及Northern blot等實驗方法, 檢測到乳腺癌組織中miR-221低表達(dá)[4]，Gu Y等通過生物信息學(xué)分析得出miR-221在前列腺癌中低表達(dá)[5]。人們推測miRNA表達(dá)改變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān), 它們常常定位于腫瘤相關(guān)區(qū)域, 可能同時具有癌基因和抑癌基因的雙重作用。當(dāng)miRNA過度表達(dá)時, 抑制了抑癌基因的表達(dá)；而miRNA表達(dá)過少或缺失時，則不能有效地抑制癌基因。

進(jìn)一步深入研究和探索介導(dǎo)前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，正確判斷前列腺癌的惡性程度及預(yù)后，為前列腺癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)，是泌尿外科疾病研究的熱點問題。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株與實驗動物3種前列腺癌細(xì)胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年從美國馬納薩斯(Manassas, VA, USA)的American Type Culture Collection (ATCC)購買得到，而良性的前列腺上皮細(xì)胞系PREC是從Lonza公司購買，從公司購買的細(xì)胞株均由公司負(fù)責(zé)鑒定和包裝，并在細(xì)胞復(fù)蘇3個月內(nèi)送到實驗室。所有細(xì)胞株均在10% FBS、5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑全部購于Gibco公司，核酸蛋白提取試劑盒以及PCR試劑盒全部購于TaKaRa公司，F(xiàn)uGENE轉(zhuǎn)染試劑購于Promega公司，全部引物購于廣州復(fù)能基因有限公司(貨號：miR-221：HmiRQP0337，內(nèi)參U6：HmiRQP9001)，CCK8試劑購置碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1SYBR GreenⅠ染料法實時定量熒光PCR(qRT-PCR)使用PC3、DU145、LNCaP及PREC細(xì)胞株mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因，檢測并驗證miR-221在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。

反應(yīng)體系20 μl：

cDNA2 μl

Primer Mix0.8/0.8 μl

SYBR GreenⅠMaster Mix10 μl

超純水6.4 μl

反應(yīng)條件：

在55℃ 時收集熒光信號

利用Livak(2-△△Ct)法進(jìn)行目的基因的定量分析：

用內(nèi)參基因的Ct值目的基因的Ct值進(jìn)行歸一化處理：

△Ct前列腺=Ct(前列腺，目標(biāo)基因)-Ct(前列腺，內(nèi)參基因)

△Ct對照組= Ct(對照組，目標(biāo)基因)-Ct(對照組，內(nèi)參基因)

對照組樣品的△Ct值歸一前列腺癌細(xì)胞的△Ct值：

△△Ct = △Ct前列腺-△Ct對照組

計算相對表達(dá)水平：

2-△△Ct=表達(dá)量的比值(相對表達(dá)量)

1.2.2細(xì)胞株構(gòu)建miR-221過表達(dá)與重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建(由復(fù)能基因公司完成)；將重組表達(dá)質(zhì)粒在293T細(xì)胞株中利用HIV慢病毒包裝系統(tǒng)包裝病毒顆粒，再收集病毒顆粒感染目的細(xì)胞，最后進(jìn)行流式分選，篩選出帶綠色熒光的陽性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并通過qRT-PCR驗證。

1.2.2.1重組表達(dá)質(zhì)粒病毒包裝用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)293TN細(xì)胞(10 cm plate)18～24 h，細(xì)胞密度達(dá)到60%后轉(zhuǎn)染。加0.8 mL的DMEM(無血清)到已高壓滅菌的EP管。加20 μl pPACKH1 and 2 μg的慢病毒載體到DMEM，混勻。加24 μl PureFection到EP管，Vortex 10 secs。DMEM-Plasmid-PureFection室溫孵育15min。DMEM-Plasmid-PureFection 滴入培養(yǎng)皿里，混勻。放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48～72 h后，收集培養(yǎng)基(含病毒顆粒)到50 mL的離心管，室溫離心3000 g 15 mins。取病毒上清到新的管子里。每1體積的5×PEG-it加4體積的有慢病毒載體的上清，4℃過夜。1500 g 4℃離心5 min，收集沉淀。用預(yù)冷的PBS溶解病毒液，按上清的1/100溶解，放-80℃冰箱保存。

1.2.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染加4 μl 1×TransDux，慢病毒溶液40 μl到新鮮培養(yǎng)基(800 μl)中轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞(6孔板)。第二天再補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基到6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。進(jìn)行流式分選，篩選出帶綠色熒光的陽性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞增殖實驗細(xì)胞消化后，用培養(yǎng)液充分打勻后配成單個細(xì)胞的懸液，接種細(xì)胞到96孔板，每孔1000～10000個/200 μl。分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，加CCK8溶液20 μl置每個孔中。再繼續(xù)孵育4小時后終止培養(yǎng)，充分離心后吸掉孔內(nèi)上清液。選擇490 nm的波長，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔光吸收值(OD值)，并記錄結(jié)果，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以吸光值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長曲線。

2　結(jié)　果

2.1miR-221在各種前列腺細(xì)胞株中的基因表達(dá)情況實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測人類前列腺癌細(xì)胞株LNCap、DU145、PC3和人類正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC中miR-221的表達(dá)情況，結(jié)果顯示相對PrEC,在LNCap、DU145和PC3三種前列腺癌細(xì)胞株中均有表達(dá)量減少(F=198.742，P<0.001)，其中在LNCaP細(xì)胞中表達(dá)水平最低(見圖1)。

圖1　miR-221在前列腺癌細(xì)胞株的表達(dá)量減少

2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞株構(gòu)建情況qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后目標(biāo)細(xì)胞株miR-221的表達(dá)情況，經(jīng)方差分析，過表達(dá)細(xì)胞株中miR-221的表達(dá)水平高于對照組(LNCaP,倍數(shù)變化=2.24,t=3.46,P<0.01；Du145,倍數(shù)變化=2.24,t=4.29,P<0.01,見圖2)，過表達(dá)組與野生型的差異也都有統(tǒng)計學(xué)意義，可以用于下一步的功能研究。

2.3miR-221對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響運用細(xì)胞增殖實驗CCK8進(jìn)一步探討miR-221表達(dá)與前列腺癌增殖的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-221過表達(dá)的LNCaP(P<0.01)和DU145(P<0.01)細(xì)胞在24 h、48 h和72 h生長速度慢于對照組(見圖3)。這結(jié)果表明，NEK2可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。

圖2　轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞中miR-221的表達(dá)情況

圖3　LNCap細(xì)胞在24 h,48 h,72 h的增殖(左)DU145細(xì)胞在24 h,48 h,72 h的增殖(右)

3　討　論

近年來由于環(huán)境、生活習(xí)慣等因素影響，國內(nèi)發(fā)病逐漸上升，但是對于前列腺癌癥的發(fā)生和擴(kuò)散機(jī)制，以及對于前列腺癌這種惡性腫瘤的治療、診斷尚缺少較為有效的方式，PSA作為診斷指標(biāo)也存在一定局限性。實現(xiàn)腫瘤的早期珍斷，以及闡明前列腺癌的相關(guān)發(fā)病以及調(diào)節(jié)機(jī)制，對于尋找能夠遏制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展藥物以及分子靶標(biāo)，成為泌尿外科疾病研究的熱點問題。

自Tomlins等[6]利用異常癌基因表達(dá)譜分析 (cancer outlier profile analysis,COPA) 技術(shù)發(fā)現(xiàn)前列腺癌中TMPRSS2-ERG融合基因的存在以來，現(xiàn)已基本明確近50%的前列腺癌中存在TMPRSS2-ERG基因融合。在增生和PIN中亦有不同程度的TMPRSS2-ERG融合存在，TMPRSS2-ERG有望成為主要的前列腺癌早期發(fā)現(xiàn)和診斷的指標(biāo)。研究表明TMPRSS2-ERG在腫瘤的早期發(fā)生中起作用，在很多腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的血管生成、轉(zhuǎn)移、程潤、抑制調(diào)亡有關(guān)，ERG基因在前列腺癌中主要受TMPRSS2-ERG融臺基因的調(diào)節(jié)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。另一方面，有報道表明，在TMPRSS2-ERG的前列腺癌樣本中miR221下調(diào)表達(dá)。而大量的前列腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)TMRRSS2-ERG融合基因轉(zhuǎn)錄的同時，伴隨著miR-221表達(dá)的下調(diào)[7]。這一發(fā)現(xiàn)給我們提供了一條前列腺癌研究的新線索--表達(dá)下調(diào)的miR-221與高表達(dá)的TMPRSS2-ERG融合基因之間是否存在某種聯(lián)系，而這種聯(lián)系使miR-221出現(xiàn)低表達(dá)，這對前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、增殖以及治療療效、預(yù)后轉(zhuǎn)歸有何影響？

miRNA是一組保守的非編碼小RNA (non-coding small RNA) ,長約22nt 的非編碼的單鏈RNA分子， 廣泛分布在病毒、植物到高等哺乳動物中[8]， 大約相當(dāng)于每種生物體蛋白編碼基因的1%[9]。目前, miRNA 已知的功能是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá), 主要作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，即通過抑制靶基因的翻譯而起調(diào)控作用[10]。因此本研究從miR-221入手，探索miR-221在前列腺癌中下調(diào)表達(dá)的證據(jù)及其對細(xì)胞增殖的抑制作用。

但是腫瘤的發(fā)生是個復(fù)雜的過程，還需要做大量的工作才能更好的理解miR-22在腫瘤的發(fā)生中所起的作用，后期研究我們將結(jié)合TMPRSS2-ERG融合基因，探討miR-221抑制前列腺腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為前列腺癌從TMPRSS2-ERG融合基因調(diào)控層次上以miR-221為切入點的治療提供新的作用靶點及科學(xué)依據(jù)。

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Effect of miR-221 expression on proliferation in prostate cancer cells

ObjectiveTo investigate miR-221 expression in prostate cancer cells and its influence on prostate cancer cell proliferation.MethodsmiR-221 expressions in prostate normal cell lines and cancer cell lines were measured by qRT-PCR. Overexpression of the miR-221 in LNCaP and DU145 cell lines used by cell transfection. Effects of the depletion on cell proliferation were assessed in vitro with CCK8.ResultsqRT-PCR showed miR-221 was lower expressed in PC3, LNCaP and DU145 than in PrEC(F=254.197,P<0.001), in which pairwise comparison also had significant differences. qRT-PCR showed miR-221 expression rose significantly in LNCaP and DU145 cell lines whose miR-221 was overexpression with cell transfection(LNCaP, Fold Change=2.24,t=3.46,P<0.001；Du145, Fold Change=2.24,t=4.29,P<0.001). Cell proliferation assay showed that growth of LNCaP(P<0.001) and DU145(P<0.001) cells whose miR-221 was overexpression was slower than the control group.ConclusionThis study demonstrates miR-221 overexpression can inhibited the proliferation of prostate cancer cells for the first time, it also suggests that miR-221 has the potential to serve as a biomarker for PCa therapy.

Prostate cancer; miR-221; Cell proliferation

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項目(A2014016)

畢學(xué)成，E-mail：doctorbi1975@163.com

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.05.001

2016- 04- 05)