霍一林, 石　瑩, 王秦玥, 李蘿園, 于龍江,王　鵬, 張建平, 王征宇

(1. 中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系, 北京 100872;2. 茨城大學(xué)理學(xué)部, 水戶市 310-8512, 日本;3. 岡山大學(xué)自然科學(xué)學(xué)院, 岡山市700-8530, 日本)

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Thermochromatiumtepidum外周捕光天線蛋白LH2在脂質(zhì)體及表面活性劑膠束中的光譜性質(zhì)

霍一林1, 石瑩1, 王秦玥1, 李蘿園1, 于龍江2,3,王鵬1, 張建平1, 王征宇2

(1. 中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系, 北京 100872;2. 茨城大學(xué)理學(xué)部, 水戶市 310-8512, 日本;3. 岡山大學(xué)自然科學(xué)學(xué)院, 岡山市700-8530, 日本)

采用動(dòng)態(tài)光散射、 透射電子顯微鏡、 紫外-可見(jiàn)吸收光譜和拉曼光譜對(duì)比研究了處于表面活性劑膠束和脂質(zhì)體磷脂雙分子層中的Thermochromatium(Tch.)tepidumLH2的光譜響應(yīng). 結(jié)果表明, 與在表面活性劑膠束中相比, 雙分子層脂膜中LH2的Spirilloxanthin(一種含有13個(gè)共軛雙鍵的類胡蘿卜素)構(gòu)象有明顯差異; 表面活性劑及磷脂分子端基的荷電狀態(tài)對(duì)B850-Qy吸收譜有顯著影響; Ca2+結(jié)合導(dǎo)致B850 Qy吸收譜帶紅移和增色, 而H+結(jié)合則使該吸收譜帶藍(lán)移和減色. 對(duì)LH2脫輔基蛋白氨基酸序列的分析結(jié)果表明, Ca2+和H+的結(jié)合位點(diǎn)可能位于α脫輔基蛋白的C-端一側(cè). B850 Qy吸收譜帶對(duì)Ca2+和H+的響應(yīng)特性可能與Tch.tepidum適應(yīng)其生存環(huán)境的能力有關(guān).

Thermochromatiumtepidum; 外周捕光天線LH2; 表面活性劑; 脂質(zhì)體

紫色光合細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上存在3種跨膜色素-蛋白復(fù)合物:外周捕光天線LH2、 核心天線LH1及包裹在LH1內(nèi)部的光合反應(yīng)中心RC(后兩者共同構(gòu)成核心復(fù)合物L(fēng)H1-RC). 它們和細(xì)胞質(zhì)膜形成的二維陣列超分子結(jié)構(gòu)是太陽(yáng)光能高效吸收、 傳遞、 電荷分離及隨后的環(huán)狀電子轉(zhuǎn)移發(fā)生的基礎(chǔ), 并最終由此形成跨膜電化學(xué)質(zhì)子梯度, 腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的合成[1].

根據(jù)已知原子分辨率晶體結(jié)構(gòu), 外周捕光天線蛋白LH2具有高度對(duì)稱的環(huán)形結(jié)構(gòu), 由8(或9)對(duì)跨膜脫輔基蛋白螺旋亞基αβ組成, 每對(duì)αβ亞基中包含3個(gè)葉綠素(根據(jù)其Qy吸收帶位置分別定義為B800和B850)和一個(gè)類胡蘿卜素[2,3].Thermochromatium(Tch.)tepidum是一種中等嗜熱紫色硫細(xì)菌, 其LH2的脫輔基蛋白αβ亞基組成復(fù)雜, 多種共軛長(zhǎng)度類胡蘿卜素共存[4], B800吸收帶裂分[5], 而該蛋白復(fù)合物的原子分辨率結(jié)構(gòu)至今未知. 其LH2的B850電子吸收表現(xiàn)出對(duì)表面活性劑種類和濃度[6]、 二價(jià)金屬離子[4]及溫度[7]等環(huán)境因素變化敏感的特征, 可以作為一種潛在的光譜探針; 其光合膜核心復(fù)合物L(fēng)H1-RC的光譜特征[8～10]、 激發(fā)態(tài)動(dòng)力學(xué)[11]、 特別是高分辨晶體結(jié)構(gòu)[12]的解析也將為L(zhǎng)H2的相關(guān)研究提供重要參考.

對(duì)膜蛋白體外性質(zhì)研究通常在天然膜體系(如光合膜碎片Chromatophore)、 表面活性劑的膠束溶液及由磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體(人工膜脂質(zhì)體)中進(jìn)行, 其中脂質(zhì)體因可以模擬天然膜的二維陣列結(jié)構(gòu)而被廣泛使用[13～16]. 本文采用不同光譜技術(shù)對(duì)比了Tch.tepidumLH2在磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體中及2種表面活性劑[十二烷基麥芽糖苷(DDM)和十二烷基二甲基氧化胺(LDAO)]膠束溶液中的性質(zhì), 考察了Ca2+和H+離子對(duì)該蛋白復(fù)合物B850吸收的影響, 并討論了表面活性劑(或磷脂)種類、 鈣離子和質(zhì)子對(duì)該光合膜蛋白光譜性質(zhì)影響的結(jié)構(gòu)機(jī)制.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

三(羥甲基)氨基甲烷(純度99%), 美國(guó)NOVON公司; 鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%, 分析純), 北京化工廠; LDAO(30%水溶液), 日本Kao公司; DDM(純度99%), 美國(guó)Acros Organics公司; 大豆卵磷脂[磷脂酰膽堿(PC)含量為14%～23%], 日本W(wǎng)ako公司; 無(wú)水氯化鈣(CaCl2, 分析純), 北京市通廣精細(xì)化工公司; DEAE-纖維素(Whatman DE52)離子交換柱和透析袋(MWCO:3500), 上海百賽生物技術(shù)有限公司.

JEOL1230R透射電子顯微鏡(TEM, 日本JEOL公司); Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀(英國(guó)Malvern公司), Cary 50紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(美國(guó)Varian公司), Xplora Plus顯微共聚焦拉曼光譜儀(日本Horiba公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1LH2的制備和純化將紫色硫細(xì)菌Tch.tepidum在48 ℃、 無(wú)氧條件下光照(光照強(qiáng)度2000 lx)培養(yǎng)7 d, 離心后將菌體細(xì)胞在4 ℃下用超聲法破碎, 超高速離心得到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜碎片(又稱載色體), 用勻漿法均勻懸浮于20 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)中, 制備成OD850 nm=50 cm-1的樣品懸浮液, 再用0.35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的表面活性劑LDAO在黑暗中溶解60 min, 離心(145400g, 4 ℃, 100 min), 得到的上層清液為粗制的LH2, 再用DEAE-纖維素(Whatman DE52)離子交換柱進(jìn)行純化分離, 洗脫液為含0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DDM的不同濃度CaCl2溶液.

1.2.2LH2不同表面活性劑膠束溶液及與脂質(zhì)體組裝體系的制備將濃縮的LH2樣品分別用含有0.1% LDAO的20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8)和含有0.05%DDM的20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8)溶解、 稀釋, 制得不同表面活性劑膠束溶液樣品.

LH2-lipsome體系的制備:配制1 mg/mL的大豆卵磷脂的氯仿溶液, 除氧, 保存于-20 ℃冰箱中. 取3 mL 卵磷脂氯仿溶液于微量離心管中, 用N2氣吹干, 向其中依次加入100 μL 30% LDAO和2.4 mL 20 mmol/L的Tris-HCl 緩沖溶液(pH=8.0), 超聲使樣品完全溶解后, 加入500 μL LH2(OD798 nm=22.8 cm-1)溶液, 將所有樣品混合均勻后轉(zhuǎn)移到透析袋中, 透析液為20 mmol/L的Tris-HCl 緩沖溶液(pH=8.0), 在黑暗中于4 ℃下進(jìn)行3次透析(時(shí)間依次為2, 2和19 h), 透析后的樣品用孔隙為0.22 mm的過(guò)濾器反復(fù)過(guò)濾10次, 得到LH2-liposome. 制備帶鈣離子的樣品時(shí), 向透析液中加入200 mmol/L的CaCl2.

1.2.3LH2-liposome的尺寸和形貌表征將LH2-liposome或LH2表面活性劑的膠束溶液滴加在負(fù)載有多孔碳膜的銅網(wǎng)上, 再用1%的醋酸鈾進(jìn)行染色, 用濾紙將液體吸干, 進(jìn)行TEM觀測(cè), 工作電壓為100 kV.

動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定:將樣品放入厚度為1 cm的塑料樣品池中, 進(jìn)行多次掃描, 取平均值.

1.2.4LH2在不同體系中的電子態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定LH2在各種體系中的電子態(tài)結(jié)構(gòu)通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜表征:1 cm光程石英樣品池, 掃描范圍為300～1000 nm, 所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行. 鈣離子和不同表面活性劑溶液的配制方法如上所述, 低pH值(pH=3)樣品的制備是在攪拌下向樣品中滴加3 mol/L的鹽酸溶液, 直至pH=3, 用pH計(jì)監(jiān)測(cè).

1.2.5LH2在不同體系中的類胡蘿卜素構(gòu)象將LH2的不同體系樣品裝入樣品池中, 使用Xplora Plus顯微共聚焦拉曼光譜儀測(cè)定拉曼信號(hào), 激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm.

2　結(jié)果與討論

2.1LH2-liposome和LH2-表面活性劑膠束的形貌與粒徑

Fig.1　Absorption of LH2 from Tch. tepidum in various environments at pH=8a. in DMM; b. in LDAO; c. in liposome. The arrow shows the absorption of spirilloxanthin.

實(shí)驗(yàn)中所用的表面活性劑(DDM, LDAO)濃度接近可以充分溶解色素-蛋白復(fù)合物的最低濃度, LH2-liposome組裝體呈顏色均一、 透明的穩(wěn)定膠體溶液. 圖1給出LH2生理pH值(pH=8)下在3種體系中的穩(wěn)態(tài)吸收光譜. 可見(jiàn), 經(jīng)過(guò)散射背景的基線扣除和在類胡蘿卜素吸收最大值處(500 nm)歸一化, 3種體系吸收光譜的類胡蘿卜素S2←S0吸收(400～550 nm)、 葉綠素的Soret帶、 Qx帶及B800葉綠素的Qy帶基本重合, 說(shuō)明相關(guān)色素電子態(tài)能級(jí)結(jié)構(gòu)不受表面活性劑膠束或磷脂雙層超分子結(jié)構(gòu)影響; 而3種體系中B850葉綠素的Qy帶吸收則顯著不同:相比在脂質(zhì)體中, 在DDM膠束中B850的Qy帶吸收顯著增強(qiáng), 同時(shí)紅移5 nm, 而在LDAO中則稍微減色并發(fā)生5 nm藍(lán)移. 這一結(jié)果說(shuō)明表面活性劑膠束(或磷脂脂質(zhì)體)的超分子結(jié)構(gòu)影響到B850葉綠素聚集體的電子態(tài)結(jié)構(gòu), 從而使其吸收光譜發(fā)生變化.

Fig.2　TEM images of LH2 from Tch. tepidum in liposome(A), DDM(B) and LDAO(C)The samples were negatively stained with 1% uranium acetate.

Fig.3　DLS data of the LH2 from Tch. tepidum in various detergents micelles or liposome systemsa. in DMM(106 nm/565 nm); b. in LDAO(14 nm/257 nm); c. in liposome(73 nm). The data in the corresponding parentheses are the Rh of the vesicles for each system.

圖2(A)為L(zhǎng)H2-liposome的TEM照片. 可見(jiàn), LH2-liposome組裝體呈球形, 尺寸大約在60～80 nm之間, 與天然的光合膜碎片載色體的尺寸相同[17]. 由圖2(A)可見(jiàn)許多殘破的組裝體碎片, 這是因?yàn)門(mén)EM樣品室的高真空使許多脂質(zhì)體破裂所致. LH2在2種表面活性劑膠束中的TEM照片表現(xiàn)出平展的膜片或者萎縮坍塌的結(jié)構(gòu)[圖2(B), (C)], 可能是因?yàn)槟z束結(jié)構(gòu)不夠堅(jiān)固, 在TEM測(cè)量的高真空條件下無(wú)法穩(wěn)定存在所致. 圖3為采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)測(cè)定的3種體系中膠體半徑(Rh)的尺寸分布. 可見(jiàn), LH2-liposome的主要粒徑約為70 nm, 這與TEM觀測(cè)到的結(jié)果一致, 粒徑分布最集中, 顆粒分布系數(shù)(PDI)為0.20; 0.05%DDM的膠束溶液主要形成尺寸約100 nm的膠束, 還會(huì)形成少量尺寸約560 nm的大膠束, PDI為0.45; 0.1%的LDAO溶液主要形成尺寸約260 nm的膠束和少量尺寸約14 nm小膠束, PDI為0.64. 結(jié)果表明, LH2-liposome的結(jié)構(gòu)比較均一和緊湊, 表面活性劑形成的膠束結(jié)構(gòu)則較松散, 尺寸更隨機(jī); 從膠束大小到粒徑分布系數(shù)上看, DDM形成的膠束比LDAO更接近于大豆磷脂形成的脂質(zhì)體LH2-liposome.

2.2膠束或脂質(zhì)體超分子結(jié)構(gòu)對(duì)LH2中類胡蘿卜素構(gòu)象的影響

Fig.4　Resonance Raman spectra of LH2 from Tch. tepidum in various environments under the excitation at 532 nma. in DDM; b. in LDAO; c. in liposome.

2.3鈣離子和pH值對(duì)LH2在不同體系中B850 Qy吸收帶的影響

Tch.tepidum在自然界的生存環(huán)境中有大量鈣離子存在, 研究發(fā)現(xiàn), 其核心天線LH1的α,β脫輔基蛋白的C-端存在鈣離子結(jié)合位點(diǎn)[12], 與鈣離子結(jié)合導(dǎo)致LH1的Qy吸收帶相對(duì)其它嗜溫菌種紅移約30 nm, 并顯著提高色素-蛋白復(fù)合物的熱穩(wěn)定性[9]. Sekine等[4]發(fā)現(xiàn), 二價(jià)堿土金屬離子普遍能使該物種LH2的B850 Qy吸收帶發(fā)生增色和紅移, 而結(jié)構(gòu)機(jī)制未知. 此外, 發(fā)生在光合膜中的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致光合膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度, 成為驅(qū)動(dòng)ATP酶工作的動(dòng)力[1]; 而高等植物的外周捕光天線中, 存在pH誘導(dǎo)的非光化學(xué)葉綠素?zé)晒忖鐧C(jī)制[21]. 本文主要研究質(zhì)子(低pH值下)和鈣離子在3種體系中對(duì)LH2的B850影響的結(jié)構(gòu)機(jī)制.

圖5為T(mén)ch.tepidumLH2在不同膠束或脂質(zhì)體體系中、 不同pH值和鈣離子濃度下的Qy吸收光譜, 所有光譜均在797 nm處歸一化. 圖5光譜特征的定量分析結(jié)果見(jiàn)表1. 相比于其它常見(jiàn)的嗜溫菌種[Rhodobacter(Rba.)sphaeroides],Tch.tepidumLH2的B800 Qy吸收具有顯著不同的特征(如圖5所示), 具體表現(xiàn)為光譜峰顯著展寬并在低溫下可裂分成2個(gè)獨(dú)立光譜組分[對(duì)應(yīng)圖5(A)中箭頭所示處][5]. 這一現(xiàn)象在Tch.tepidum的類似物種Allochromatium(Alc.)vinosum的LH2中也存在, 但其確切結(jié)構(gòu)機(jī)制未知[22]. 雖然3種體系中B800 Qy吸收形狀有所不同(如圖5所示), 但其相對(duì)強(qiáng)度受環(huán)境變化影響很小(如圖1所示), 因此以下著重討論B850 Qy吸收的變化.

Fig.5　Qy absorption comparison of LH2 from Tch. tepidum in 0.05% DDM(a), 0.1% LDAO(b) and PC(c) liposome, under pH=8(A, C) and 3(B, D), and without Ca2+(A, B) or with 200 mmol/L Ca2+(C, D)(all the spectra are normalized at 797 nm), respectivelyArrows in (A) show the splitting peaks position of B800.

根據(jù)已知的高分辨晶體結(jié)構(gòu), 在LH2的每對(duì)αβ蛋白上, 通過(guò)每個(gè)脫輔基蛋白上固定位置Histidine的側(cè)鏈與葉綠素中心鎂離子的配位作用, 可以結(jié)合一對(duì)與細(xì)胞質(zhì)膜平面垂直的細(xì)菌葉綠素分子, 它們共同構(gòu)成了吸收在850 nm處的葉綠素聚集體, 被稱為B850[2,3]. 相比B800,Tch.tepidum的B850 Qy吸收受環(huán)境因素影響很大, 本文用B850最大吸收位置(λmax, B850) 和B850與B800的吸收強(qiáng)度比值ODB850/ ODB800進(jìn)行對(duì)比分析. 此外, 在天然光合膜碎片中的相應(yīng)數(shù)據(jù)也列出以作對(duì)比(如表1所示, 相應(yīng)光譜數(shù)據(jù)見(jiàn)圖S1, 見(jiàn)本文支持信息).

由表1可見(jiàn), 當(dāng)沒(méi)有鈣離子存在且pH=8時(shí), 在DDM和天然光合膜碎片載色體中,λmax, B850約為855 nm, ODB850/ODB800均為1.41; 在liposome和LDAO中,λmax, B850則分別藍(lán)移5和10 nm, 而ODB850/ODB800約為1.0±0.05; 當(dāng)pH=3時(shí),λmax, B850的位置基本與pH=8下相應(yīng)體系中一致, 或有1～2 nm的微小藍(lán)移, ODB850/ODB800降低值在DDM, LDAO, Liposome和Chromatophore中依次為-0.13, -0.06, -0.04, -0.23, 即B850相對(duì)B800在低pH值下普遍減色.

Table 1　Qy absorption characteristics of LH2 from Tch. tepidum under various conditionsa

a. The data are summarized from Fig.4 and the relevant data in chromatophore are listed as reference;b. the spectra in chromatophore are shown in Fig.S1(see the supporting information of this paper).

由表1還可見(jiàn), 在200 mmoL/L Ca2+存在時(shí), pH=8下, B850相對(duì)于沒(méi)有鈣離子存在時(shí)普遍發(fā)生紅移和增色效應(yīng), 其中在LDAO和Liposome中λmax, B850分別紅移了9和4 nm, ODB850/ODB800值分別升高了在0.36和0.28; 在DDM中有2 nm的紅移和0.12的增色; 在Chromatophore中雖有4 nm紅移, 同時(shí)也有輕微減色(-0.03). pH=3時(shí), 相對(duì)于有鈣離子的pH=8條件下, 在LDAO和Liposome中B850均發(fā)生顯著藍(lán)移(分別為11和8 nm), 同時(shí), 在DDM, LDAO, Liposome和Chromatophore中減色效應(yīng)(ODB850/ODB800降低值)分別為-0.18, -0.30, -0.07和-0.06.

值得注意的是, 無(wú)論在任何pH值或者鈣離子條件下, 在DDM和Chromatophore中B850均比在LDAO和liposome中的紅移更大, 吸收能力更強(qiáng).

綜上可以得到如下結(jié)論:在對(duì)Tch.tepidumLH2 B850 Qy吸收影響方面, DDM形成的膠束和天然膜Chromatophore體系更相似, 而大豆磷脂形成的liposome和LDAO更相似; 鈣離子的存在有助于提高B850在近紅外(NIR)區(qū)的吸收能力(B850吸收紅移及增色); 較高的氫離子濃度(低pH值)會(huì)降低B850在NIR區(qū)的吸收能力(B850吸收藍(lán)移和減色).

2.4鈣離子、 pH值及表面活性劑對(duì)Tch.tepidumLH2 B850 Qy吸收影響的結(jié)構(gòu)機(jī)制

除掉Chromatophore中其它色素蛋白復(fù)合物(LH1-RC)的影響, 表面活性劑或磷脂分子的結(jié)構(gòu)是影響被其包裹的膜蛋白性質(zhì)的決定因素. 本文所用表面活性劑和磷脂分子的結(jié)構(gòu)如圖6(A)～(C)所示:LDAO是一種端基帶電荷的表面活性劑; DDM的端基為中性的二糖片段; 大豆卵磷脂是3種磷脂的混合物, 其中23%PC(磷脂酰膽堿)端基為帶電荷物種, 另外77%的PE(磷脂酰乙醇胺)和IP(磷脂酰肌醇)端基為中性極性官能團(tuán).Tch.tepidum的膜脂成分如圖6(D)所示, 3種主要成分PE, PG(磷脂酰甘油)和cardiolipin(雙磷脂酰甘油)的端基均為中性極性官能團(tuán). 由此可知, LDAO和大豆卵磷脂均含有帶電荷的極性端基官能團(tuán), 而DDM和chromatophore膜脂端基均為中性極性官能團(tuán), 這可能是造成它們對(duì)B850性質(zhì)影響不同的關(guān)鍵原因.

Fig.6　Molecular structure and components of detergents(A, B) or lipid(C), molecular structure and components of lipids of chromatophore from Tch. Tepidum(D) and the amino acid sequence of α-apoproteins of LH2 from Tch. Tepidum[4](E)R1—R4 are the aliphatic chain with various length and degree of unsaturation. The gray broken line indicates the B850 bacteriochlorophyll binding histidine, and the red broken line indicates the possible binding points for calcium ion or proton.

基因定點(diǎn)突變[23,24]和激光共振拉曼[25]等系列研究結(jié)果表明, 在影響B(tài)850 Qy吸收的諸多因素中[1], 細(xì)菌葉綠素C3位乙?；聂驶cα-脫輔基蛋白上第44位和45位氨基酸(對(duì)于Rps.acidophila分別為酪氨酸和色氨酸)殘基側(cè)鏈之間的氫鍵是決定其850 nm吸收的關(guān)鍵. 從已知高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的2種LH2結(jié)構(gòu)可知[2,3], 在靠近B850的周質(zhì)側(cè)(Periplasmic side), α脫輔基蛋白的C-端都含有一段超出跨膜螺旋區(qū)長(zhǎng)度大約18或19個(gè)氨基酸的肽鏈, 會(huì)形成另一個(gè)獨(dú)立的螺旋結(jié)構(gòu), 處于脂-水界面. 上述的第44位和45位關(guān)鍵氨基酸就處在這一非跨膜螺旋區(qū), 因此很容易受到來(lái)自水相物質(zhì)的影響. 此外, 已知Tch.tepidum核心天線LH1 Qy吸收位置受其生長(zhǎng)環(huán)境中大量存在的Ca2+的調(diào)控[9], 晶體結(jié)構(gòu)研究確定了在LH1脫輔基蛋白的C-端存在Ca2+的特異性結(jié)合位點(diǎn), 主要由Ca2+α-49位的天冬氨酸(Asp)和α-50位的天冬酰胺(Asn)的側(cè)鏈、α-46位的色氨酸(Trp)主鏈羰基、 相鄰β-46位的亮氨酸(Leu)的C-端羧基上5個(gè)氧原子構(gòu)成[12]. 雖然Tch.tepidumLH2的晶體結(jié)構(gòu)未知, 但通常紫色光合細(xì)菌的光合膜蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)具有很高的保守性[1], 因此可以認(rèn)為T(mén)ch.tepidumLH2具有和已知LH2相似的結(jié)構(gòu), 對(duì)Tch.tepidumLH2的αβ脫輔基蛋白氨基酸序列解析結(jié)果表明, 4種α脫輔基蛋白中有2種C-端擁有較長(zhǎng)的非跨膜區(qū)(19～24個(gè)氨基酸)[如圖6(E)中α1-1和α1-2所示][4]. 該非跨膜螺旋區(qū)也應(yīng)處于靠近B850側(cè)的脂-水界面區(qū). 考察該區(qū)域的氨基酸序列可以發(fā)現(xiàn), 多種側(cè)鏈可能作為鈣離子配體(如谷氨酰胺Q、 谷氨酸E)或者對(duì)氫離子敏感(如賴氨酸K、 組氨酸H、 色氨酸W)的氨基酸. 特別應(yīng)該指出的是, 這些氨基酸殘基均具有和B850細(xì)菌葉綠素羰基氧原子形成氫鍵的可能性, 因此, 這些氨基酸殘基不僅是Tch.tepidumLH2的B850吸收對(duì)鈣離子和氫離子敏感的關(guān)鍵位點(diǎn), 也可能是上述端基含帶電荷極性官能團(tuán)的表面活性劑或膜脂(如LDAO或卵磷脂中的PC)對(duì)B850造成減色和藍(lán)移的關(guān)鍵位點(diǎn). 具體機(jī)制可以推測(cè)為:鈣離子通過(guò)和上述多種關(guān)鍵氨基酸殘基形成多配位結(jié)構(gòu)域, 從而使B850葉綠素聚集體采取可以導(dǎo)致B850紅移和吸收增強(qiáng)的構(gòu)型; 而氫離子和帶電荷的表面活性劑(膜脂)端基可以破壞鈣離子配位的空間構(gòu)型, 即改變了相應(yīng)非跨膜螺旋區(qū)的結(jié)構(gòu), 從而直接或間接影響到?jīng)Q定B850 Qy吸收的氫鍵結(jié)構(gòu)或其它關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素, 造成光譜的藍(lán)移和減色.

3　結(jié)　　論

采用吸收光譜、 TEM、 動(dòng)態(tài)光散射及激光共振拉曼光譜技術(shù)對(duì)比了Tch.tepidum外周捕光天線LH2在2種表面活性劑膠束溶液及磷脂雙分子層體系中的性質(zhì). 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 卵磷脂構(gòu)成的liposome具有尺寸均勻、 結(jié)構(gòu)緊湊的超分子結(jié)構(gòu), 可以導(dǎo)致其組裝的LH2蛋白中類胡蘿卜素spirilloxanthin(共軛雙鍵數(shù)目為13)構(gòu)象相對(duì)在其它2種表面活性劑的膠束溶液中發(fā)生明顯變化; 表面活性劑及磷脂分子極性端基的荷電性質(zhì)是其對(duì)B850 Qy吸收造成影響的關(guān)鍵, 鈣離子的存在可以導(dǎo)致B850吸收普遍紅移和增色, 而氫離子則導(dǎo)致相反的作用, 對(duì)該蛋白復(fù)合物脫輔基蛋白氨基酸序列分析及與LH1結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果表明,α脫輔基蛋白C-端含有潛在的鈣離子、 氫離子結(jié)合位點(diǎn)及氫鍵形成位點(diǎn), 鈣離子與該區(qū)域氨基酸殘基的配位方式有利于B850聚集體采取導(dǎo)致Qy吸收增強(qiáng)和紅移的構(gòu)型, 而氫離子及表面活性劑帶電荷極性端基則會(huì)破壞這一結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致Qy吸收減色和藍(lán)移. 這一由鈣離子和氫離子調(diào)控的B850吸收變化的現(xiàn)象可能是該物種適應(yīng)其生存環(huán)境的一種方式.

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(Ed.:S, Z, M)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21273282, 21173265) and the International Cooperation Project Between China and Russia(No.21411130185).

Spectroscopic Properties of LH2 fromThermochromatiumtepidumin Liposome and Detergent Micelles?

HUO Yilin1, SHI Ying1, WANG Qinyue1, LI Luoyuan1, YU Longjiang2,3,WANG Peng1*, ZHANG Jianping1, WANG Zhengyu2

(1. Department of Chemistry, Renmin University of China, Beijing 100872, China;2.FacultyofScience,IbarakiUniversity,Mito310-8512,Japan;3.FacultyofScience,OkayamaUniversity,Okayama700-8530,Japan)

By the use of dynamic light scattering(DLS), transmission electron microscopy(TEM), UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, the properties of LH2 fromThermochromatium(Tch.)tepidumin two detergent micelles and in liposome were studied, respectively. The results show that in LH2-liposome the conformation of spirilloxanthin, an incorporated longer chain carotenoid, is obviously different from that in detergent micelles. The charge state of the terminal groups of detergents or lipids is the key factor affecting the B850 absorption. Generally, the calcium ions cause red-shift of the B850 absorption and hyperchromicity, while the proton has the opposite effect. Based on the amino acid sequence analysis, several amino acid residues on the C-terminus ofαapo-protein were proposed to constitute the potential binding site for the calcium ion and proton. Such Ca2+- and H+-regulated changes of B850 absorption might be an adaptive mechanism to the living environment for this species.

Thermochromatiumtepidum; Peripheral antenna complex LH2; Detergent; Liposome

10.7503/cjcu20160277

2016-04-25. 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2016-08-26.

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào):21173265, 21273282)和中-俄合作項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào):21411130185)資助.

O641

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介:王鵬, 男, 博士, 副教授, 主要從事天然光合體系能量轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)機(jī)制研究. E-mail:wpeng@iccas.ac.cn