劉 宏，范曉枝,2，田新強，李 冰

（1.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同037009；2.臨汾市第四人民醫(yī)院呼吸科，山西臨汾041000）

ARDS大鼠血小板MEK1磷酸化水平變化研究

劉 宏1，范曉枝1,2，田新強1，李 冰1

（1.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同037009；2.臨汾市第四人民醫(yī)院呼吸科，山西臨汾041000）

目的探討急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）時血小板活化的信號通路。方法30只健康大鼠隨機分為5組。實驗組4組，尾靜脈注射油酸（0.25ml/kg）制備ARDS模型；對照組1組，尾靜脈注射等量生理鹽水。注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理鹽水后2 h，從腹主動脈采血，分離血小板，提取血小板蛋白，用Western blotting技術(shù)檢測血小板內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路上的主要蛋白激酶之一絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1（MEK1）的磷酸化水平變化，探討ARDS時血小板MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變及其與ARDS發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果6～72 h實驗組動物血小板內(nèi)MEK1磷酸化水平明顯增高，在72 h表達量最高（P＜0.05）。結(jié)論ARDS時血小板發(fā)生了活化；其活化過程與MEK1-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動有關(guān)。

急性呼吸窘迫綜合癥；血小板活化；絲裂原活化蛋白激酶；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種由多種致病因素引起的以呼吸窘迫、進展迅速、持續(xù)低氧血癥、肺部大面積病變?yōu)樘卣鞯募毙院粑ソ?，是臨床常見急危重病癥，治療困難，病死率較高。雖然近50年來醫(yī)學(xué)界對之進行了大量研究，但其詳細的發(fā)病機制仍不十分清楚。本課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn)，ARDS時血液循環(huán)中存在高凝狀態(tài)，血小板發(fā)生活化并可能在ARDS發(fā)病中起重要作用[1]。本研究在既往研究基礎(chǔ)上，探討ARDS時血小板活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而探討ARDS發(fā)病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備

健康SD大鼠30只，體質(zhì)量250 g～400 g，隨機分為5組，每組6只。實驗組（OA組）4組，尾靜脈注射油酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑公司產(chǎn)品）0.25 mL/kg制備ARDS模型。對照組（NS組）1組，尾靜脈注射等量生理鹽水。注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理鹽水后2 h，處死動物，取樣檢測。

1.2 肺濕/干重比值測定和病理學(xué)檢查

動物處死后，立即開胸取肺做大體觀察，稱肺質(zhì)量并計算肺系數(shù)（肺系數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。左肺置10%福爾馬林溶液中固定1周后，按常規(guī)病理學(xué)方法切片，HE染色，光鏡觀察。右肺稱重后置80℃烤箱內(nèi)烘干至恒重，計算肺濕/干重比值（R w/d）。

1.3 絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1（MEK1）磷酸化水平測定

在注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理鹽水后2 h，從動物腹主動脈采血，分離血小板，提取血小板蛋白,采用Western blotting技術(shù)檢測血小板內(nèi)MEK1的磷酸化水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本文中實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Graphpad Prism統(tǒng)計學(xué)軟件對各實驗數(shù)據(jù)進行分析，各組間比較采用單因素方差分析，對差異顯著者用Newman-Kuels q檢驗進行兩兩比較，同組數(shù)據(jù)不同時間點的比較采用配對t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)

實驗組大鼠在注射油酸后2～3 min即開始出現(xiàn)呼吸困難，呼吸幅度增大，癱軟無力，活動減少，行走時呈爬行步態(tài)，進飲食減少;24 h后動物一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)；至72 h，活動基本恢復(fù)正常。對照組無異常變化。

2.2 動物肺系數(shù)和肺濕/干重比值變化

動物肺系數(shù)和肺濕/干重比值變化見表1。從表中可見，注射油酸后2～24 h，實驗組動物體質(zhì)量、肺系數(shù)和肺濕/干重比值均有不同程度增加，以2 h最嚴(yán)重。對照組上述各項均無異常變化。

表1 各組動物肺系數(shù)和肺濕/干重比值(±s)

表1 各組動物肺系數(shù)和肺濕/干重比值(±s)

注：①OA=Oleic Acid。②*為與對照組相比P≤0.05

NS OA 2 h OA 6 h OA 24 h OA 72 h 354.2±60.2 368.5±46.0 372.8±39.6 406.7±40.0 252.5±5.2 2.2±0.7 4.8±1.1*4.1±0.8*3.6±0.3*2.4±0.3*0.6±0.1 1.3±0.2*1.1±0.1*0.9±0.1*0.9±0.1*3.3±0.3 6.0±0.6*5.6±0.2*5.3±1.4*4.8±0.7*

2.3 肺組織病理學(xué)檢查

肉眼觀察可見，對照組大鼠肺臟呈粉紅色，表面光滑，紋理清晰，大小正常；2～24 h實驗組大鼠雙肺明顯腫脹，體積增大，重量增加，外觀呈紫紅色花斑狀；72 h實驗組，肺臟腫脹減輕，外觀呈灰白色，彈性差。光鏡下，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔干凈，肺泡壁無增厚；實驗組2～24 h各組均有輕重不一的肺泡水腫和間質(zhì)水腫，肺泡內(nèi)可見有多量染色深紅均一的蛋白滲出物，肺泡、肺間質(zhì)出血，炎細胞浸潤，小血管擴張、充血；72 h組，肺泡腔炎性滲出大部分吸收，肺泡腔縮小，肺泡間隔增厚，炎細胞浸潤減輕，纖維組織增生，有微血栓形成。

2.4 血小板內(nèi)MEK1磷酸化水平變化

各組動物血小板MEK1磷酸化水平如圖1所示。與對照組相比，6～72 h實驗組動物血小板內(nèi)蛋白激酶MEK1磷酸化水平明顯增高，在72 h表達量最高（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠血小板MEK1磷酸化水平

3 討論

ARDS是臨床上比較常見的疾病，早期階段或輕癥曾被稱為急性肺損傷(ALI)。在美國，每年發(fā)病約20萬例，死亡率接近50%[2]。它可由多種病因引起，但詳細發(fā)病機理尚未不清楚。

近年科學(xué)界對血小板的功能特性有了不少新的發(fā)現(xiàn)，使得人們對血小板在呼吸系統(tǒng)分子和細胞生物學(xué)中所起作用的看法發(fā)生了改變[3]。除參與止血及血栓形成外，血小板還參與免疫、炎癥、動脈硬化、血管生成、淋巴管發(fā)育、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等病理過程[4-8]。血小板能表達多免疫受體(例如CD14，TLRs,FcR，CD40等)，釋放大量接近活化的細胞因子(如IL1β,MCP-1，TGFβ,CD40L，RANTES等)。這些受體、細胞因子共同使血小板吸引白細胞到血管損傷點，釋放炎性因子，產(chǎn)生微顆粒物質(zhì)，誘發(fā)凝血酶的生成。已證明這些過程對膿毒癥、動脈粥樣硬化、肝炎、急性肺損傷、血管再狹窄和移植排斥反應(yīng)等疾患的發(fā)病過程至關(guān)重要[6]。

在生理狀態(tài)和在ARDS時，血小板、血小板前體與肺有多個級別的交互活動,血小板在ARDS時發(fā)生活化并可能在ARDS發(fā)病中起重要作用[3,9-10]，但其時血小板活化的具體機制和信號傳導(dǎo)通路仍不清楚。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路是細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有至關(guān)重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，由一大群絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成。該信號通路存在于許多細胞內(nèi)，在細胞外刺激信號向細胞及其核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)并引起細胞發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)的過程中起重要作用。在高等哺乳類動物的細胞內(nèi)主要有3條并行的三級聯(lián)MAPKs信號通路：細胞外調(diào)節(jié)的蛋白激酶(ERKs)信號通路，c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNKs)信號通路和p38蛋白激酶(p38 kinase，p38 MAPK)信號通路。不同的細胞外刺激使用其中不同的通路，通過各條通路的相互調(diào)控而介導(dǎo)不同的細胞生物學(xué)反應(yīng)。

MEK1是ERKs通路上第二級聯(lián)的一個重要蛋白激酶[11]。它可使絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化，選擇性地激活ERK1和ERK2。目前有關(guān)ARDS時血液循環(huán)中血小板內(nèi)MEK1-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究報道還很少。本研究結(jié)果顯示，6～72 h實驗組動物血液循環(huán)中血小板內(nèi)MEK1蛋白激酶磷酸化水平明顯增高，在72 h表達量最高（P＜0.05）。實驗結(jié)果說明，ARDS時血小板發(fā)生了活化并有MEK1-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動；該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動可能參與了血小板的活化過程。我們的研究只是對ARDS時血小板活化信號通路的初步探索，今后還需要大量的實驗研究進行深入探討。

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Study on the Changes of Platelet MEk1 Phosphorylation Levels in Acute Respiratory Distress Syndrome Rats

LIU Hong1，F(xiàn)AN Xiao-zhi1,2，TIAN Xin-qiang1，LI Bing1
（1.Research Institute of Respiratory and Occupational Diseases，Datong University,Datong Shanxi,037009;2.Department of Respiratory Medicine，The Fourth People's Hospital of Linfen,Linfen Shanxi,041000)

Objective To investigate the signal pathway of platelet activation in acute respiratory distress syndrome(ARDS).Methods 30 healthy rats were randomly divided into 5 groups.4 groups of them were as the experimental group,which were made AR?DS rat models by intravenous injection of oleic acid(OA,0.25ml/kg).1 of 5 groups was as control group,was injected normal saline(NS)in same dose by intravenous.After injection of oleic acid 2 h,6h,24h,72h,saline 2h,drawing off blood from the abdominal aorta;sepa?rating platelets;extractting platelet protein;detecting platelet mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1（MEK1）phos?phorylation levels by Western blotting method,which is one of major protein kinases in the mitogen-activated protein kinases(MAPKs)signal pathway,to explore the changes of platelet MAPKs signal transduction pathway in ARDS,and the relationship between the changes and the pathogenesis of ARDS.Results Platelet MEK1 phosphorylation levels were significantly increased in 6～72h experi?mental animals;the highest expression at 72h(P＜0.05).Conclusion Platelet activation occurs in ARDS;the activation process of plate?lets are related with MEK1-ERK1/2 signaling pathway.

acute respiratory distress syndrome（ARDS）;platelet activation;mitogen-activated protein kinases(MAPKs);signal transduction;mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1（MEK1）

R563.8

A

1674-0874(2016)05-0046-03

2016-06-16

山西省自然科學(xué)基金資助項目[2013011055-5];大同市基礎(chǔ)研究項目[2014105-2]

劉宏(1957-)，男，山西大同人，博士，教授，研究方向：內(nèi)科呼吸系統(tǒng)疾病和職業(yè)性肺病。

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕