劉曉航 夏一今/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司李一經(jīng)/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院

豬繁殖與呼吸綜合征病毒微載體培養(yǎng)試驗(yàn)研究

劉曉航 夏一今/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司
李一經(jīng)/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎，各種年齡豬（特別是仔豬）呼吸障礙為特征的高度傳染性疾病。郭寶清等（1996）首次從國(guó)內(nèi)疑似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實(shí)了本病在我國(guó)的存在。此病常為地方流行性，長(zhǎng)期危害養(yǎng)豬生產(chǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的生產(chǎn)主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，進(jìn)而增殖PRRSV。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖較為緩慢而且生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監(jiān)控和適時(shí)補(bǔ)給，無(wú)法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動(dòng)化程度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，并因?yàn)檗D(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導(dǎo)致存在生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠、批間差較大、產(chǎn)量低等問(wèn)題。

本研究摸索了利用微載體大規(guī)模培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞增殖PRRSV病毒的條件，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳增殖條件，為以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)大規(guī)模增殖病毒及制備藍(lán)耳病疫苗提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.毒株與細(xì)胞。PRRSV Hun4 F112株病毒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病分子診斷實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；Marc-145細(xì)胞由本單位保存，傳代培養(yǎng)至54代。

2.主要設(shè)備與試劑。5 L生物反應(yīng)器（B5，Sartorius，Germany）；Cytodex-1購(gòu)自GE Healthcare公司；DMEM購(gòu)自Life technology；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

3.靜置培養(yǎng)。Marc-145細(xì)胞生長(zhǎng)至3 d～4 d后，細(xì)胞基本鋪滿方瓶時(shí)，先用PBS清洗2次，再加入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）溶液消化，傾去胰酶，加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打，T75方瓶以1∶3～1∶4的比率傳代。

4.微載體培養(yǎng)。

（1）微載體處理。用無(wú)Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡至少3 h后，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后儲(chǔ)于4℃密封待用。使用前用37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2遍。

（2）Marc-145細(xì)胞的反應(yīng)器培養(yǎng)優(yōu)化。

①不同初始密度細(xì)胞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。不同初始密度1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml、3.0×105個(gè)細(xì)胞/ml、4.5×105個(gè)細(xì)胞/ml的Marc-145細(xì)胞分別接種于5 L反應(yīng)器中，微載體用量為3 g/L，觀察不同初始密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，確定最佳接種細(xì)胞密度。

②攪拌速度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。本實(shí)驗(yàn)分別考察了攪拌速度為50/min、75 r/min和100 r/min時(shí)Marc-145細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，微載體濃度為3 g/L。以3.0×105cells/ml細(xì)胞密度接種于5 L反應(yīng)器中，工作體積為2 L，每隔8 h進(jìn)行監(jiān)測(cè)，取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞。

③不同微載體濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。微載體供應(yīng)商GE公司推薦的微載體濃度為2～3 g/L，分批培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)一般不超過(guò)5 g/L。本實(shí)驗(yàn)考察了微載體濃度為1 g/L、3 g/L和5 g/L時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

④代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，乳酸和葡萄糖的代謝情況是細(xì)胞生長(zhǎng)的主要指標(biāo)。因此，本研究檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中葡萄糖、乳酸代謝情況，并對(duì)灌注策略進(jìn)行分析。

5.微載體培養(yǎng)PRRSV病毒條件優(yōu)化。

（1）病毒感染量（MOI）的確定。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別以MOI=0.01、0.1、0.5、1和5接種病毒，檢測(cè)病毒滴度。

（2）病毒感染時(shí)間（TOI）的確定。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后，以1.3.1中優(yōu)化的MOI接種病毒，檢測(cè)病毒滴度。

（3）病毒測(cè)定。樣品TCID50測(cè)定：將在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的Marc-145細(xì)胞消化，稀釋至所需的細(xì)胞密度（0.8～1.0×105cells/ml，即每孔8 000～10 000個(gè)細(xì)胞），向96孔板中每孔加100μl細(xì)胞懸液；置培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h至細(xì)胞鋪成單層約60%豐度；取出孔板，吸去培養(yǎng)液，每孔添加約100μl PBS搖晃洗滌2遍以除去血清；將10倍比系列稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，從1到11作11個(gè)梯度，從A到H作8個(gè)重復(fù)，最后一列（A12-H12）做陰性對(duì)照（各加100μl病毒稀釋液），置培養(yǎng)箱37℃孵育1 h；吸除病毒液，加入100μl細(xì)胞維持液；置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變和對(duì)照，共觀察2～5日，并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。同時(shí)以相同的方法對(duì)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的PRRS病毒液進(jìn)行TCID50測(cè)定。以此作為對(duì)照組。

6.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫原性實(shí)驗(yàn)。免疫攻毒測(cè)定：用5～6周齡健康易感仔豬15頭，隨機(jī)分為3組，每組5頭。一組用供試疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)，另一組用轉(zhuǎn)瓶苗進(jìn)行保護(hù)；兩組試驗(yàn)豬各頸部肌肉注射疫苗1頭份。第三組不接種疫苗，作為對(duì)照，在相同條件下隔離飼養(yǎng)。28日后，所有豬各肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒HuN4株的病毒培養(yǎng)液（104.0TCID50/ml）1 ml，每頭滴鼻2 ml，每日測(cè)溫并觀察21日。

二、結(jié)果

1.初始細(xì)胞密度的確定。當(dāng)微載體用量為3 g/L時(shí)，初始細(xì)胞密度1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml、3.0×105個(gè)細(xì)胞/ml和4.5×105個(gè)細(xì)胞/ml使得Marc-145細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)曲線有所差異（圖1）。低初始密度 （1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml）使Marc-145細(xì)胞的延遲期延長(zhǎng)，這是由于單個(gè)微載體上分布的細(xì)胞過(guò)少，同時(shí)微載體的空球率較高 （圖2A），細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏初始密度效應(yīng)而造成生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，最大細(xì)胞密度也最低，但細(xì)胞存活率始終維持在較高水平。4.5×105個(gè)細(xì)胞/ml的初始密度可以使Marc-145細(xì)胞快速進(jìn)入生長(zhǎng)期，但細(xì)胞存活率相對(duì)較低，這是由于接種后細(xì)胞存在聚團(tuán)和游離細(xì)胞不黏附的現(xiàn)象，雖然單個(gè)微載體上分配的細(xì)胞個(gè)數(shù)很多，但不能提供有效的黏附生長(zhǎng)表面，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2C）。所以細(xì)胞接種于微載體上培養(yǎng)時(shí)，合適的細(xì)胞初始密度（3×105個(gè)細(xì)胞/ml）既能均勻分布細(xì)胞于每個(gè)微載體表面，促使細(xì)胞快速生長(zhǎng)，同時(shí)也為細(xì)胞的生長(zhǎng)預(yù)留了充裕的生長(zhǎng)表面，最終獲得較好的培養(yǎng)效果，維持較高的細(xì)胞存活率（圖2B）。細(xì)胞不同密度接種對(duì)細(xì)胞的增殖會(huì)有較明顯的影響，初始密度過(guò)小和過(guò)大均不利于細(xì)胞的增殖，中密度接種較為適合。

圖1　不同初始密度的Marc-145細(xì)胞在3g/L微載體上生長(zhǎng)曲線

圖2　不同初始密度的Marc-145細(xì)胞在3g/L微載體上培養(yǎng)6 h時(shí)的黏附效率比較

2.攪拌速度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。微載體培養(yǎng)過(guò)程中為了使微載體充分懸浮，必須要有足夠高的攪拌速度；但過(guò)度的攪拌會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞貼壁時(shí)間，嚴(yán)重?fù)p傷已貼壁細(xì)胞，尤其對(duì)有絲分裂周期細(xì)胞的傷害更大，導(dǎo)致細(xì)胞密度降低。因此本實(shí)驗(yàn)分別考察了攪拌速度為80/min、100 r/min和120 r/min時(shí)Marc-145細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)攪拌速度為80 r/min時(shí)，細(xì)胞密度緩慢上升，最高細(xì)胞密度僅為8.3×105cell/ml，這可能是因?yàn)閿嚢杷俣冗^(guò)低，轉(zhuǎn)瓶中氧傳質(zhì)速度不能滿足細(xì)胞消耗，因此細(xì)胞生長(zhǎng)不出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；攪拌速度為120 r/min時(shí)，最高密度大于前者，但也明顯小于當(dāng)攪拌速度為100 r/min時(shí)的最高細(xì)胞密度，說(shuō)明這時(shí)攪拌過(guò)度，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了嚴(yán)重的剪切傷害。攪拌速度為100 r/min時(shí)，細(xì)胞快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，56 h時(shí)細(xì)胞最高密度為1.8×106cell/ml，因此我們確定100 r/min為最佳攪拌速度。

圖3　攪拌速度對(duì)微載體培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3.微載體濃度的確定。微載體濃度影響種子細(xì)胞的準(zhǔn)備量、最高細(xì)胞密度、細(xì)胞代數(shù)、換液頻率和策略，又因?yàn)槲⑤d體價(jià)格昂貴，對(duì)培養(yǎng)成本也有很大影響，所以選擇合適的微載體濃度對(duì)大規(guī)模工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)有重要意義。微載體供應(yīng)商GE公司推薦的微載體濃度為2～3 g/L。本實(shí)驗(yàn)考察了微載體濃度為1 g/L、3 g/L和5 g/L時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，微載體濃度為1g/L時(shí)，不能提供足夠的表面積供細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞受到較嚴(yán)重的接觸抑制，56 h時(shí)細(xì)胞密度只有5.0×105cell/ml；而微載體濃度為3 g/L和5 g/L時(shí)，36 h前細(xì)胞密度無(wú)明顯差別，36～60 h前者細(xì)胞密度略高于后者，最高細(xì)胞密度分別為1.5×106cell/ml和1.3×106cell/ml?？紤]到使用成本，選擇3 g/L作為微載體的使用重量。

圖4　微載體濃度對(duì)微載體培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

4.生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)代謝分析和灌注策略。在Marc-145細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)程中葡萄糖含量迅速下降到最低值5 mmol/L，代謝乳酸由0 mmol/L快速升高到20 mmol/L，隨著細(xì)胞總數(shù)接近最大值，細(xì)胞的葡萄糖消耗逐漸趨于穩(wěn)定，同時(shí)乳酸含量也下降到一個(gè)較低的水平（圖5）。由于1分子葡萄糖完全代謝為乳酸的情況下，可以生成2分子乳酸。在細(xì)胞生長(zhǎng)期，葡萄糖消耗量略低于乳酸生成量，說(shuō)明葡萄糖不是完全代謝生成乳酸，低于50%的葡萄糖完全氧化供給細(xì)胞能量。因此，在細(xì)胞放大培養(yǎng)過(guò)程中，早期細(xì)胞以葡萄糖代謝產(chǎn)生大量乳酸為特征，灌注培養(yǎng)基以控制乳酸濃度在較低水平為目的，灌注量3～4體積；中后期以細(xì)胞維持生存為灌注目的，灌注量1～2體積，逐步減少以達(dá)到較高培養(yǎng)基利用率。

圖5　5L生物反應(yīng)器MDCK細(xì)胞葡萄糖、乳酸含量曲線

5.反應(yīng)器參數(shù)控制。激流式生物反應(yīng)器的使用方法，按產(chǎn)品使用和操作方法說(shuō)明進(jìn)行。反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中主要參考設(shè)置如表1所示。

表1　反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中的控制參數(shù)

（1）PRRSV病毒感染Marc145細(xì)胞的條件優(yōu)化。

①病毒感染量（MOI）及收毒時(shí)間的確定。不同的感染復(fù)數(shù)對(duì)PRRSV增殖效價(jià)的影響結(jié)果如表2所示。過(guò)高或過(guò)低的感染復(fù)數(shù)（5和0.01）均導(dǎo)致較低的PRRSV增殖效價(jià)，說(shuō)明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復(fù)數(shù)為0.10時(shí)可以獲得最高的PRRSV增殖效價(jià)，達(dá)到108.0TCID50/ml。此外各組試驗(yàn)結(jié)果均顯示，接毒后48h的病毒效價(jià)均高于接毒后72 h的病毒效價(jià)，說(shuō)明接毒后48h可以作為收獲病毒的最適時(shí)間。對(duì)上述工藝共進(jìn)行3次驗(yàn)證，在5L反應(yīng)器中獲得比較穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)及病毒增殖效果，病毒增殖效價(jià)均高于108.0TCID50/ml，優(yōu)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)效價(jià)。

表2　不同感染復(fù)數(shù)（MOI）對(duì)PRRSV增殖效價(jià)的影響

②病毒維持液血清濃度的確定。分別選擇1.5%、2%、2.5%血清濃度維持液，培養(yǎng)結(jié)束后，分別對(duì)含毒細(xì)胞培養(yǎng)液的病毒含量進(jìn)行測(cè)定，以確定最佳血清濃度的維持液。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，從表3可以看出，血清濃度對(duì)病毒的增值有一定的影響，當(dāng)血清濃度為2%時(shí)，病毒含量為107.6TCID50/0.1ml，明顯高于血清濃度為1.5%時(shí)的病毒含量。但與2.5%和3.0%比較時(shí)，結(jié)果差異不顯著，因此選擇血清濃度為2%的維持液培養(yǎng)病毒。

表3　不同血清濃度維持液對(duì)病毒增殖的影響

6.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的效力試驗(yàn)。由表4的結(jié)果可以看出，本生產(chǎn)的活疫苗保護(hù)率在90%，而轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的疫苗保護(hù)率為70%，實(shí)驗(yàn)證明病毒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的活疫苗比轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的疫苗有更好的保護(hù)效果。

表4　活疫苗對(duì)PRRSV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力

三、結(jié)論

實(shí)驗(yàn)得出，用懸浮培養(yǎng)制備的活疫苗病毒含量高且免疫保護(hù)效果好，通過(guò)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)病毒制備的疫苗免疫效果對(duì)比，免疫保護(hù)效力要顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶制備的活疫苗對(duì)豬的免疫保護(hù)效力。懸浮培養(yǎng)PRRSV生產(chǎn)方法，體現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)和規(guī)模化生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞和病毒的趨勢(shì)，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝相比，具有病毒含量高、抗原效價(jià)提高顯著的優(yōu)點(diǎn)，且產(chǎn)品質(zhì)量均一；生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化，產(chǎn)量大，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

（略）