涂云華 康穎倩 李明娥 周英 薛月萃 葉振源 榮冬蕓 昝雪娟 潘軍玲 陸洪光 曹煜

550004貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科（涂云華、李明娥、薛月萃、葉振源、榮冬蕓、昝雪娟、潘軍玲、陸洪光、曹煜）；貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室（康穎倩）；貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院貴州省中藥（民族藥）創(chuàng)制工程中心（周英）

芳姜黃酮衍生物對(duì)A375人黑素瘤細(xì)胞增殖及凋亡作用的機(jī)制研究

涂云華 康穎倩 李明娥 周英 薛月萃 葉振源 榮冬蕓 昝雪娟 潘軍玲 陸洪光 曹煜

550004貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科（涂云華、李明娥、薛月萃、葉振源、榮冬蕓、昝雪娟、潘軍玲、陸洪光、曹煜）；貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室（康穎倩）；貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院貴州省中藥（民族藥）創(chuàng)制工程中心（周英）

目的研究一種芳姜黃酮衍生物（ATD）對(duì)人皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法不同濃度（5、10、20、40、80 μmol/L）ATD、長春新堿及芳姜黃酮體外作用A375及人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）48 h。CCK?8法檢測細(xì)胞增殖抑制率；吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）染色，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；DNA片段化檢測細(xì)胞凋亡；比色法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）活性；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期。結(jié)果ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)A375細(xì)胞有抑制增殖作用，且呈劑量依賴性（ATD：R2=0.99，F(xiàn)=340.96；長春新堿：R2=0.99，F(xiàn)=349.19；芳姜黃酮：R2=0.89，F(xiàn)=25.41，均P＜ 0.05），三者IC50分別為（15.96± 0.02）、（77.00±0.04）及（356.95±0.01）μmol/L。當(dāng)藥物濃度為5 μmol/L及10 μmol/L時(shí)，ATD對(duì)HSF增殖抑制率分別為（8±0.06）%和（25±0.02）%，長春新堿為（33±0.04）%和（29±0.08）%，芳姜黃酮為（49±0.09）%和（34±0.07）%；ATD對(duì)A375細(xì)胞抑制率分別為（26±0.06）%和（39±0.02）%，長春新堿為（8±0.04）%和（17±0.08）%，芳姜黃酮為（6±0.09）%和（10±0.07）%，與二甲基亞砜相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且ATD對(duì)A375細(xì)胞增殖抑制活性強(qiáng)于長春新堿及芳姜黃酮（P＜0.05），但對(duì)HSF細(xì)胞毒性卻明顯低于長春新堿及芳姜黃酮（P＜0.05）。ATD、長春新堿及芳姜黃酮均可誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡，caspase?3活性隨3種藥物濃度增加而增強(qiáng)，且藥效為ATD＞長春新堿＞芳姜黃酮。流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)，3種藥物都能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不同程度凋亡，同芳姜黃酮及長春新堿相比，ATD能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且以晚期凋亡為主。隨藥物濃度增加，ATD組G1期A375細(xì)胞逐漸增多，G2期及S期細(xì)胞數(shù)明顯減少。結(jié)論ATD對(duì)A375細(xì)胞有抑制增殖及促凋亡作用，該作用明顯強(qiáng)于芳姜黃酮及長春新堿，其機(jī)制可能是激活caspase?3，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞分化與增殖。

黑色素瘤，實(shí)驗(yàn)性；細(xì)胞系，腫瘤；姜黃酮；長春新堿；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；芳姜黃酮衍生物

芳姜黃酮是中藥姜黃的主要成分之一［1］，具有抗腫瘤、抗血小板、抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化、抗老年癡呆及抗代謝綜合征等藥理作用［2-3］。近年來，芳姜黃酮在抗腫瘤方面已被廣泛研究，但其溶解性較低，且對(duì)正常細(xì)胞有影響［4］。為尋求抗腫瘤活性更高的藥物，我們運(yùn)用芳姜黃酮衍生物作用A375及人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF），觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料與試劑

芳姜黃酮衍生物，由潘博文等合成［5］，化學(xué)名1?（4?氟苯基）?1?（1H?吲哚?3?烷基）?5?甲基?4?己烯?3?酮，由貴州大學(xué)生命科學(xué)院中藥創(chuàng)制工程中心提供，含藥溶液的總體積與二甲基亞砜（DMSO）的體積以10∶0.1的比例混合，用完全培養(yǎng)基稀釋成10 mol/L作為母液，濾過除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，芳姜黃酮（美國Cayman Chemical公司），長春新堿（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），A375細(xì)胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司），HSF細(xì)胞（CCC?HSF?1細(xì)胞，上海信則生物科技有限公司），Gibco胎牛血清（美國Life Technologies公司），DMEM、青霉素、鏈霉素及磁珠法基因組DNA抽提試劑盒［上海生工生物工程（上海）股份有限公司］，CCK?8試劑盒（日本同仁化學(xué)公司），細(xì)胞周期試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），AnnexinⅤ?FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）凋亡染色試劑盒（上海貝博生物公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀（美國寶特公司），E?Gel?Imager（美國 Life Technologies公司），BD FACS Verse流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：A375貼壁細(xì)胞及CCC?HSF?1用完全培養(yǎng)基（含DMEM、10%胎牛血清及1%青霉素和1%鏈霉素）置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞增殖抑制率測定：CCK?8法檢測增殖抑制率［6］。芳姜黃酮的36個(gè)衍生物，經(jīng)過CCK?8增殖抑制作用初篩，選擇一種抗腫瘤活性較強(qiáng)的芳姜黃酮衍生物。取對(duì)數(shù)生長期A375及HSF細(xì)胞，調(diào)整密度為1.2 × 105個(gè)/ml，按50 μl/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同體積ATD、芳姜黃酮及長春新堿母液，用完全培養(yǎng)基補(bǔ)足至總體積為100 μl/孔，使其終濃度分別為 5、10、20、40、80 μmol/L；設(shè)細(xì)胞對(duì)照組［不加藥物，僅加入DMSO（體積分?jǐn)?shù)10∶1 000）和培養(yǎng)液，其他處理同實(shí)驗(yàn)組］、空白組（不加DMSO、藥物及細(xì)胞，余處理同前），每一濃度設(shè)6孔，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前1.5 h，每孔加入10 μl CCK?8溶液孵育，酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度（A）值。細(xì)胞增殖抑制率=（細(xì)胞對(duì)照A450?實(shí)驗(yàn)孔A450）/（細(xì)胞對(duì)照A450-空白孔A450）×100%。

3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：調(diào)整A375細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/ml，接種到 6孔板，培養(yǎng) 12 h，實(shí)驗(yàn)組加入ATD、芳姜黃酮及長春新堿，使終濃度分別為5、10、20、40、80 μmol/L，設(shè)不加藥物細(xì)胞對(duì)照組，培養(yǎng)48 h，AO/EB染色，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

4.DNA片段化檢測：調(diào)整A375細(xì)胞密度為1.4×105個(gè)/ml，按1 ml/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同體積ATD、芳姜黃酮及長春新堿母液，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基至總體積為2 ml/孔，使其終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L，設(shè)不加藥物細(xì)胞對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)胞。提取全基因組DNA，參考Hassan等［7］的方法，行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察并拍照。

5.Caspase?3活性檢測：A375細(xì)胞培養(yǎng)方法同“DNA片段化檢測”，按照caspase?3活性檢測試劑盒步驟操作，酶標(biāo)儀檢測波長405 nm處吸光度（A值）。Caspase?3活化程度=實(shí)驗(yàn)組A405/細(xì)胞對(duì)照組A405。

6.細(xì)胞凋亡檢測：A375細(xì)胞培養(yǎng)方法同“DNA片段化檢測”，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，參考Jiang等［8］實(shí)驗(yàn)方法，按Annexin V?FITC凋亡檢測試劑盒染色，然后上機(jī)檢測。

7.細(xì)胞周期檢測：取對(duì)數(shù)生長期A375細(xì)胞，參照Wu等［9］的實(shí)驗(yàn)方法，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5 × 105個(gè)/ml，按1 ml/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同體積ATD母液，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μmol/L，設(shè)不加藥物細(xì)胞對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用不含EDTA的胰酶消化，1 000×g離心5 min，收集細(xì)胞，乙醇固定細(xì)胞1 h，按照周期試劑盒操作步驟加入PI染色液后上機(jī)檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0，結(jié)果以x±s表示，同一時(shí)間段不同濃度組間采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)；藥效-劑量關(guān)系運(yùn)用曲線估計(jì)，用R2及F值來表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響

見圖1。3種藥物對(duì)A375細(xì)胞有抑制增殖作用，且呈劑量依賴性（ATD：R2=0.99，F(xiàn)=340.96，P＜0.05；長春新堿：R2=0.99，F(xiàn)=349.19，P＜0.05；芳姜黃酮：R2=0.89，F(xiàn)=25.41，P＜0.05），各濃度下3種藥物組細(xì)胞的增殖抑制程度與細(xì)胞對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ATD、長春新堿及芳姜黃酮IC50分別為（15.96±0.02）、（77.00± 0.04）及（356.95 ± 0.01）μmol/L。當(dāng)藥物濃度為5、10 μmol/L時(shí)，ATD對(duì)A375細(xì)胞增殖抑制率分別為（26±0.06）%及（39±0.02）%，長春新堿為（8±0.04）%及（17±0.08）%，芳姜黃酮為（6±0.09）%及（10±0.07）%；ATD對(duì)A375細(xì)胞增殖抑制率與芳姜黃酮及長春新堿相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

二、ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)HSF增殖的影響

見圖2。當(dāng)藥物濃度為5、10 μmol/L時(shí)，ATD對(duì)HSF增殖抑制率分別為（8±0.06）%及（25±0.02）%，長春新堿為（33±0.04）%及（29±0.08）%，芳姜黃酮為（49±0.09）%及（34±0.07）%；與細(xì)胞對(duì)照組相比，3種藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)藥物濃度增高至20、40、80 μmol/L時(shí)，ATD對(duì)HSF的抑制作用明顯強(qiáng)于長春新堿及芳姜黃酮（均P＜0.05）。

圖1 芳姜黃酮衍生物（ATD）、長春新堿及芳姜黃酮作用48 h對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制率（n=6）

圖2 芳姜黃酮衍生物（ATD）、長春新堿及芳姜黃酮作用48 h對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的抑制率（n=6）

圖3 不同濃度芳姜黃酮衍生物、芳姜黃酮、長春新堿作用A375細(xì)胞48 h后DNA片段化電泳圖 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～5：分別為80、40、20、10、5 μmol/L 藥物組；6：細(xì)胞對(duì)照組

三、ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組細(xì)胞呈多角形或梭形，緊密排列，生長活躍，呈現(xiàn)致密的綠色熒光；不同濃度ATD、長春新堿及芳姜黃酮組可見數(shù)量不等的黃綠色熒光，由低濃度至高濃度，黃綠色熒光逐漸減少，而桔黃色熒光逐漸增多，細(xì)胞逐漸變圓，貼壁性降低，細(xì)胞間隙增大，并有大量漂浮壞死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，以ATD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最為顯著。

四、ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)A375細(xì)胞DNA片段化影響

作用A375細(xì)胞48 h后，5～ 80 μmol/L ATD組、20～ 80 μmol/L芳姜黃酮組、10～ 80 μmol/L長春新堿組均見明顯DNA片段化，且隨濃度升高片段化程度增強(qiáng)。5～80 μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)DNA片段化的誘導(dǎo)作用為ATD＞長春新堿＞芳姜黃酮。見圖3。

五、ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)A375細(xì)胞caspase?3活性的影響

圖4 芳姜黃酮衍生物（ATD）、長春新堿及芳姜黃酮作用48 h后A375細(xì)胞caspase?3活性

見圖4。ATD、長春新堿及芳姜黃酮均不同程度活化A375細(xì)胞caspase?3，其中以ATD組最為明顯。隨藥物濃度增加，caspase?3活性逐漸增加，且呈劑量依賴性（ATD：R2=0.98，F(xiàn)=162.30，P＜0.05；長春新堿：R2=0.96，F(xiàn)=94.39，P＜0.05；芳姜黃酮：R2=0.95，F(xiàn)=57.35，P＜0.05）。在濃度為10、20、40及80 μmol/L時(shí)，各藥物組與細(xì)胞對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ATD組與長春新堿及芳姜黃酮組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

六、ATD、長春新堿及芳姜黃酮對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響

見表1。3種藥物作用A375細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度凋亡。隨藥物濃度遞增，ATD組晚期凋亡細(xì)胞逐漸增多，早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)先增多后減少趨勢(shì)；芳姜黃酮組早期凋亡及晚期凋亡不明顯；長春新堿組晚期凋亡細(xì)胞逐漸增多，早期凋亡細(xì)胞亦呈現(xiàn)先增多后減少趨勢(shì)。藥物濃度為5～80 μmol/L時(shí)，3種藥物組早期凋亡率及晚期凋亡率同對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而且，隨藥物濃度增加，ATD組發(fā)生壞死逐漸增多，與長春新堿組及芳姜黃酮組壞死率相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 不同濃度芳姜黃酮衍生物、芳姜黃酮及長春新堿作用48 h后A375細(xì)胞凋亡率比較（%，x±s）

七、ATD對(duì)A375細(xì)胞周期的影響

隨ATD濃度增加，G1期細(xì)胞比例逐漸增高多，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但G2期及S期細(xì)胞逐漸減少，濃度為80 μmol/L時(shí)，G2期及S期細(xì)胞比例均降至0。見表3。

討 論

我們?cè)鴮?duì)以芳姜黃酮為主要成分的姜黃揮發(fā)油進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病THP?1細(xì)胞株具有較好的抗腫瘤活性［10］，芳姜黃酮通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及免疫激活等不同作用方式發(fā)揮抗癌活性，但其作用與化療藥物相比較弱。為尋求抗腫瘤活性更高而毒性更低的藥物，我們選擇ATD行抗黑素瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)ATD通過影響凋亡相關(guān)分子而對(duì)黑素瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制增殖及促凋亡作用。

表2 不同濃度芳姜黃酮衍生物、芳姜黃酮及長春新堿作用48 h后A375細(xì)胞死亡率比較（%，x±s）

本研究結(jié)果顯示，ATD、芳姜黃酮及長春新堿都不同程度抑制A375細(xì)胞增殖，隨藥物劑量增加，增殖抑制作用增強(qiáng)，且為劑量依賴性，抗腫瘤活性ATD＞長春新堿＞芳姜黃酮。但3種藥物對(duì)HSF有不同程度的影響，隨藥物濃度增加，ATD對(duì)HSF的作用明顯增加，芳姜黃酮組及長春新堿組增加不明顯。但當(dāng)藥物濃度為5及10 μmol/L時(shí)，ATD毒性明顯小于芳姜黃酮及長春新堿，且在此濃度范圍內(nèi)，ATD抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于芳姜黃酮及長春新堿。

凋亡是由特定基因調(diào)控的細(xì)胞自殺過程，本實(shí)驗(yàn)中，隨ATD、芳姜黃酮及長春新堿濃度增加，A375貼壁性能下降，并見數(shù)量不等的漂浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片，說明3種藥物都不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)藥物濃度為20、40及80 μmol/L時(shí)，可見ATD組細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯增寬，且見大量壞死細(xì)胞，而芳姜黃酮組及長春新堿組仍然可見到數(shù)目較多的貼壁細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)較正常，說明ATD具有顯著誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的作用，其作用強(qiáng)于芳姜黃酮及長春新堿。

聚腺苷二磷酸?核糖聚合酶（poly ADP?ribose polymerase，PARP）是caspase?3的主要底物之一，參與DNA修復(fù)及維持基因完整性［11］。凋亡啟動(dòng)時(shí)，PARP被caspase?3剪切成85 000和31 000兩個(gè)片段，使PARP中與DNA結(jié)合的2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，最終使受PARP負(fù)調(diào)控的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性增高，裂解核小體間DNA，引起細(xì)胞凋亡［12］。本研究結(jié)果顯示，隨ATD、芳姜黃酮及長春新堿濃度增加，caspase?3活性逐漸增高，且為劑量依賴性，以ATD組caspase?3活化程度最為明顯。DNA片段化亦證實(shí)，ATD、芳姜黃酮及長春新堿誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡，電泳見典型DNA梯狀條帶，為凋亡時(shí)激活Ca2+或Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶，致DNA鏈斷裂形成50 000～300 000 bp DNA片段所致［13］，且以ATD作用較為明顯。

流式細(xì)胞儀檢測顯示，ATD、芳姜黃酮及長春新堿均可不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨藥物濃度增加，凋亡作用增強(qiáng)，但三者致使細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)期不一致。ATD主要使細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，早期凋亡變化不明顯，隨劑量增加，細(xì)胞凋亡率明顯上升，壞死細(xì)胞亦顯著增多。芳姜黃酮組以早期凋亡較為明顯，長春新堿組以晚期凋亡較為明顯，但長春新堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯弱于ATD。

表3 不同濃度芳姜黃酮衍生物作用48 h后A375細(xì)胞周期分布（%，x±s）

本實(shí)驗(yàn)中，ATD由低濃度至高濃度，A375細(xì)胞G1期逐漸增多，G2期及S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞周期被阻滯在G1期，細(xì)胞DNA合成受阻，阻斷了細(xì)胞的有絲分裂，從而對(duì)A375細(xì)胞起到增殖抑制作用。

綜上所述，ATD對(duì)A375細(xì)胞具有抑制增殖及促凋亡作用，且其作用強(qiáng)度明顯強(qiáng)于芳姜黃酮及長春新堿。當(dāng)藥物濃度為10 μmol/L時(shí)，ATD毒性明顯小于芳姜黃酮及長春新堿，但抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于芳姜黃酮及長春新堿。

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Effects of an ar?turmerone derivative on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells and their mechanisms

Tu Yunhua,Kang Yingqian,Li Ming′e,Zhou Ying,Xue Yuecui,Ye Zhenyuan,Rong Dongyun,Zan Xuejuan,Pan Junling,Lu Hongguang,Cao Yu
Department of Dermatology and Venereology,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China（Tu YH,Li ME,Xue YC,Ye ZY,Rong DY,Zan XJ,Pan JL,Lu HG,Cao Y）;Department of Microbiology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China（Kang YQ）;Guizhou Provincial Chinese Medicine（Ethnic Medicine）Creation Engineering Center,College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China（Zhou Y）

ObjectiveTo investigate the effects of an ar?turmerone derivative（ATD）on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells.MethodsBoth A375 cells and human skin fibroblasts（HSFs）were cultured with different concentrations（5,10,20,40 and 80 μmol/L）of ATD,vincristine and ar?turmerone,separately,for 48 hoursin vitro.Subsequently,cell counting kit?8（CCK ?8）was used to evaluate cell proliferation,inverted microscopy to observe cell morphology after acridine orange/ethidium bromide（AO/EB）staining,and a colorimetric method to estimate caspase?3 activity.DNA fragmentation assay and flow cytometry were performed to assess cell apoptosis,and flow cytometry was conducted to analyze cell cycle.ResultsATD,vincristine and Ar?turmerone all inhibited the proliferation of A375 cells in a dose?dependent manner（ATD:R2=0.99,F=340.96,P＜ 0.05;vincristine:R2=0.99,F=349.19,P＜ 0.05;ar?turmerone:R2=0.89,F=25.41,P＜ 0.05）.The fifty percent inhibitory concentra?tions（IC50s）of ATD,vincristine and ar?turmerone against A375 cells were 15.96 ± 0.02 μmol/L,77.00 ± 0.04 μmol/L and 356.95 ± 0.01 μmol/L respectively.When the drug concentrations were 5 and 10 μmol/L,the proliferation of HSFs was inhibited by 8%±0.06%and 25%±0.02%respectively by ATD,by 49%±0.09%and 34%±0.07%respectively by ar?turmerone,and by 33% ± 0.04%and 29% ± 0.08%respectively by vincristine,and the proliferation of A375 cells was inhibited by 26%±0.06%and 39%±0.02%respectively by ATD,by 6%±0.09%and 10%±0.07%respectively by ar?turmerone,and by 8% ± 0.04%and 17% ± 0.08%respectively by vincristine,with the inhibitory effects of the three drugs being significantly different from that of dimethyl sulfoxide（allP＜ 0.05）.ATD showed stronger inhibitory effects on the proliferation of A375 cells,but weaker cytotoxic effects on HSFs compared with ar?turmerone and vincristine（allP＜ 0.05）.Meanwhile,ATD,vincristine and ar?turmerone all induced the apoptosis of A375 cells（P＜0.05）,and caspase?3 activity increased with the increase in drug concentrations（ATD:R2=0.98,F=162.30,P＜ 0.05;vincristine:R2=0.96,F=94.39,P＜ 0.05;ar?turmerone：R2=0.95,F=57.35,P＜ 0.05）.The effect of ATD on caspase?3 activity was strongest,followed by that of vincristine and ar?turmerone.As flow cytometry showed,all the three drugs induced cell apoptosis to different degrees,and ATD showed a relatively strong effect on cell apoptosis,especially late apoptosis,compared with the other two drugs.In the ATD group,the number of A375 cells in G1 phase gradually increased,while that in G2 phase and S phase significantly decreased with the increase in drug concentrations.Conclusions ATD exhibited proliferation?inhibiting and apoptosis?inducing effects on A375 cells,and the effects were stronger than those of vincristine and ar?turmerone.It is quite possible that ATD affects cell proliferation and differentiation by activating caspase?3 and arresting cell cycle in the G1 phase.

Melanoma,experimental;Cell line,tumor;Turmerone;Vincristine;Cell proliferation;Apoptosis;Ar?turmerone derivatives

Cao Yu,Email:382541077@qq.com

曹煜，Email：382541077@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.012

貴州省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)項(xiàng)目［黔科合中藥字（2012）5018號(hào)］；貴陽市科技局科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目［筑科合同（2012303）號(hào)］；貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心［黔教合字（2012）018號(hào)］

Fund programs:Modernization of Traditional Chinese Medicine Program of Guizhou Province（Grant No.［2012］5018）;Science and Technology Innovation Platform Project of Guiyang Municipal Science and Technology Bureau（Grant No.2012303）;Pharmaceutical Engineering Center for Traditional Chinese Medicine and National Medicine of Guizhou Province（Guizhou Education Grant No.［2012］018）

2015?07?31）

（本文編輯：尚淑賢）