戴金華 廖于峰 冷江涌 馬建波 李克強(qiáng)

【摘要】目的：分析前列腺癌患者血清miR-146a與miR-152的表達(dá)水平及臨床意義。 方法：以2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科診治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及健康體檢志愿者各46例為研究對象，分析各組患者血清miR-146a與miR-152的表達(dá)水平及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果：miR-146a在前列腺癌患者血清中的表達(dá)水平顯著高于良性前列腺增生及正常組血清，且前列腺良性增生組血清中miR-146a的表達(dá)量亦較正常組高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-152在前列腺癌患者較良性前列腺增生及正常組血清顯著偏低（P<0.05），但在良性前列腺增生和正常組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；血清miR-146a在不同病理分期、臨床分期、有無骨轉(zhuǎn)移及血清tPSA有關(guān)（P<0.05），與年齡無關(guān)（P>0.05）；而miR-152與不同病理分期、臨床分期、有無骨轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與血清tPSA水平無相關(guān)性（P>0.05），與年齡無顯著相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論：miR-146a與miR-152在前列腺癌患者血清中的表達(dá)水平發(fā)生了顯著改變，為用于前列腺癌的早期診斷及病程的判斷提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌；血清；miR-146a；miR-152

Serum miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients and their clinical significanceDAI Jinhua1， LIAO Yufeng1△， LENG Jiangyong2， MA Jianbo1， LI Keqiang2. 1.Department of Clinical Laboratory， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， Zhejiang， China； 2.Urology Department，Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， Zhejiang， China

【Abstract】Objectives： To analyze serum circulating miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients and their clinical significance. Methods： Prostate cancer， benign prostatic hyperplasia patients and healthy volunteers from July 2012 to April 2013 in our hospital were recruited for the study， 46 cases in each group. The serum miR-146a， miR-152 expression levels and correlativity with clinic pathological parameters were analyzed. Results： The miR-146a expression levels in the serum of prostate cancer group was significantly higher than these in benign prostatic hyperplasia group and normal group， and miR-146a expression levels in the serum of benign prostatic hyperplasia group was higher than normal group， with statistically significant difference （P< 0.05）； miR-152 in prostate cancer group was decreased significantly compared with benign prostatic hyperplasia group and normal group （P<0.05）， but no significant difference was found between benign prostatic hyperplasia and normal group （P> 0.05 ） ； serum miR-146a was related with different pathological stage， clinical stage， with or without bone metastases （P<0.05）. Serum miR-146a had no relationship with serum tPSA （p>0.05）； whereas miR-152 was related with various pathologic stage， clinical stage， with or without bone metastasis （P<0.05）， but serum tPSA levels had no correlation with miR-152 （P> 0.05）. Conclusion： Serum miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients have significant changes， which provides relevant experimental basis for the early diagnosis of prostate cancer and determine the course.

【Key words】Prostate cancer； Serum； MiR-146a； MiR-152

【中圖分類號】R697+.3【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率隨著年齡的增長而升高，且呈現(xiàn)出地區(qū)差異性。我國前列腺癌的發(fā)病率雖較歐美地區(qū)低，但隨著人口老齡化進(jìn)程的加快和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率逐年上升，呈現(xiàn)出惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。微小RNA（MicroRNA）是一類高度保守內(nèi)源性非編碼的小核苷酸序列，近年MicroRNA所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究成果為前列腺癌發(fā)病機(jī)制及早期診斷的研究開辟了新的思路[2]。研究顯示miR-146a在早期前列腺癌中表達(dá)有所升高，可能參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[3]。針對miR-152的研究表明其在前列腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，作為一種腫瘤抑制因子，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）的表達(dá)，影響前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[4]。本研究采用RT-PCR檢測前列腺癌、前列腺良性增生及正?；颊哐逯衜iR-146a及miR-152的表達(dá)水平，為前列腺癌的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料

以2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科診治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及健康體檢志愿者中采用隨機(jī)數(shù)表法各選擇46名作為研究對象，年齡（67.6±8.2）歲，所有前列腺癌及良性前列腺增生患者經(jīng)穿刺活檢病理學(xué)確診且抽血前未經(jīng)任何治療；排除患有高血壓、急性感染、結(jié)核病及糖尿病等疾病的患者。前列腺癌的病理分級依據(jù)2003年WHO前列腺癌病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)的Gleason評分，腫瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期標(biāo)準(zhǔn)（即ABCD分期）。所有患者及家屬簽署知情同意書，并通過了醫(yī)院倫理委員會的審批。

1.2主要儀器與試劑

Trizol、RNAisoTMPlus及RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；Taq man MicroRNA Assay 及miRVana TMmiRNA Isolation Kit購自美國Ambion公司；miR-146a、miR-152及U6引物由吉凱基因（上海）提供；DU-730購自美國 BECKMAN 公司；雙穩(wěn)定時電泳儀DYY-6C購自北京六一公司；ABI PRISM7300 RT-PCR儀購自美國ABI公司。

1.3RT-PCR檢測血清miR-146a、miR-152的表達(dá)

1.3.1血清樣本制備 抽取參與對象外周血3mL于真空采血管，室溫靜置1h后，4℃，3000r/min離心15min，收集上清，保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2血清總RNA抽提 采用Trizol法提取血清總RNA，加無水乙醇洗滌后，再加10～50μL DEPC水溶解，核酸純度分析儀分析RNA純度，A260/A280在1.8～2.0之間，DU-730計(jì)算RNA濃度，分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3RT-PCR檢測血清miR-146a、miR-152的表達(dá) 分別檢測參與對象的血清miR-146a、miR-152的表達(dá)水平。

逆轉(zhuǎn)錄：取 100ng Total RNA、1μL M-MLV（購自 TAKARA 公司）、1μL（1μM/μL）miRNA 反轉(zhuǎn)錄引物，總體系為20μL，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。先將模板，引物與H2O 混勻后 65℃變性 5min 后置冰上，再加入酶、PCR Buffer 等試劑，逆轉(zhuǎn)錄參數(shù)為 16℃ 30min，37℃ 30min，70℃ 10min，4℃保存。完成后將樣本-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增：10μLMaster Mix、6.4μL ddH2O、10μM PCR引物、1μL RT產(chǎn)物，共20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，30min；59℃，30s；30個循環(huán)，最后72℃，8min。每例樣本3重復(fù)，ABI7300記錄Ct值，以U6為內(nèi)參，以N=2-ΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對統(tǒng)計(jì)資料進(jìn)行分析。計(jì)量資料用（±s）表示，兩獨(dú)立樣本兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)。血清中miR-146a、miR-152的表達(dá)水平與各臨床病例參數(shù)間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血清miR-146a、miR-152的表達(dá)水平分析

對各組患者血清中miR-146a、miR-152的表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，miR-146a在前列腺癌患者血清中的表達(dá)水平較良性前列腺增生及正常組血清顯著升高，且前列腺良性增生組血清中的表達(dá)量亦較正常組高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1A。miR-152在前列腺癌患者較良性前列腺增生及正常組血清顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但在良性前列腺增生和正常組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖1B。

2.2血清miR-146a、miR-152的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析單因素方差分析和t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，血清miR-146a在不同病理分期、臨床分期、有無骨轉(zhuǎn)移及血清tPSA有關(guān)（P<0.05），在≤60與>60歲組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.48，P<0.05）；而miR-152與不同病理分期、臨床分期、有無骨轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與血清tPSA水平及年齡分無顯著相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

3討論

前列腺癌是發(fā)生于前列腺腺體的惡性腫瘤，在老年男性人群中并發(fā)率高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，給家庭和社會帶來了沉重的壓力[5]。隨著研究者對前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究的深入，前列腺癌的診斷方法不斷改進(jìn)，如酸性磷酸酶的測定、前列腺特異性抗原篩查等為前列腺的早期診斷、早期治療提供了可靠的方法[6，7]。

MicroRNA作為宿主基因在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄前體轉(zhuǎn)錄本，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過招募相關(guān)蛋白組成沉默復(fù)合體RISC與靶microRNA互補(bǔ)結(jié)合，降解或抑制mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[8]。miR-146a是一個與免疫相關(guān)miRNA，雖然miR-146a在腫瘤、炎癥中的作用機(jī)制尚未完全清楚，但與細(xì)胞因子存在著密切的聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過負(fù)調(diào)控NF-kB通路抑制IL-6、IL-1β及TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)[9，10]，還能夠抑制胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。已有研究報(bào)道顯示轉(zhuǎn)染miR-146a的PC3細(xì)胞形成克隆的大小和數(shù)目都要顯著較對照組低，提示miR-146a能夠抑制PC3的體外克隆能力[11]。本研究顯示在前列腺癌患者血清中miR-146a的表達(dá)水平要顯著高于良性前列腺病變及健康對照組患者，提示miR-146a可能參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，為前列腺癌的早期診斷提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。多項(xiàng)研究表明miR-152在卵巢癌、結(jié)腸癌等多種實(shí)體腫瘤中的表達(dá)下調(diào)[12，13]；研究顯示miRNA-152能夠通過調(diào)理MMP-3及NRP-2的表達(dá)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及血管生成[14]，子宮內(nèi)膜癌中miRNA-152的水平上調(diào)能夠顯著抑制腫瘤的生長[15]，但對于前列腺癌的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示在前列腺癌患者血清中miR-152的表達(dá)水平顯著降低，miR-152與不同病理分期、臨床分期、有無骨轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與血清tPSA水平無顯著相關(guān)性（P>0.05），隨著病情的加重miR-152的表達(dá)水平顯著降低。表明miRNA-152的血清表達(dá)水平與前列腺癌的病理分期存在一定的相關(guān)性，提示血清miRNA-152可以作為預(yù)測前列腺癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物。

綜上所述，miR-146a與miR-152在前列腺癌患者血清中的表達(dá)水平發(fā)生了顯著改變，提示其可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要的作用，為前列腺癌的早期診斷及病程的判斷提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]張曉智，郭嘉.根治性放療對于早期前列腺癌治療更具優(yōu)勢.現(xiàn)代泌尿外科雜志，2013， 18（4）：390-391.

[2]Selth LA， Roberts MJ， Chow CWK， et al. Human seminal fluid as a source of prostate cancer specific microRNA biomarkers. Endocr Relat Cancer，2014， 21（4）： L17-L21.

[3]Xu B， Wang N， Wang X， et al. MiR-146a suppresses tumor growth and progression by targeting EGFR pathway and in a p-ERK-dependent manner in castration-resistant prostate cancer. Prostate， 2012，72（11）：1171-1178.

[4]Zhu C， Li J， Ding Q， et al. miR-152 controls migration and invasive potential by targeting TGFα in prostate cancer cell lines. Prostate， 2013，73（10）：1082-1089.

[5]龐寬，周澤光，劉成倍，等.對血清前列腺特異性抗原<10.0μg/L 者行經(jīng)會陰飽和前列腺穿刺活檢診斷前列腺癌的價值.中國性科學(xué)，2015，24（4）：47-50.

[6]馬海鋒，張大海，郭冬，等.三維適形放療聯(lián)合內(nèi)分泌治療老年晚期前列腺癌臨床療效及對生活質(zhì)量的影響.中國性科學(xué)，2015，24（3）：18-21.

[7]闞秀芳，趙麗晶，李倩，等.前列腺癌診斷模式與發(fā)病率的研究進(jìn)展.中國老年學(xué)雜志，2013，33（23）：6069-6071.

[8]Flores O， Kennedy EM， Skalsky RL， et al. Differential RISC association of endogenous human microRNAs predicts their inhibitory potential. Nucleic Acids Res， 2014，42（7）：4629-39.

[9]Curtale G， Citarella F， Carissimi C， et al. An emerging player in the adaptive immune response： microRNA-146a is a modulator of IL-2 expression and activation-induced cell death in T lymphocytes. Blood， 2010， 115（2）： 265-273.

[10]王祥，黎明，楊麗元.KLF2對 ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞 microRNA-146 a及促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2014，34（5）：337-342.

[11]Lin SL， Chiang A， Chang D， et al. Loss of mir-146a function in hormone-refractory prostate cancer. RNA， 2008， 14（3）： 417-424.

[12]Woo HH， László CF， Greco S， et al. Regulation of colony stimulating factor-1 expression and ovarian cancer cell behavior in vitro by miR-128 and miR-152. Mol Cancer， 2012，11（1）：58.

[13]Wang XY， Wu MH， Liu F， et al. Differential miRNA expression and their target genes between NGX6-positive and negative colon cancer cells. Mol Cell Biochem， 2010，345（1-2）：283-290.

[14]Zheng X， Chopp M， Lu Y， et al. MiR-15b and miR-152 reduce glioma cell invasion and angiogenesis via NRP-2 and MMP-3. Cancer Lett， 2013，329（2）：146-154.

[15]Tsuruta T， Kozaki K， Uesugi A， et al. miR-152 is a tumor suppressor microRNA that is silenced by DNA hypermethylation in endometrial cancer. Cancer Res， 2011，71（20）：6450-6462.