林大專 惠 春 孫全樂(lè) 殷 玥

（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031）

HPLC法測(cè)定賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸的含量

林大專 惠 春 孫全樂(lè) 殷 玥

（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031）

目的 建立高效液相色譜柱前衍生化法測(cè)定賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸的含量。方法 采用鄰苯二醛（OPA）為衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化，色譜柱為Kromasil5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%三乙醇胺（48∶52）；檢測(cè)波長(zhǎng)為326 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃。結(jié)果 鹽酸賴氨酸在78.6～1100.4 μg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)γ=0.9995（n=5），平均回收率為100.2%，（RSD=1.59%，n=6）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單、快速，可作為賴氨酸磷酸氫鈣顆粒的質(zhì)量控制方法。

HPLC法；賴氨酸磷酸氫鈣顆粒；鹽酸賴氨酸；鄰苯二醛柱前衍生化

賴氨酸磷酸氫鈣顆粒是由鹽酸賴氨酸和磷酸氫鈣組成的復(fù)方制劑，具有促進(jìn)幼兒正常生長(zhǎng)發(fā)育，補(bǔ)充兒童及孕婦鈣質(zhì)的作用。其中鹽酸賴氨酸為主要生理活性成分，鹽酸賴氨酸本身不產(chǎn)生熒光，且無(wú)紫外吸收［1］，通常采用與茚三酮反應(yīng)比色法測(cè)定含量，該法的專屬性與穩(wěn)定性均較差，為該藥品的質(zhì)量控制帶來(lái)了一定的困難。本文采用鄰苯二醛衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化，利用HPLC法對(duì)賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸進(jìn)行含量測(cè)定，為該制劑的質(zhì)量控制提供有效、可行的方法。

1　儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀［Agilent 1200可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD），Agilent 1200數(shù)據(jù)站， G1354A四元梯度泵及G1316A柱溫箱系美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品］；L-賴氨酸鹽酸鹽對(duì)照品（南通飛宇生物科技有限公司，含量98%以上）；鄰苯二醛（上海亞太精細(xì)化工公司出品，化學(xué)純）；賴氨酸磷酸氫鈣顆粒（批號(hào)為120601，120602，120603，白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠）；甲醇為色譜純，三乙醇胺，三乙胺，乙醇均為分析純，水為超純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液制備。0.15%鄰苯二醛（OPA）溶液的配制：精密稱取鄰苯二醛0.1523 g，用少量甲醇溶解，用水定容至100 mL量瓶中，搖勻即得。

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取鹽酸賴氨酸對(duì)照品0.0795 g，用少量水溶解，用70%堿性乙醇（用三乙胺調(diào)pH至10.7［2］）定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得對(duì)照品溶液。

樣品溶液的配制：精密稱取樣品（每批）約125 mg，用1 mL水溶解，用70%堿性乙醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

2.2色譜條件。色譜柱：Kromasil5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%三乙醇胺（48∶52）；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃。

2.3方法學(xué)考察。線性試驗(yàn)：精密量取鹽酸賴氨酸對(duì)照品溶液0.05，0.10，0.30，0.50，0.70 mL于反應(yīng)管中，加水稀釋至1 mL，分別加入0.15%OPA溶液2 mL，密塞后搖勻管內(nèi)液體，將反應(yīng)管置于沸水浴中加熱1 min［2］，立即冷卻至室溫，進(jìn)樣20 μL至液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以鹽酸賴氨酸衍生物的峰面積為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量為橫坐標(biāo)（m），進(jìn)行線性回歸，回歸方程：A=9.6993m-93.021，相關(guān)系數(shù)r=0.9995（n=5），結(jié)果表明鹽酸賴氨酸在78.6～1100.4 μg范圍內(nèi)色譜峰面積與質(zhì)量之間具有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL于反應(yīng)管中，照線性試驗(yàn)同法操作，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示鹽酸賴氨酸衍生物峰面積的RSD分別為1.67%（n=5），表明本法精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取批號(hào)為120601的樣品，照樣品溶液配制的方法制備樣品溶液，精密量取續(xù)濾液1.0 mL至反應(yīng)管中，照線性試驗(yàn)同法操作，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。重復(fù)操作6次，結(jié)果顯示鹽酸賴氨酸衍生物峰面積RSD為1.91%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取批號(hào)為120601的樣品，照樣品溶液配制的方法制備樣品溶液，分別于0、3、6 h時(shí)精密量取續(xù)濾液1.0 mL至反應(yīng)管中，照線性試驗(yàn)同法操作，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示RSD為1.61%，表明樣品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取批號(hào)為120601的樣品0.1251 g，照樣品溶液配制方法制備樣品溶液，精密量取該樣品溶液6份，每份0.5 mL，于反應(yīng)管中，加入對(duì)照品溶液各0.2 mL，加水0.3 mL，照線性試驗(yàn)測(cè)定方法測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果鹽酸賴氨酸的平均回收率為100.2%，RSD=1.59%（n=6）；結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　鹽酸賴氨酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4樣品含量測(cè)定：依法操作，測(cè)得3批樣品中鹽酸賴氨酸標(biāo)示量百分含量分別為97.0%（1.28%），98.1%（0.56%），95.0%（0.63%），括號(hào)中為每個(gè)樣品3次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3　討 論

采用70%乙醇溶解樣品，可以防止在溫度較高時(shí)，賴氨酸受細(xì)菌作用變質(zhì)，導(dǎo)致其濃度發(fā)生變化。本方法為OPA與賴氨酸柱前衍生化法，反應(yīng)的最佳條件是沸水浴1 min，溫度較低OPA與賴氨酸衍生化反應(yīng)比較緩慢，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致衍生化產(chǎn)物分解，因此HPLC法測(cè)定應(yīng)在15 min內(nèi)完成。本法專屬性強(qiáng)，回收率好，樣品處理簡(jiǎn)單，因此該法可用于賴氨酸磷酸氫鈣顆粒的質(zhì)量控制。

［1］成丹，李健和，彭詞艷，等.高效液相色譜法和非水電位滴定法測(cè)定注射用鹽酸賴氨酸含量的比較［J］.中國(guó)藥業(yè)，2012，21（15）：51-53.

［2］凌笑梅，劉養(yǎng)清，杜鳴，等.高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定賴氨酸注射液中賴氨酸含量［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（5）：349-352.

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1671-8194（2016）27-0021-01