劉彩霞 鄭唐春 代麗娟 劉 軼 曲冠證

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

擬南芥AtPI基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化

劉彩霞 鄭唐春 代麗娟 劉 軼 曲冠證*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

花是被子植物主要的繁殖器官，在繁育后代的過程中，發(fā)揮著極其重要的作用，PISTILLATA(PI)基因作為控制花器官發(fā)育的B類功能基因中的一員，在花器官發(fā)育中起到重要的作用。為探究PI基因在花瓣和雄蕊發(fā)育中的功能，本文以擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的PI基因作為研究對象，利用PCR技術(shù)從擬南芥花序cDNA擴(kuò)增出AtPI基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體(pROKⅡ-AtPI)并進(jìn)行煙草(Nicotianatobacum)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果表明，AtPI基因已經(jīng)整合到了煙草基因組中。在T2代植株中，通過實時定量熒光PCR檢測顯示，AtPI在mRNA水平也均有表達(dá)。過量表達(dá)PI的轉(zhuǎn)基因煙草在花器官中存在明顯表型，與野生型相比主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株花冠變小，雄蕊縮短，果實畸形且子房基部比野生型長5～10 mm，上述結(jié)果表明AtPI基因是特異性參與雄蕊和花瓣的發(fā)育并起著至關(guān)重要的作用。

擬南芥；PISTILLATA(PI)；煙草；雄蕊；花瓣；子房

花是被子植物區(qū)別于其他植物類群最重要的特征之一，其發(fā)育是一個相對保守的過程，從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)化是一個復(fù)雜的多步驟協(xié)同完成的過程，根據(jù)對模式植物的分子遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，花的發(fā)育受多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，并形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[1]。1990年，Yanofsky等從擬南芥中克隆出同源異型基因Agamous，從此打開了研究同源異型基因調(diào)節(jié)花發(fā)育作用的大門。之后由Angenent和Colombo基于對擬南芥及金魚草的研究提出了“ABC”模型[2～5]，該模型的三類功能基因組成分別介紹如下：A類功能基因有APETALA1(AP1)和APETALA2(AP2)；B類功能基因有APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)；C類功能基因為AGAMOUS(AG)[6～7]。這三類基因的功能大致分別為以下幾點：A類中AP1決定花分生組織形成，決定萼片和花瓣器官原基的發(fā)生；AP2則是與AP1共同決定該原基的發(fā)生；B類AP3和PI則是聚合在一起共同作用的共同控制花瓣、雄蕊發(fā)育；C類控制雄蕊、心皮的發(fā)育，使花芽發(fā)育具有確定性[8～11]。

PI作為控制花發(fā)育B類功能基因的一員，同樣隸屬于MADS-box家族，具有高度的保守性，目前對于PI基因的研究大部分都是通過利用擬南芥中的AtPI基因的保守序列進(jìn)行設(shè)計引物在其它物種如：蘭花、油菜、甘藍(lán)等一些單子葉植物中進(jìn)行PI基因的克隆及生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果表明PI基因在進(jìn)化程度上十分迅速，但PI基因在不同物種之間對花瓣及雄蕊發(fā)育的控制作用是極其保守的，同時王若琳，Liu等研究發(fā)現(xiàn)PI基因在花器官形成中對心皮的發(fā)育也有著重要的作用[12～13]。這對研究不同物種中控制花發(fā)育的基因豐富了理論基礎(chǔ)[14]。

目前為止擬南芥中PI基因在煙草中異源表達(dá)研究報道較少。本實驗根據(jù)擬南芥B類功能基因的高度保守性和組織特異性表達(dá)特征，從擬南芥花序中克隆PI基因、構(gòu)建植物表達(dá)載體并進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)生了顯著的表型變化，且這些表型在以前的轉(zhuǎn)基因擬南芥中未被發(fā)現(xiàn)。本研究不僅對植物花器官B類特征基因PI功能進(jìn)行了新的補充，還豐富了對植物花發(fā)育的“ABC”模型的新的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所需野生型煙草(Nicotianatabacum)和擬南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)種子均為本實驗室保存。

質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司(美國)；PCR相關(guān)試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase、PrimeScriptTMRT reagent Kit購自TaKaRa公司(中國大連)；EASYPureTMPlant RNA Kit、pEASY-T1、大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購自Transgen(中國)；農(nóng)桿菌EHA105為本實驗室保存；pROKII載體由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈；其他實驗試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 擬南芥花序總RNA提取及AtPI基因的克隆

用EASYPureTMPlant RNA Kit試劑盒提取擬南芥花器官的總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模版，利用表1中的引物(PI-F/R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min共35個循環(huán)，72℃再延伸7 min，PCR結(jié)束后全部產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收后的片段根據(jù)操作手冊介紹方法連入pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，涂LB抗性平板(卡那抗性)，對獲得的單克隆經(jīng)過菌落PCR驗證，篩選后的陽性克隆命名為pEASY-T1-AtPI，送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序。

表1 本研究使用的引物

1.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

通過表1引物(PI-F/R)擴(kuò)增的目的片段，將獲得的目的片段和pROKII載體質(zhì)粒，同時利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，并分別凝膠回收目的片段，利用T4DNA ligase過夜連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，涂LB抗性平板(卡那抗性)，對獲得的單克隆進(jìn)過菌落PCR驗證，篩選后的陽性克隆命名為pROKII-AtPI，送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序。

選取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，提取農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒根據(jù)表1中的引物(pROKII-F/R)進(jìn)行PCR檢測。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草獲得及分子檢測

通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過程如下：預(yù)培1～2 d；農(nóng)桿菌(OD=0.6)侵染5 min；共培1 d；脫菌。經(jīng)一個月后獲得抗性株系。

對抗性株系進(jìn)行分子檢測，用CTAB方法提取抗性植株總DNA，利用表1引物進(jìn)行PCR并用1%瓊脂糖凝膠檢測，篩選出陽性轉(zhuǎn)基因株系。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的實時定量熒光PCR檢測

利用實時熒光定量PCR驗證AtPI基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，將獲得的轉(zhuǎn)基因株系用EASYPureTMPlant RNA Kit試劑盒提取植株的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將合成的第一鏈cDNA加去離子水稀釋10倍，作為模版，以Ntactin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見表1。反應(yīng)體系為20 μL；其中2×SYBR Green實時熒光染料混合液10 μL，ROX DyeⅡ 0.4 μL，2 μL cDNA模板，正向引物(PI-RT-F)，反向引物(PI-RT-R)各0.8 μL。qRT-PCR的擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)，反應(yīng)完畢后，獲取數(shù)據(jù)并通過2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析。

1.6 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草植株的表型觀察

挑選表達(dá)量較高3個轉(zhuǎn)基因株系及對照株系分別移栽10棵至溫室，分別對其進(jìn)行定期的觀察，在移栽后60 d后開始開花，1周后進(jìn)入盛花期，在頂部花序中，隨機(jī)選取5朵剛剛開放的花，分別測量它們的花冠、柱頭和雄蕊的長度，最后對測量的結(jié)果利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行SNK差異性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥花序總RNA提取及AtPI基因的克隆

利用RNA提取試劑盒，從擬南芥花序中成功提取總RNA(圖1:A)，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，獲得條帶與預(yù)期PI基因大小一致(圖1:B)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，隨機(jī)挑取單克隆，并經(jīng)菌落PCR驗證(圖1:C)，并對篩選出的陽性克隆進(jìn)行測序檢測，測序結(jié)果通過Bioedit生物軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，克隆片段與目的基因100%相同，將測序正確的菌落命名為pEASY-T1-AtPI。

圖1 擬南芥花序總RNA提取和AtPI基因的克隆鑒定 A.擬南芥總花序RNA：M. DNA marker DL5000；1.擬南芥花序總RNA；B.擬南芥PI基因的克?。篗. DNA marker DL5000；1. PI基因PCR產(chǎn)物；C. pEASY-T1-AtPI載體在大腸桿菌菌液中PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～8. pEASY-T1-AtPI PCR產(chǎn)物Fig.1 The total RNA of A.thaliana inflorescences and clone and verification of AtPI gene A. Total RNA of A.thaliana inflorescences： M. DNA marker DL5000; 1. Total RNA of A.thaliana inflorescences; B. The cloning of PI gene： M. DNA marker DL5000; 1. PCR product of AtPI gene; C. PCR detection of pEASY-T1-AtPI in E.coli: M. DNA marker DL5000; 1-8. PCR product of pEASY-T1-AtPI

2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建

植物表達(dá)載體圖譜如圖2所示，并根據(jù)該圖譜進(jìn)行載體構(gòu)建。步驟如下：對測序正確的pEASY-T1-AtPI菌液提質(zhì)粒，之后與pROKII載體質(zhì)粒，同時用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ做雙酶切，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3:A)，對目的片段切膠回收，并利用T4DNA ligase連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，涂LB抗性平板(卡那抗性)，隨機(jī)挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗證，篩選出陽性克隆(圖3:B)，命名為pROKII-AtPI，將菌液送公司測序，結(jié)果表明，PI基因成功整合到pROKII載體上，之后通過液氮凍融法將pRIKII-AtPI質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取8個單克隆，經(jīng)PCR檢測(圖3:C)，均為陽性克隆，并標(biāo)記為EHA105(pROKII-AtPI)。

圖2 植物表達(dá)載體pROKII-AtPI的構(gòu)建圖譜Fig.2 Plant expression vector constructs pROKII-AtPI map

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測

用含有pROKII-AtPI農(nóng)桿菌EHA105侵染煙草葉片，經(jīng)4～6周的選擇培養(yǎng)，從葉片周圍生成大

量抗性芽。待抗性芽長出葉片后，將葉片切下放在含有卡那(50 mg·L-1)抗生素的分生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)(圖4)。將兩次分化獲得的芽在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根定植，最終共獲得12株轉(zhuǎn)基因煙草植株。提取已獲得有抗性的轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA，利用表1中pROKII通用引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(圖5)，結(jié)果顯示抗性植株中均含有目的基因，說明外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中。

圖3 植物表達(dá)載體pROKII-AtPI的構(gòu)建及檢測 A.限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果：M. DNA marker DL5000；1. pROKII載體質(zhì)粒雙酶切條帶；2. pEASY-T1-AtPI質(zhì)粒雙酶切條帶；B.植物表達(dá)載體pROKII-AtPI的質(zhì)粒PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～8. pROKII-AtPI PCR產(chǎn)物；C.農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～8. EHA105(pROKII-AtPI)轉(zhuǎn)化子菌液PCR檢測Fig.3 Construction and detection of plant expression vector pROKII-AtPI A. Electrophoretogram of restriction enzymes digestion: M. DNA marker DL5000; 1. Digestion of pROKII vector with XbaⅠ and KpnⅠ; 2. Digestion of pEASY-T1-AtPI with XbaⅠ and KpnⅠ; B. PCR detection of plant expression vector pROKII-AtPI: M. DNA marker DL5000; 1-8. PCR product of pROKII-AtPI; C. PCR detection of Agrobacterium-mediated transformation: M. DNA marker DL5000; 1-8. PCR products of transformants in Agrobacterium

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 A～B.選擇培養(yǎng)基上形成的抗性芽；C.轉(zhuǎn)基因植株生根苗Fig.4 The obtaining of transgenic plants A-B.The putative transgenic shoot buds; C.The transgenic seedling for rooting

2.4 實時定量RT-PCR分析

為了研究擬南芥PI基因在煙草植株中的表達(dá)情況，提取煙草葉總RNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。與野生型煙草比，擬南芥PI基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均有表達(dá)，表達(dá)量較高的株系有1、5、7、8、9和11，表達(dá)量最高的株系是1、9、11(圖6)，選這3個株系用于下一步的后續(xù)分析。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系表型觀測

將得到的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行不定期觀察，在營養(yǎng)生長期，未發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)差異。待植株進(jìn)入花器官發(fā)育至成熟期，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系相比花冠變小、雄蕊變短(圖7:A～B)。同時在雌蕊發(fā)育過程中，相對于野生型株系比較，子房基部多出一節(jié)，且形成畸形種夾型(圖7:C)。分別選取3株轉(zhuǎn)基因株系1、9、11和3株對照株系(每個株系頂端隨機(jī)取5朵花)，測量它們的花冠、柱頭及雄蕊的長度，利用SPSS19.0軟件，采用SNK方差齊性檢驗的方法對其差異顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8，轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系比，雄蕊及花冠顯著變短，上述結(jié)果表明過表達(dá)PI基因影響轉(zhuǎn)基因植株的花器官及果實的發(fā)育。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測 M. DNA marker DL5000；1～10. 10個抗性植株的DNA PCR檢驗；11. ddH2O作為陰性對照Fig.5 PCR detection of transgenic plants M. DNA marker DL5000; 1-10. PCR products of 10 independent transgenic tobacco; 11. ddH2O as a negative control

圖6 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測 WT. 野生型煙草；1～12. 12個PI轉(zhuǎn)基因煙草植株Fig.6 qRT-PCR detection of transgenic plants WT. Wild-type tobacco; 1-12. Twelve PI transgenic tobacco plants

圖7 轉(zhuǎn)基因株系花器官表型分析 A.花冠大小觀察；B.雄蕊大小比較；C.雌蕊子房差異觀察 WT. 野生型對照植株；L1/L9/L11. 3個不同的轉(zhuǎn)基因煙草株系Fig.7 Analysis of floral organ phenotype in transgenic plants A. Corolla size observation; B. Androecium size comparison; C. Ovary observed WT. Wild-type tobacoo; L1/L9/L11. Three different transgenic tobacco lines

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草表型的統(tǒng)計分析 WT.野生型對照；L1/L9/L11. 3個不同的轉(zhuǎn)基因株系Fig.8 Statistic analysis phenotype of transgenic tobacco WT. Wild-type control; L1/L9/L11. Three different transgenic lines

4 討論

自1991年“ABC”模型被提出后，對于被子植物花器官的發(fā)育探究就受到了廣泛的關(guān)注。根據(jù)對這三類功能基因的進(jìn)化程度及生物信息學(xué)分析，表明除A類功能基因中的APETALA2(AP2)基因之外，其它基因都隸屬于MADS-box家族，該家族在氨基酸的C端和N端具有高度的保守性，這表明基因雖然在進(jìn)化程度上略有差異，但行使的特異性功能區(qū)域被保留下來，因此在不同物種中雖然花器官的形態(tài)各異，但其基本結(jié)構(gòu)都大體一致。其中B類功能基因在擬南芥中包括PISTILLATA(PI)和APETALA3(AP3)這兩個基因，它們對于雄蕊和花瓣的發(fā)育發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[15～16]，研究表明B類功能基因缺失，會導(dǎo)致雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮，花瓣則轉(zhuǎn)化為萼片，這就會形成只有心皮和萼片的不完整花器官。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，PISTILLATA(PI)基因在單子葉和雙子葉植物中對花瓣及雄蕊發(fā)育的調(diào)控具有高度保守性[17～19]，但在生物信息學(xué)上分析表明，在不同物種中PI基因的保守區(qū)域高度一致，但在其它區(qū)域則差異性較大，因此PI基因?qū)Σ煌锓N的花瓣及雄蕊發(fā)育的調(diào)節(jié)具有一定的差異，這主要表現(xiàn)在產(chǎn)生多態(tài)性的雄蕊及花瓣。

本實驗為探究擬南芥PI基因異源表達(dá)功能，從擬南芥cDNA中克隆出PI基因，將PI基因轉(zhuǎn)入煙草后發(fā)現(xiàn)了新的表型。在生殖生長階段，與野生型相比，過表達(dá)PI的轉(zhuǎn)基因煙草的花器官發(fā)生了明顯的變化，主要表現(xiàn)在花冠的長度小于對照植株，同時雄蕊長度短于對照植株，通過SPSS軟件分析數(shù)據(jù)顯示變化明顯。這個結(jié)果暗示，PI基因?qū)τ诨ò昙靶廴锏陌l(fā)育是起一定作用的。同時本實驗還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的雌蕊子房基部較野生型長出5～10 mm異常組織且子房畸形，其最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草嚴(yán)重敗育。該現(xiàn)象與Smykal P等人研究的轉(zhuǎn)化SOC1基因的煙草具有相似的性狀[20]，這表明PI基因在促進(jìn)花瓣及雄蕊發(fā)育的同時對心皮的發(fā)育產(chǎn)生了異常的調(diào)控作用，這在性別決定的種子植物中，PI可能具有激活雄性器官發(fā)育并抑制雌性器官發(fā)育[21～22]。研究表明，花瓣是由A類功能基因與B類功能基因共同作用形成的，雄蕊則是B類功能基因基因與C類功能基因共同作用形成的，心皮則是由C類功能基因單獨作用形成的，本實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系的雌蕊基部變長、子房畸形導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系嚴(yán)重敗育，這表明擬南芥PI基因在異源調(diào)控植物的花器官發(fā)育中起到一定的作用，同時也說明擬南芥PI基因可能與煙草中控制心皮發(fā)育的C類功能基因之間存在拮抗作用，而導(dǎo)致此現(xiàn)象。擬南芥PI基因在轉(zhuǎn)基因植物中是通過怎樣的方式促進(jìn)雄蕊發(fā)育的同時抑制了心皮的發(fā)育仍需要進(jìn)一步探究，以期對該現(xiàn)象作出機(jī)理性的闡述，挖掘出其潛在的應(yīng)用價值，為敗育機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

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ConstructionofPlantExpressionVectorandGeneticTransformationAnalysisofArabidopsisthalianaAtPIGeneinNicotianatabacum

LIU Cai-Xia ZHENG Tang-Chun DAI Li-Juan LIU Yi QU Guan-Zheng*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

The flower is the main reproductive organs of the plants, plays an extremely important role in the process of breeding and thePISTILLATA(PI) gene, and as a member of the B functional gene, plays an important role in floral organ development. In order to explore the function ofPIgene in the development of petals and stamens, thePIgene inArabidopsisthalianawas used as the research object, and theAtPIgene was amplified from cDNA by PCR, and the plant expression vector(pROKⅡ-AtPI) was constructed and transformed into tobacco. By PCR, theAtPIgene was integrated into the tobacco genome. The T2 generation plants were detected by qRT-PCR, andAtPIwas also expressed at the level of mRNA. Transgenic tobacco plants exist obvious phenotype compared to wild-type tobacco, such as smaller corolla, shorter stamens, and abnormal ovary, which is 5-10 mm longer than wild-type tobacco. The specific participation in the development of stamens, petals and ovary meanwhile plays a crucial role is geneAtPI.

Arabidopsisthalian;PISTILLATA(PI);Nicotianatabacum;stamen;petal;ovary

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-12-0808)；國家自然科學(xué)基金項目(31370661)資助

劉彩霞(1990—)，女，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail:quguanzheng@yahoo.com

2015-11-25

Q943

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.011