劉軍河　李 娜　魏湘瓔?。ㄉ綎|省淄博市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所　255000）

淄博地區(qū)豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的多重耐藥分析

劉軍河李 娜魏湘瓔（山東省淄博市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所255000）

為了解淄博地區(qū)豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥特點(diǎn)，本研究于2016年4月對(duì)淄博地區(qū)3個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)采集豬糞便棉拭子，分離豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌，14種抗生素藥敏片進(jìn)行藥敏檢測(cè)。共收集236份豬糞便棉拭子樣本，通過(guò)產(chǎn)ESBL確證試驗(yàn)獲得94株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，占豬源大腸桿菌的39.8%。所有產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株耐藥性較強(qiáng)且呈現(xiàn)多重耐藥，對(duì)碳青霉烯類藥物敏感率較高。豬源產(chǎn)ESBL 大腸桿菌分離率高且耐藥譜廣，給臨床中應(yīng)用抗生素的治療豬源大腸桿菌病帶來(lái)很大的障礙。

豬源產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸桿菌耐藥

臨床上抗生素的大量使用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重［1］。其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases， ESBLs）能夠水解第一、二、三代頭孢菌素及氨曲南，是細(xì)菌表現(xiàn)多重耐藥的主要機(jī)制之一［2］。多重耐藥菌的出現(xiàn)使臨床上抗感染治療更加困難［3］。

大腸桿菌病對(duì)幼畜或幼禽常造成嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥，對(duì)豬的危害表現(xiàn)在造成7日齡以內(nèi)的仔豬黃痢、10日齡-1月齡的仔豬白痢和斷奶前后的豬水腫?。?］。因此，了解豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌株的耐藥譜，對(duì)臨床上合理利用抗菌藥物、增強(qiáng)抗感染治療效果意義重大。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來(lái)源2015年4月淄博地區(qū)三個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)采的不同日齡豬的肛門(mén)棉拭子。

1.1.2主要試劑伊紅美藍(lán)瓊脂、麥康凱瓊脂、Mueller-Hintion瓊脂（MH），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.1.3藥敏紙片頭孢他啶（30μg/片）、頭孢他啶/棒酸（10μg/片）、頭孢噻肟（30μg/片）、頭孢噻肟/棒酸（10μg/片）、復(fù)方新諾明（25μg/片）、氨芐西林（10μg/片）、氯霉素（30μg/片）、鏈霉素（10μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、氟苯尼考（30μg/片）、阿莫西林（20μg/片）、頭孢噻吩（30μg/片）、氨曲南（30μg/片）、環(huán)丙沙星（5μg/片）、四環(huán)素（30μg/片）均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1樣品分離向豬糞便棉拭子離心管中加入500μL的生理鹽水，混勻后，劃線接種于含頭孢噻肟的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h。典型菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h。每個(gè)平板只挑取一個(gè)菌落。

1.2.2大腸桿菌的鑒定PCR擴(kuò)增大腸桿菌16S rRNA保守區(qū)域。引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'［5］；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序。

1.2.3產(chǎn)ESBL大腸桿菌的確證試驗(yàn)和藥敏檢測(cè)菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋鶆蛲坎加贛-H培養(yǎng)基上，分別貼頭孢他啶、頭孢他啶/棒酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/棒酸4個(gè)藥敏紙片，37℃孵育18h后觀察結(jié)果。根據(jù)CLSI2009標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)產(chǎn)ESBL菌株表型確證判定。檢測(cè)產(chǎn) ESBL 陽(yáng)性菌株對(duì)其余12種抗生素的敏感性。

2　結(jié)果

2.1豬場(chǎng)產(chǎn)ESBL大腸桿菌的分離從236份豬糞便棉拭子中共分離到94株耐頭孢噻肟大腸桿菌，這94株菌均為產(chǎn)ESBL陽(yáng)性，分離率為39.8%（附圖）。

附圖　產(chǎn)ESBL表型確證試驗(yàn)

附表　豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株耐藥率

2.2產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥性94株產(chǎn)ESBL大腸桿菌對(duì)很多抗生素均呈現(xiàn)高度耐藥性，特別是對(duì)青霉素類和第代頭孢菌素類抗生素如氨芐西林、頭孢噻吩，以及三代的頭孢噻肟均100%耐藥，對(duì)阿莫西林的耐藥率高達(dá)97.8%，95.7%的菌株對(duì)氨曲南表現(xiàn)耐藥。但對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物均表現(xiàn)敏感（見(jiàn)附表）。

3　結(jié)論

（1）產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的菌株耐藥譜廣，自1983年首次報(bào)道后，在養(yǎng)殖動(dòng)物和周圍環(huán)境中檢出率越來(lái)越高，給臨床治療用藥帶來(lái)極大的困難，并且對(duì)人類的健康產(chǎn)生威脅。本研究中采集淄博地區(qū)236份豬糞便棉拭子，經(jīng)分離篩選共獲得94株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，分離率為39.8%，因此超廣譜β-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)普遍存在。（2）94株豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內(nèi)酰胺類的耐藥性都非常高，耐藥率近100%。對(duì)磺胺類和四環(huán)素類也具有高耐藥性，高達(dá)96%左右。氨基糖苷類、喹諾酮類和氟喹諾酮類耐藥率都在75%以上，所以這三類藥物用于治療大腸桿菌病的效果不佳。所有菌株都對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物表現(xiàn)敏感，這是由于我國(guó)禁止將碳青霉烯類藥物應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。

總之，淄博地區(qū)豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥譜廣，均為多重耐藥，大部分已經(jīng)進(jìn)化出了對(duì)新一代頭孢類抗生素的耐藥性，造成此類菌株形成臨床感染治療上、抗生素的選擇將受到更大的限制。因此嚴(yán)格用藥是控制細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要方法；控制豬場(chǎng)的養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)對(duì)豬場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)控，凈化豬場(chǎng)水源和空氣，為防止耐藥菌株傳播提供保障。

［1］ Amyes SGB， Gemmell CG. Antibiotic resistance. J Med Microbiol. 1997， 46∶ 436-470.

［2］ 孫長(zhǎng)貴， 陳漢美. 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展［J］. 國(guó)外抗生素分冊(cè)，2000， 21（3）∶ 111-115.

［3］ 段玉平， 徐興然， 曾忠良等. 豬源大腸桿菌整合子與耐藥性的相關(guān)性研究［J］. 中國(guó)獸藥雜志， 2009， 43（5）∶ 24-26.

［4］ 劉峰. 豬大腸桿菌病防治研究進(jìn)展［J］. 湖南畜牧獸醫(yī)， 2010， 6∶1-3.［5］ 楊滴， 王耀兵等. 糞便中大腸埃希菌的分離鑒定［J］. 微生物學(xué)雜志， 2007， 27（3）∶ 1-5.

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