張 帆　王鵬飛　黃永春

水力空化降解殼聚糖產(chǎn)物分子量分布的研究

張 帆1,2,3王鵬飛1,2,3黃永春1,2,3

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

文章在確定最佳水力空化降解殼聚糖工藝條件的基礎(chǔ)上，采用凝膠滲透色譜法測(cè)定了殼聚糖不同時(shí)間降解產(chǎn)物的分子量分布。結(jié)果表明：水力空化降解殼聚糖的效果明顯，殼聚糖降解產(chǎn)物的分子量下降顯著，降解產(chǎn)物的分散度較原料殼聚糖也有所減小。

殼聚糖；水力空化；凝膠滲透色譜；分子量分布

殼聚糖（Chitosan）是甲殼素經(jīng)脫乙?；蟮玫降漠a(chǎn)物，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖［1］。由于殼聚糖來(lái)源廣泛，且具有優(yōu)良的生物相溶性和可降解性［2］，所以被廣泛地用于化工、環(huán)保、食品、印染、紡織、醫(yī)藥等方面［3，4］。研究表明不同分子量的殼聚糖的性質(zhì)差異很大，殼聚糖的許多功能特性只有當(dāng)分子量降低到一定程度時(shí)才能表現(xiàn)出來(lái)。低聚殼聚糖不僅保持了高聚殼聚糖的某些功能性質(zhì)，還具有某些特殊的生理活性［5］。因此，對(duì)殼聚糖降解方法及其產(chǎn)物分子量分布的研究具有重要的意義。水力空化是高效、簡(jiǎn)單的新型殼聚糖降解方法。筆者所在課題組前期研究表明，水力空化能夠有效地降解殼聚糖［6，7］。

本文采用凝膠滲透色譜法測(cè)定水力空化降解殼聚糖不同時(shí)間降解產(chǎn)物的分子量及分布，為水力空化降解殼聚糖條件的優(yōu)化、降解機(jī)理以及產(chǎn)物調(diào)控研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

殼聚糖：脫乙酰度90.91%，上海卡博工貿(mào)有限公司；冰醋酸：分析純（AR），成都市科龍化工試劑廠；三水合乙酸鈉：分析純（AR），臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司；不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品：T1（w=5200），T2（w=11600），T3（w=23800），T4（w=48600），T5（w=148000），T6（w=273000），T7（w=410000），T8（w=668000），Waters公司。

1.2儀器與設(shè)備

凝膠滲透色譜儀：Waters1515等度高效液相色譜泵；Waters 2414示差折光檢測(cè)器；Ultrahydrogel 250A，500A，1000A色譜柱：尺寸300×7.8mm；Breeze version 3.30色譜工作站；分析天平：BS224 S型，德國(guó)賽多利斯股份公司；隔膜真空泵：GM-0.33，天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠；水力空化裝置：自行研制。

1.3 方法

1.3.1水力空化降解殼聚糖實(shí)驗(yàn)條件的確定

根據(jù)前期對(duì)殼聚糖溶液濃度、溶液pH、反應(yīng)溫度、入口壓力、反應(yīng)時(shí)間、水力空化反應(yīng)裝置結(jié)構(gòu)等因素對(duì)基于文丘里管水力空化降解殼聚糖過(guò)程的影響的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，在殼聚糖溶液濃度為3g·L-1，溶液pH值為4.4，反應(yīng)溫度為40℃，入口壓力為0.4 MPa，反應(yīng)時(shí)間為120min，水力空化反應(yīng)裝置文丘里管的入口角度為60°，出口76°，喉部長(zhǎng)度為10mm，喉部直徑為4mm的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。配置濃度為0.2mol·L-1乙酸-0.1mol·L-1乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.4）3L作為溶劑。稱(chēng)取殼聚糖固體樣品9g，緩慢倒入溶劑中，當(dāng)殼聚糖溶解后，靜置4h ，使殼聚糖能夠充分溶解。

將配置好的3g·L-1的殼聚糖溶液倒入自制的水力空化裝置（如圖1所示），開(kāi)啟泵2，通過(guò)閥門(mén)V1控制進(jìn)口壓力為0.4MPa。開(kāi)啟冷凝水控制反應(yīng)溫度為40℃。

圖1　水力空化設(shè)備示意圖

1.3.2凝膠滲透色譜法測(cè)定殼聚糖的分子量及分子量分布

（1）殼聚糖降解液的預(yù)處理

在上述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解。用移液管每10min取降解產(chǎn)物于25mL具塞試管中，然后利用移液器從試管中精確移取2mL于5mL容量瓶中，加入0.2mol·L-1乙酸-0.1mol·L-1乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.4），定容，得到濃度為1.2mg·mL-1的殼聚糖降解液。然后將此降解液經(jīng)過(guò)0.45μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾后保存于試樣管中待測(cè)。

（2）凝膠滲透色譜的實(shí)驗(yàn)條件

流動(dòng)相：0.2mol·L-1乙酸-0.1mol·L-1乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.4），流動(dòng)相經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾并經(jīng)超聲脫氣。

取經(jīng)過(guò)過(guò)濾后的濃度為1.2mg·mL-1的殼聚糖降解液，進(jìn)樣量為25μL，選擇檢測(cè)器靈敏度為32，控制柱溫為30℃，流速為0.6mL·min-1。

色譜柱：Ultrahydrogel 1000A，500A，250A三根串聯(lián)使用。連接順序按排阻限由大到小連接。

（3）分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別將不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品：T1（Mw=5200），T2（Mw=11600），T3（Mw=23800），T4（Mw=48600），T5（Mw=148000），T6（Mw=273000），T7（Mw=410000），T8（Mw=668000）溶解于流動(dòng)相中，在上述色譜條件下測(cè)定標(biāo)樣，根據(jù)葡聚糖標(biāo)樣分子量的對(duì)數(shù)與其對(duì)應(yīng)的凝膠色譜的保留時(shí)間的關(guān)系，經(jīng)三元線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2　葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品凝膠滲透色譜圖

圖3　葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程為：

1.4數(shù)據(jù)分析

利用Breeze version 3.30色譜工作站與Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2　結(jié)果與討論

通過(guò)試驗(yàn)分別測(cè)定了不同時(shí)間降解產(chǎn)物的分子量及其分布。得到的色譜圖中均含有峰1和峰2。實(shí)驗(yàn)表明，峰2的位置在水力空化降解過(guò)程中始終不發(fā)生變化，只是其信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度大小有變化。通過(guò)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算表明，峰2的Mw為200 Da左右，且其分散度為1.2左右，分散度較為集中，推斷峰2是小分子單糖的峰。峰2后的倒峰為溶劑峰，這里不予討論。峰1在降解前后的位置和形狀均發(fā)生變化。所以，本文討論水力空化降解殼聚糖分子量及其分布的變化指的是峰1的分子量和分布的變化。

圖4　不同時(shí)間降解產(chǎn)物的凝膠滲透色譜圖

圖5　不同時(shí)間降解產(chǎn)物的重均分子量

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同時(shí)間降解產(chǎn)物峰1的保留時(shí)間逐漸變長(zhǎng)，這說(shuō)明水力空化降解殼聚糖產(chǎn)物的分子量是逐漸變小的。結(jié)合表1和圖5可以清楚的看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖的重均分子量Mw逐漸降低。降解產(chǎn)物的重均分子量在0 min～40min時(shí)下降較為顯著，之后趨于平緩。這可能是因?yàn)?，一方面，在反?yīng)的初期殼聚糖的分子鏈較長(zhǎng)，分子量較大，糖苷鍵含量高，分子易于被切斷。隨著降解的深入、分子鏈的斷裂，分子鏈的長(zhǎng)度縮短，分子數(shù)量增多，可降解的糖苷鍵減少，機(jī)械力與空化效應(yīng)對(duì)小分子的降解作用降低，降解速率下降，降解產(chǎn)物的分子量下降速率趨于平緩，這和超聲波降解殼聚糖的結(jié)果是一致的［8］。另一方面，水力空化降解前期，溶液中氣含率較大，空化泡的產(chǎn)生和潰滅導(dǎo)致水分子結(jié)合鍵斷裂產(chǎn)生羥自由基和氫自由基。同時(shí)，空化泡的潰滅產(chǎn)生高溫、高壓及高速微射流，促進(jìn)了降解反應(yīng)的進(jìn)行。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，氣含率降低，空化效應(yīng)明顯減弱，導(dǎo)致了殼聚糖降解速率減緩，分子量的降低也趨于平緩。

圖6　0min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖7　10min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖8　20min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖9　30min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖10　40min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖11　50min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖12　60min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖13　70min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖14　80min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖15　90min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖16　100 min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖17　110 min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

圖18　120 min的殼聚糖的凝膠滲透色譜圖

分子量分布是用來(lái)表征高聚物中不同分子量組分的相對(duì)含量。分子量分布曲線有兩種：一種為積分分布曲線，另一種為微分分布曲線［8］。如圖6至圖18所示即為殼聚糖不同時(shí)間降解產(chǎn)物的分子量微分分布曲線圖。分子量分布曲線圖的橫坐標(biāo)Slice logMW為每個(gè)切片的分子量取以10為底的對(duì)數(shù)，是由原始色譜圖的橫坐標(biāo)轉(zhuǎn)換得到的。寬分布峰被分成多個(gè)切片，每個(gè)切片與標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點(diǎn)相關(guān)，便可計(jì)算出統(tǒng)計(jì)的分子量值，如Mw和Mn等。左側(cè)縱坐標(biāo)dwt/d（logM）是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用公式dwt/d（logM）= （dwt/dV）·（dV/d（logM））轉(zhuǎn)換得到的。表示單位重量分子的重量分?jǐn)?shù)。dwt/dV是單位保留體積對(duì)應(yīng)的重量分?jǐn)?shù)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線為曲線時(shí)，（dV/d（logM））是由標(biāo)準(zhǔn)曲線不同保留體積的切線斜率的倒數(shù)得到的。右側(cè)縱坐標(biāo)Cumulative % 表示每個(gè)切片聚合物的累積百分比。由圖6至圖18可以看出，在反應(yīng)10 min時(shí)，分子量大于Slice logM=5的含量約占80%，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，分子量大于Slice logM=5的含量逐漸降低，到了第120 min時(shí)，其含量約占20%。而120 min時(shí)分子量大于Slice logM=5.5的聚合物的含量已低于5%。由圖6至圖18還可以看出，反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)10 min，峰值對(duì)應(yīng)的Slice logM約為5.75，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，峰值逐漸向小分子量的方向移動(dòng)，到120 min時(shí)，峰值對(duì)應(yīng)的Slice logM約為4.75，也說(shuō)明了水力空化反應(yīng)前所占比例較多的大分子量殼聚糖在逐漸減少，小分子量的殼聚糖在逐漸增加。

圖19　分散度與降解時(shí)間的關(guān)系

由圖19可以看出，殼聚糖降解產(chǎn)物分散度的變化大致可以分為三個(gè)階段，0 min～30 min 快速下降階段，30 min～70 min 時(shí)的波動(dòng)階段，70 min～120 min 的緩慢下降階段，可以看出總體趨勢(shì)是減小的。這可能是因?yàn)樵蠚ぞ厶堑姆稚⒍容^大，殼聚糖分子的大小差別較大。在空化反應(yīng)的0 min～30 min，殼聚糖中的大分子的含量較高，空化效應(yīng)強(qiáng)，降解反應(yīng)主要是大分子的糖苷鍵被破壞，降解為中等分子量和小分子量的分子，此時(shí)大分子迅速減少，這使得分散度迅速下降；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到30 min～70 min，反應(yīng)主要為中等分子量的分子，既生成也被降解的，體系中大分子、中分子以及小分子均占有一定的比例，降解反應(yīng)在各類(lèi)分子中均可發(fā)生，使得分散度沒(méi)有明顯下降而表現(xiàn)為上下波動(dòng)；隨著降解反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行，到了70 min～120 min 時(shí)，大分子量的分子幾乎被完全降解，降解主要發(fā)生在中分子，小分子量的分子逐漸增多，此時(shí)的殼聚糖分子大小也趨于一致，這就表現(xiàn)為分散度與分子量大小同步減小。筆者還可以看出，當(dāng)反應(yīng)到120 min時(shí)，分散度為3.87，并沒(méi)有達(dá)到1左右，這可能是由于空化的強(qiáng)度減弱，能夠有效切斷小分子量殼聚糖中糖苷鍵的難度加大，使得小分子量的分子難于繼續(xù)降解，分子間的大小差別也變化不大。

表1　不同時(shí)間降解產(chǎn)物分子量及分散度

3　結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)水力空化降解的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行研究，得到優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件為殼聚糖溶液濃度為3g·L-1，溶液pH值為4.4，反應(yīng)溫度為40℃，入口壓力為0.4MPa，反應(yīng)時(shí)間為120min，水力空化反應(yīng)裝置文丘里管的入口角度為60°，出口76°，喉部長(zhǎng)度為10mm，喉部直徑為4mm。

通過(guò)凝膠滲透色譜法測(cè)定了水力空化降解殼聚糖不同時(shí)間產(chǎn)物的分子量及其分布。結(jié)果表明，水力空化可以有效降解殼聚糖。殼聚糖的數(shù)均分子量、重均分子量、z均分子量、z+1均分子量均有顯著下降。并且水力空化降解殼聚糖的產(chǎn)物的分子量分布變窄，分散度由6.96下降到3.87。

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Study on the molecular weight distribution of the degradation of chitosan by hydrodynamic cavitation

In this paper， based on the optimum conditions for the degradation of chitosan by hydrodynamic cavitation， the molecular weight distribution of the chitosan degradation products at different time was determined by gel permeation chromatography. The results showed that the effect of hydrodynamic cavitation on the degradation of chitosan was obvious， the molecular weight of chitosan degradation products decreased significantly， and the degree of dispersion of the degradation products decreased compared with the raw chitosan.

Chitosan； hydrodynamic cavitation； gel permeation chromatography； molecular weight distribution

Q53

A

1008-1151（2016）02-0068-06

2016-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160348）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃（桂教人〔2014〕7 號(hào)）。

張帆（1989－），女，廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)樯镔Y源加工及過(guò)程強(qiáng)化。