張珊珊，康洪梅，楊文忠，向振勇

( 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201 )

?

干旱脅迫下AMF對云南藍(lán)果樹葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

張珊珊，康洪梅，楊文忠*，向振勇

( 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201 )

苯菌靈為殺真菌劑，在土壤含水量為32.32%、29.63%、25.86%、19.39%、12.93%和6.46%的條件下，分別添加苯菌靈和不添加苯菌靈，形成“低AMF”和“高AMF”處理。該研究以云南藍(lán)果樹幼苗葉片為材料，利用盆栽試驗(yàn)研究了干旱脅迫下叢枝菌根真菌(AMF)對云南藍(lán)果樹幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)及抗旱性的影響。結(jié)果表明：添加苯菌靈處理顯著降低了不同水分處理?xiàng)l件下AMF侵染率，隨著干旱脅迫程度加劇，云南藍(lán)果樹幼苗根部的AMF侵染率顯著降低。輕度脅迫條件下(土壤含水量為29.63%)，葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)未發(fā)生顯著變化；土壤含水量低于25.86%，云南藍(lán)果樹幼苗表現(xiàn)出較高的抗旱性，苯菌靈處理可以顯著影響葉片角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度和上表皮厚度等7個葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)，證明了高AMF可以增強(qiáng)代表云南藍(lán)果樹幼苗葉片抗旱性的結(jié)構(gòu)性狀。土壤含水量為25.86%、19.39%和12.93%時(shí)苯菌靈處理的效果較土壤含水量為6.46%時(shí)更顯著，這是因?yàn)?.46%的土壤含水量嚴(yán)重抑制AMF的侵染，說明AMF侵染程度會影響云南藍(lán)果樹幼苗的抗旱性。進(jìn)一步用隸屬函數(shù)值法對10個葉片性狀進(jìn)行綜合評價(jià)，發(fā)現(xiàn)高AMF處理可增強(qiáng)云南藍(lán)果樹幼苗的抗旱性。該研究結(jié)果為AMF在瀕危物種云南藍(lán)果樹保護(hù)過程中的合理利用提供了理論依據(jù)。

云南藍(lán)果樹, 瀕危植物, 干旱脅迫, 葉片解剖結(jié)構(gòu), 叢枝菌根真菌, 植物保護(hù)

干旱脅迫是影響植物生長發(fā)育、生產(chǎn)力和光合作用等的重要環(huán)境因子(Rigoberto et al，2004；Smorenburg et al，2003)。特別是隨著世界氣候的急劇變化，全球溫室效應(yīng)加劇，導(dǎo)致很多地區(qū)干旱發(fā)生(Meehl & Tebaldi，2004；Sch?rc et al，2004)，并引發(fā)森林天然更新困難甚至死亡(Allen et al，2010；Barbeta and Peuelas，2013)。干旱脅迫對瀕危植物會產(chǎn)生毀滅性的影響(約下降16%)(Bartholomeus et al，2011)，因?yàn)闉l危物種大多表現(xiàn)為適宜分布區(qū)狹窄、對生境要求較高及抗逆性較差等特點(diǎn)(Lawler et al，2002)。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)在植物抗旱過程中通過改善植物的養(yǎng)分平衡和水分利用效率，改善植物營養(yǎng)狀況，增加植物幼苗的株高和生物量等生長指標(biāo)(楊振寅和廖聲熙，2005)，增強(qiáng)植物的抗旱能力(吳強(qiáng)盛等，2005；楊振寅和廖聲熙，2005)。在植物生長發(fā)育過程中葉片解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)最能反映出植物的抗旱程度，且多項(xiàng)參數(shù)都與植物抗旱性相關(guān)，如葉片角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度和氣孔數(shù)量等(李芳蘭和包維楷，2005；季孔庶等，2006；郭改改等，2013；任媛媛等，2014)。那么，干旱脅迫下AMF如何通過影響葉片結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其抗旱性，尚未見有相關(guān)報(bào)道。

云南藍(lán)果樹(Nyssayunnanensis)為藍(lán)果樹科(Nyssaceae)藍(lán)果樹屬(NyssaGronov ex Linn.)，現(xiàn)存天然種群及幼苗數(shù)量都極少，天然更新困難，瀕臨滅絕，屬于極小種群野生植物(陳偉等，2011)。從前期調(diào)查研究的結(jié)果看，云南藍(lán)果樹主要分布于溪流邊，且有部分根露于溪流中，唯一發(fā)現(xiàn)的幼苗也分布于溪流邊。前期幼苗培育實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，云南藍(lán)果樹幼苗對土壤含水量要求較高，當(dāng)土壤含水量稍低時(shí)，葉片即呈現(xiàn)下垂、萎焉狀態(tài)，嚴(yán)重時(shí)，植株地上部分或是全株死亡。云南藍(lán)果樹原生境在內(nèi)的大量天然林不斷被橡膠、咖啡、茶葉等經(jīng)濟(jì)林所取代，其適生地的小氣候被改變，因此導(dǎo)致云南藍(lán)果樹旁邊的溪流干涸。尤其是西雙版納地區(qū)自1974-2003年來平均氣候情況為9月份至次年2月份，均處于旱季 (劉文杰和李紅梅，1997)。因此，筆者假設(shè)日益干旱的氣候以及導(dǎo)致的土壤水分含量下降，也許是其導(dǎo)致滅絕的原因之一。植物葉片的結(jié)構(gòu)將能準(zhǔn)確地反映出其對生存環(huán)境適合度的高低，然而云南藍(lán)果樹葉片應(yīng)對干旱脅迫時(shí)解剖結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，以及AMF又起到如何的調(diào)節(jié)作用，尚未見報(bào)道。因此，本研究以云南藍(lán)果樹幼苗葉片為材料，利用盆栽試驗(yàn)研究云南藍(lán)果樹在干旱脅迫下葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化及AMF在此過程中的調(diào)節(jié)作用，闡述云南藍(lán)果樹應(yīng)對干旱脅迫的機(jī)制，為其瀕危機(jī)制研究提供理論依據(jù)。本研究選用苯菌靈為殺真菌劑，研究干旱脅迫條件下AMF對極小種群野生植物云南藍(lán)果樹葉片解剖結(jié)構(gòu)及抗旱性的影響，探求云南藍(lán)果樹保護(hù)的菌根學(xué)途徑。

1　材料與方法

1.1 材料

選擇云南藍(lán)果樹1年實(shí)生幼苗作為研究對象。2013年4月中旬將生長基本一致的幼苗移栽到容積為10 L的花盆中，每盆1株，栽培基質(zhì)為云南省林業(yè)科學(xué)院苗圃紅壤。用紅壤于次氯酸鈉(NaClO)中浸泡48 h，洗凈后120 ℃烘8 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究于云南省林業(yè)科學(xué)院溫室條件下進(jìn)行，自然溫度和自然光照，水分人工控制，為2因子(AMF×水分)試驗(yàn)。AMF處理為施加苯菌靈(低AMF)和不加苯菌靈(對照，高AMF)，對于施加苯菌靈處理，將2 g殺真菌劑苯菌靈溶于2 L自來水，加到盆缽中，每月處理1次，獲得低AMF處理的土壤，同時(shí)在對照處理的盆缽中每次均加入相同量的自來水?；谠囼?yàn)土壤的田間持水量(32.32%)，水分設(shè)置6 個水平(32.32%、29.63%、25.86%、19.39%、12.93%和6.46%)，分別用W1，W2，W3，W4，W5和W6表示，共得到2(AMF)×6(水分)=12 個處理，每個處理10 個重復(fù)，共有120 個盆缽。實(shí)驗(yàn)期限為3個月，2014年7月中旬采樣，測定相應(yīng)指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 AMF侵染率的測定取部分新鮮根部樣品固定于FAA溶液中(37%甲醛-冰醋酸-50%乙醇溶液，體積比 9∶0.5∶0.5)用于檢測AMF侵染率。先將根部的固定液清洗干凈，然后浸泡在10%的KOH中，90 ℃水浴加熱5 min，然后用1%的鹽酸酸化15 min，并用酸性品紅染色過夜，將根部剪成 2 cm長的根段，在顯微鏡下10倍物鏡觀察，用十字交叉法計(jì)算侵染率。侵染率的計(jì)算公式：

侵染率= 侵染根段長度/根段總長度×100%。

1.3.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在幼苗第2、第3葉片切取0.5 cm2的葉片組織進(jìn)行測定，用FAA固定液固定，番紅-固綠對染。在Leica光學(xué)顯微鏡下用目鏡測微尺測量葉片總厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和下表皮厚度等結(jié)構(gòu)特征，所有觀測值均為30個視野的平均值。

葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度=柵欄組織厚/葉片總厚度×100%；葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度=海綿組織厚/葉片總厚度×100%。

1.3.3 氣孔密度觀察在新鮮葉片樣品下表面涂一層快干膠，干燥后將膠膜取下，放在干燥載玻片上，蓋好蓋玻片，在顯微鏡10倍物鏡下觀察。每個植株采集3個葉片，每個葉片隨機(jī)測定10個視野求其平均值，每個處理共獲得(3×10×5)150個數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用雙因素方差分析，比較AMF處理和干旱脅迫處理對云南藍(lán)果樹幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響，并在確定主效應(yīng)是否顯著的基礎(chǔ)上，說明水分與AMF之間是否對葉片結(jié)構(gòu)各參數(shù)存在交互效應(yīng)。方差分析時(shí)，不滿足方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)通過 [arcsin]或 [log(x+1)]轉(zhuǎn)換以滿足方差分析的要求。采用Post-hoc Tukey法檢驗(yàn)變量的顯著性，如果數(shù)據(jù)不滿足參數(shù)檢驗(yàn)條件，就采用Kruskall-Wallis法檢驗(yàn)。5%為顯著水平，1%為極顯著水平。所有數(shù)據(jù)都通過SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、Pearson相關(guān)系數(shù)分析和主成分分析。其中，隸屬函數(shù)值具體公式：

X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)的絕對值。式中，X表示各指標(biāo)的測定值，Xmax和Xmin分別表示各處理?xiàng)l件下指標(biāo)的最大和最小測定值。

2　結(jié)果與分析

2.1 叢植菌根真菌侵染率

表1顯示，施加苯菌靈處理顯著降低了AMF對云南藍(lán)果樹幼苗根部的侵染率，形成低AMF處理(F=38.141，P<0.01)；不施加苯菌靈的處理則形成高AMF處理。無論是高AMF處理還是低AMF處理，AMF侵染率都隨著土壤水分含量的降低顯著下降(F=11.093，P<0.01；F=37.175，P<0.01)。

2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

不同水分處理?xiàng)l件下，采集云南藍(lán)果樹苗期葉片在電鏡下觀察組織解剖結(jié)構(gòu)特征(表1)。由表1可知，它們在不同處理?xiàng)l件下所表現(xiàn)出的葉片組織結(jié)構(gòu)特征差異顯著。AMF處理和水分處理在葉片解剖結(jié)構(gòu)的10個指標(biāo)上都差異顯著，但AMF處理和水分處理的交互作用只對葉片的角質(zhì)層厚度、上表皮厚度、柵海比和氣孔密度產(chǎn)生顯著影響。

表2顯示，在測定葉片解剖結(jié)構(gòu)的10個指標(biāo)中，無論是高AMF處理還是低AMF處理，3個指標(biāo)(柵欄組織厚度、柵欄組織海綿組織厚度比和氣孔密度)在土壤水分W3處理時(shí)開始出現(xiàn)拐點(diǎn)，2個指標(biāo)(葉片厚度和角質(zhì)層厚度)在土壤水分W4處理時(shí)開始出現(xiàn)拐點(diǎn)，3個指標(biāo)(上表皮厚度、下表皮厚度和海綿組織厚度)在土壤水分W5處理時(shí)開始出現(xiàn)拐點(diǎn)，葉片結(jié)構(gòu)緊密度不受土壤含水量的任何影響。因此，當(dāng)土壤水分為W3時(shí)，云南藍(lán)果樹葉片的結(jié)構(gòu)就開始表現(xiàn)出對干旱脅迫的抗逆響應(yīng)，雖然各個指標(biāo)對不同水分處理的響應(yīng)時(shí)間有差異。

表 1　葉片解剖性狀的方差分析

注：*. 在0.05水平上相關(guān)性顯著(雙側(cè)檢驗(yàn))；**. 在0.001水平上相關(guān)性顯著(雙側(cè)檢驗(yàn))；ns. 在0.05水平上相關(guān)性不顯著。下同。

Note: *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed); **. Correlation is significant at the 0.001 level (2-tailed); ns. Correlation is not significant at the 0.05 level (2-tailed). The same below.

表 2　葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的測定結(jié)果

注：同行不同小寫字母表示在不同水分條件下葉片的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)在P<0.05水平的差異顯著；同列不同大寫字母表示在不同AMF處理下葉片的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)在P<0.05水平的差異顯著。

Note: Different lowercase letters in the same line meant significant differences at 0.05 level; Different capital letters in the same column meant significant differences at 0.05 level.

表 3　云南藍(lán)果樹葉片解剖性狀的相關(guān)系數(shù)矩陣

在測定的葉片解剖結(jié)構(gòu)的10個指標(biāo)中，AMF處理對不同土壤水分條件下幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的影響也不同(表2)。W1條件下AMF處理對2個指標(biāo)(角質(zhì)層厚度和柵欄組織厚度)有顯著影響；W2條件下AMF處理對5個指標(biāo)(角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、上表皮厚度、柵海比和葉片結(jié)構(gòu)緊密度)有顯著影響；W3條件下AMF處理對7個指標(biāo)(角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、上表皮厚度、柵海比、葉片結(jié)構(gòu)緊密、海綿組織厚度和葉片結(jié)構(gòu)疏松度)有顯著影響；W4條件下AMF處理對7個指標(biāo)(角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、上表皮厚度、柵海比、葉片結(jié)構(gòu)緊密、海綿組織厚度和葉片結(jié)構(gòu)疏松度)有顯著影響；W5條件下AMF處理對8個指標(biāo)有顯著影響；W6條件下AMF處理對8個指標(biāo)(角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、上表皮厚度、柵海比、葉片結(jié)構(gòu)緊密、海綿組織厚度、葉片結(jié)構(gòu)疏松度和氣孔密度)有顯著影響。因此，AMF處理從土壤含水量處理為W3時(shí)便開始顯著影響葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的特征值，高AMF處理顯著增加了云南藍(lán)果樹幼苗的抗旱性。

表 5　不同AMF處理?xiàng)l件下的主成分分析表

表 6　不同AMF處理?xiàng)l件下的成分得分系數(shù)矩陣

以上結(jié)果說明，云南藍(lán)果樹幼苗隨著干旱脅迫的加劇，其葉片各組織均表現(xiàn)出一定抗旱響應(yīng)。

表 7　葉片解剖結(jié)構(gòu)抗旱性綜合評分值

2.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)間相關(guān)性分析

由表3相關(guān)分析看出，(1)AMF侵染率與角質(zhì)層厚度和上表皮厚度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.924和0.880；與柵海比呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.741；與海綿組織厚度和葉片結(jié)構(gòu)疏松度呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.813。(2)海綿組織厚度與角質(zhì)層厚度呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.789。(3)上表皮厚度與角質(zhì)層厚度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.923。(4)柵海比與角質(zhì)層厚度和柵欄組織厚度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.786和0.827；與海綿組織厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.882。(5)葉片結(jié)構(gòu)緊密度和海綿組織厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.837；與柵海比呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.859。(6)葉片結(jié)構(gòu)疏松度與角質(zhì)層厚度、上表皮厚度和柵海比呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.765、-0.787和-0.794；與柵欄組織厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.855。(7)葉片其余解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)間雖然存在一定的或正或負(fù)的相關(guān)性，但均未達(dá)到顯著水平。

2.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)的主成分分析

用主成分分析法對10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析，根據(jù)各主成分中每個指標(biāo)載荷量及其變異系數(shù)的大小篩選出具有代表性的指標(biāo)。由表4可知，低AMF和高AMF處理?xiàng)l件下巴特利特球度檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的觀測值分別為171.742和200.090，相應(yīng)的概率都接近0，因此認(rèn)為相關(guān)系數(shù)矩陣與單位陣有顯著差異。KMO值分別為0.731和0.787，由Kaiser給出KMO度量標(biāo)準(zhǔn)可知，原有變量都適合進(jìn)行主成分分析。選擇水分處理W3為代表進(jìn)行主成分分析。

從表5和表6可以看出，低AMF處理?xiàng)l件下，云南藍(lán)果樹幼苗第2個主成分特征值為2.405，累計(jì)貢獻(xiàn)率為70.657%，說明干旱脅迫下低AMF對云南藍(lán)果樹的前2個主因子基本上能概括10個變量的主要信息，所以共提取了2個主成分因子。各指標(biāo)對應(yīng)于1個主成分因子得分系數(shù)有極大差異，得分越高的指標(biāo)說明其對主成分的貢獻(xiàn)越大，其典型性越強(qiáng)。表3：a和表3：b顯示，在確定主成分因子數(shù)量后，第一主成分中，柵海比和海綿組織得分較高，分別是0.946和-0.945；第二主成分中，特征向量系數(shù)按照絕對值大小依次排列，得分最高的分別為葉片結(jié)構(gòu)疏松度和葉片結(jié)構(gòu)緊密度，分別是-0.704和-0.709。

從表5和表6還可看出，高AMF處理?xiàng)l件下，云南藍(lán)果樹幼苗第2個主成分特征值為2.259，累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.420%，說明干旱脅迫下高AMF對云南藍(lán)果樹的前2個主因子基本上能概括10個變量的主要信息。在第一、第二主成分中，將2個主成分的特征向量系數(shù)按照絕對值大小依次排列，第一主成分居前2位的分別為葉片結(jié)構(gòu)疏松度和葉片結(jié)構(gòu)緊密度，得分均為-0.998，綜合反映了云南藍(lán)果樹幼苗的抗旱能力；第二主成分居前2位的分別為上表皮厚度和葉片厚度，得分分別為0.972和0.979。這些指標(biāo)主要反映葉片的表皮特征和組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2.5 干旱脅迫下AMF對云南藍(lán)果樹幼苗抗旱性的影響

通過對上述10個葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的綜合分析，不同處理下云南藍(lán)果樹幼苗抗旱性的隸屬函數(shù)結(jié)果列于表7。從表7可以看出，土壤水分含量在W1-W6范圍時(shí)，高AMF處理都增加了云南藍(lán)果樹幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的隸屬函數(shù)值，隸屬函數(shù)值分別為0.50、0.53、0.52、0.54、0.53和0.46，增強(qiáng)了其在各水分處理?xiàng)l件下的抗旱性。

3　討論與結(jié)論

關(guān)于AMF提高植物抗旱性的機(jī)理有多種解釋(唐明等，1999；徐秀梅等，2002；陳冬青等，2013；吳強(qiáng)盛等，2004；吳強(qiáng)盛和夏仁學(xué)，2005)，主要通過改善植株對土壤水分的吸收和利用、增強(qiáng)植株對養(yǎng)分的吸收(Nelsen & Safir，1982；Fitter，1988)和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(Ruiz et al，2001)等過程來調(diào)控植物生長(龐杰等，2013)，進(jìn)而增強(qiáng)抗旱能力。本試驗(yàn)中采用苯菌靈滅菌的方法來抑制AMF對云南藍(lán)果樹幼苗根系的侵染(陳冬青等，2013)，從而可以解釋本試驗(yàn)中AMF處理導(dǎo)致的葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異。

葉片作為對生境變化最為敏感的器官之一，其形態(tài)結(jié)構(gòu)會根據(jù)外界環(huán)境特征作出相應(yīng)調(diào)整(王勛陵等，1989；王淼等，2001；章英才等，2003；黨曉宏等，2013)。柵欄組織越發(fā)達(dá)，葉片結(jié)構(gòu)緊密度越大，植物耐旱性越強(qiáng)(李曉燕等，1999；楊九艷等，2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫的加劇，云南藍(lán)果樹幼苗葉片結(jié)構(gòu)的10個指標(biāo)都發(fā)生了不同程度的變化，在葉片解剖結(jié)構(gòu)上主要表現(xiàn)為葉片增厚，細(xì)胞排列緊密，柵欄組織海綿組織厚度比增大，氣孔密度減少等。輕度脅迫下差異不顯著，但重度脅迫下(土壤含水量小于25.86%)云南藍(lán)果樹葉片的解剖結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著變化，W6(6.46%)處理的葉片結(jié)構(gòu)性狀與W1(32.32%)處理的解剖結(jié)構(gòu)差異均顯著。

AMF可提高宿主植物的抗旱性，侵染率越高，效果越明顯(唐明等，1999)。Kaya et al(2003)研究表明水分會影響叢枝菌根侵染率。但是，輕度干旱脅迫對AMF的侵染和菌絲的發(fā)育影響不大，只有重度干旱脅迫才會限制AMF的侵染，進(jìn)而降低共生體的抗旱性(王曙光等，2001)。本研究表明，隨著干旱脅迫的加劇，AMF處理會顯著影響越來越多的葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)。土壤含水量為25.86%時(shí)，高AMF處理下的葉片角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、上表皮厚度、柵欄組織海綿組織厚度比、葉片結(jié)構(gòu)緊密度、海綿組織厚度和葉片機(jī)構(gòu)疏松度7個指標(biāo)開始顯著高于低AMF處理?xiàng)l件下的指標(biāo)值，至土壤含水量為19.39%、12.93%和6.46%三種水分條件為止，沒有出現(xiàn)新的指標(biāo)對AMF處理作出反應(yīng)，意味著土壤含水量25.86%是云南藍(lán)果樹開始表現(xiàn)抗旱性的水分條件閾值，可以作為對云南藍(lán)果樹幼苗進(jìn)行干旱脅迫響應(yīng)機(jī)理分析的依據(jù)。另外，W3(25.86%)、W4(19.39%)和W5(12.93%)處理?xiàng)l件下苯菌靈處理的效果較W6(6.46%)處理時(shí)更顯著，這是因?yàn)闃O度干旱脅迫嚴(yán)重抑制AMF的侵染，而AMF侵染程度會影響云南藍(lán)果樹幼苗的抗旱性。而且，AMF處理與云南藍(lán)果樹幼苗多個葉片解剖結(jié)構(gòu)特征值之間具有顯著相關(guān)性，顯著增強(qiáng)了植株的抗旱性；AMF侵染率與云南藍(lán)果樹幼苗葉片的角質(zhì)層厚度、海綿組織厚度、上表皮厚度等5個葉片解剖結(jié)構(gòu)性狀呈顯著相關(guān)，隨著AMF侵染率的升高，角質(zhì)層厚度、上表皮厚度和柵海比數(shù)值會顯著增加，而海綿組織厚度和葉片結(jié)構(gòu)疏松度則會顯著降低，證明了高AMF可以增強(qiáng)代表云南藍(lán)果樹幼苗葉片抗旱性的形態(tài)結(jié)構(gòu)性狀。

主成分分析和隸屬函數(shù)值法已被廣泛用于植物抗逆性的綜合評價(jià)(馬生全等，2006；許桂芳等，2009；劉濱等，2013)。本實(shí)驗(yàn)通過對云南藍(lán)果樹葉片的10個結(jié)構(gòu)指標(biāo)的測定分析，發(fā)現(xiàn)柵欄組織海綿組織厚度比、海綿組織厚度、葉片結(jié)構(gòu)疏松度和葉片結(jié)構(gòu)緊密度葉片厚度是反映高AMF條件下抗旱性結(jié)構(gòu)的主要因子，葉片結(jié)構(gòu)疏松度、葉片結(jié)構(gòu)緊密度、上表皮厚度和葉片厚度是反映低AMF條件下抗旱性結(jié)構(gòu)的主要因子，而這些因子與植物的水分生理指標(biāo)有著直接的關(guān)系(崔宏安等，2008；朱栗瓊等，2007；江川等，2011)，因此我們認(rèn)為可以分別用以上指標(biāo)評價(jià)植物的抗旱性。在此基礎(chǔ)上，本研究用隸屬函數(shù)值法進(jìn)行了綜合評價(jià)。結(jié)果顯示，不管土壤水分條件如何(從W1到W6)，AMF處理都顯著影響了幼苗的抗旱性，即高AMF處理下幼苗的平均隸屬函數(shù)值更高，具有更強(qiáng)的抗旱性。

綜合分析表明，干旱以及干旱脅迫下叢枝菌根真菌共生體形成的抑制一定程度上限制了云南藍(lán)果樹的天然更新，進(jìn)而導(dǎo)致其瀕危。結(jié)合云南藍(lán)果樹逐漸干旱的原生境，以往濕潤的熱帶雨林氣候已發(fā)生明顯變化，導(dǎo)致云南藍(lán)果樹與AMF共生體的形成很可能會受到嚴(yán)重影響，進(jìn)而影響到物種本身的抗旱性。因此，輕度脅迫條件下，云南藍(lán)果樹幼苗葉片不會表現(xiàn)顯著抗旱性特征會導(dǎo)致此物種天然更新困難；重度干旱脅迫條件下，云南藍(lán)果樹幼苗會表現(xiàn)出一定的抗旱性，但卻因?yàn)樯持袠O低的土壤含水量會顯著抑制AMF的侵染，日漸減弱的抗旱效果必然會導(dǎo)致物種處境岌岌可危，若不加以適當(dāng)保護(hù)，此物種必將滅絕。因此，亟需對云南藍(lán)果樹開展科學(xué)有效的保護(hù)。雖然對云南藍(lán)果樹開展了一系列保護(hù)措施，如就地保護(hù)、近地保護(hù)、遷地保護(hù)和回歸引種等，但保護(hù)成效并不顯著。基于本研究AMF可以增強(qiáng)云南藍(lán)果樹抗旱性的研究結(jié)果，建議對保護(hù)地的云南藍(lán)果樹施加AMF菌劑，然而AMF菌劑應(yīng)用仍然存在許多問題，需要再作進(jìn)一步研究。

BARTHOLOMEUS RP, WITTE JMW, BODEGOM PM, et al, 2011. Climate change threatens endangered plant species by stronger and interacting water-related stresses [J]. J Grophys Res, 116: G04023.CHEN DQ，HUANGPU CH，LIU HM，et al, 2013. Effects of water stress and fungicide on the growth and drought resisitance ofFlaveriabidentis[J]. Acta Ecol Sin，33(7)：2113-2120. [陳冬青，皇甫超河，劉紅梅，等，2013. 水分脅迫和殺真菌劑對黃頂菊生長和抗旱性的影響 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，33(7)：2113-2120.]

CHEN W，SHI FQ，YANG WZ，et al, 2011. Population status and ecological characteristics ofNyssayunnanensis[J]. J NE For Univ，39(9)：17-19，61. [陳偉，史富強(qiáng)，楊文忠，等，2011. 云南藍(lán)果樹的種群狀況及生態(tài)習(xí)性 [J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39(9)：17-19.]

CUI HA，BAI HX，DING HR，et al, 2008. Study on anatomical structure ofPlatanusoccidentali[J]. J NW Forest Univ，23(6)：66-68. [崔宏安，白紅霞，丁虹茹，等，2008. 一球懸鈴木葉結(jié)構(gòu)的解剖研究 [J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，23(6)：66-68.]

DANG XH，GAO Y，YU Y，et al, 2013. Effect of drought stress on anatomical structure of leave and physiological characteristics in threeAtriplexL. seedling [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，34(5)：976-987. [黨曉宏，高永，虞毅，等, 2013. 3種濱藜屬牧草苗期葉片解剖結(jié)構(gòu)及生理特性對干旱的響應(yīng) [J]. 西北植物學(xué)報(bào)，34(5)：976-987.]FITTER AH, 1988. Water relations of red cloverTrifoliumpratenseL. as affected by VA mycorrhizal infection and phosphorus supply before and during drought [J]. J Exp Bot, 39: 595-603.

GUO GG，F(xiàn)ENG B，MA BL，et al, 2013. Leaf anatomical structures of different regionalAmygdaluspedunculataPall. and their drought resistance analysis [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，33(4)：720-728. [郭改改，封斌，麻保林，等，2013. 不同區(qū)域長柄扁桃葉片解剖結(jié)構(gòu)及其抗旱性分析 [J]. 西北植物學(xué)報(bào)，33(4):720-728.]JI KS，SUN ZY，F(xiàn)ANG Y, 2006. Research advance on the drought resistant in forest [J]. J Nanjing For Univ：Nat Sci Ed，30(6)：123-128. [季孔庶，孫志勇，方彥，2006. 林木抗旱性研究進(jìn)展 [J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，30(6):123-128.]

JIANG CH，LUO DQ，WANG LH，2011. Drought resistant characteristics of leaf structures of five shrubs in semiarid region of Tibet [J]. J NW For Univ，26(4)：13-17. [江川，羅大慶，王立輝，2011. 西藏半干旱區(qū)5種灌木葉片結(jié)構(gòu)的抗旱特征研究 [J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，26(4):13-17.]

KAYA C, HIGGS D, KIRNAK H, et al, 2003. Mycorrhizal colonization improves fruit yield and water use efficiency in watermelon (Citrullus lanatus) grown under well-watered and water-stressed conditions [J]. Plant Soil，253-287，292.

LAWLER JJ，CAMPBELL SP，GUERRY AD，et al. 2002. The scope and treatment of threats in endangered species recovery plans [J]. Ecol Appl，12: 663-667.

LI FL，BAO WK，2005. Responses of the morphological and anatomical structure of the plant leaf to environment change [J]. Chin Bull Bot，22(S1)：118-127. [李芳蘭，包維楷，2005. 植物葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)對環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng) [J]. 植物學(xué)通報(bào)，22(S1):118-127.]

LI XY，LI LG，LIU ZH，et al, 1994. A study on the relation of tissue structure and drought resistance on grape leaf [J]. J Inn Mongolia Ins Agr & Anim Husb，15(3)：30-32. [李曉燕，李連國，劉志華，1994. 騰格里沙漠主要旱生植物旱性結(jié)構(gòu)的初步研究 [J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，15(3):30-32].

LIU B，PENG L，ZHENG LP，et al, 2013. Drought resistance study of 10 major ornamental shrub in Ningxia [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，33(9)：1808-1816. [劉濱，彭勵，鄭麗萍，2013. 寧夏10種觀賞灌木葉片解剖結(jié)構(gòu)及其抗旱性綜合評價(jià) [J]. 西北植物學(xué)報(bào)，33(9):1808-1816.]

LIU WJ，LI HM. 1997. Tourist climate resources in Xishuangbanna [J]. Nat Resour，2：62-66. [劉文杰，李紅梅，1997. 西雙版納的旅游氣候 [J]. 自然資源，2: 62-66.]

MA SQ，GONG ZT. 2006. The research advances in fuzzy complex analysis [J]. Math Pract & Theory，36(5)：200-211. [馬生全，鞏增泰，2006. 模糊復(fù)雜分析學(xué)的研究進(jìn)展 [J]. 數(shù)學(xué)的實(shí)踐與認(rèn)識，36(5):200-211.]

MEEHL GA, TEBALDI C, 2004. More intense，more frequent，and longer lasting heat waves in the 21st Century [J]. Science, 305: 994-997.

NELSEN CE, SAFIR GR, 1982. The water relations of well-watered, mycorrhizal and nonmycorrhizal onion phants [J]. J Am Soc Hortic Sci, 107: 71-74.

PANG J，ZHANG FL，HAO LZ，et al. 2013. Effect of drought stress on anatomical structure and photosynthesis ofPugioniumcornutum(L. ) Gaertn. leaves in seedling [J]. Ecol & Environ Sci，22(4)：575-581. [龐杰，張鳳蘭，郝麗珍，等，2013. 沙芥幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)和光合作用對干旱脅迫的響應(yīng) [J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，22(4):575-581]

REN YY，LIU YP，WANG N，et al, 2014. The relationship between leaf anatomic structure and drought resistance of nine broadleaf plants [J]. J Nanjing For Univ: Nat Sci Ed，38(4)：64-68. [任媛媛，劉艷萍，王念，等，2014. 9種屋頂綠化闊葉植物葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗旱性的關(guān)系 [J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版，38(4):64-68.]

RIGOBERTO RS, JOSUE AAG, CALROS TL, et al, 2004. Biomass distribution, maturity acceleration and yield in drought stressed common bean cultivars [J]. J Field Crop Res, 85: 203-211.

RUIZ, LOZANO JM, COLLADOS C, et al, 2001. Cloning of cDNAs encoding SODs from lenuce plants which show differential regulation by arbuscular mycorrhizal symbiosis and by drought stress [J]. J Exp Bot, 52: 2241-2242.

SMORENBURG K, COURREGES-LACOSTE GB, BERGER M, et al, 2003. Practical applications of chlorophyll fluorescence in plant biology [M]. Boston, Dordrecht, London: Kluwer Academic Publishers, 42: 178-190.

TANG M，CHEN H，SHANG HS, 1999. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) onHippophaerhamnoidesdrought resis tance [J]. Sci Silv Sin，35(3)：48-52. [唐明，陳輝，商鴻生，1999. 叢枝菌根真菌對沙棘抗旱性的影響 [J]. 林業(yè)科學(xué)，35(3):48-52.]

WANG M，DAI LM，JI LZ，et al, 2001. A preliminary study on ecological response of dominant tree spe cies in Korean pine broadleaf forest at Changbai Mountain to soil water stress and their biomass allocation [J]. Chin J Appl Ecol，12(4)：496-500. [王淼，代力民，姬蘭柱，等，2001. 長白山闊葉紅松林主要樹種對干旱脅迫的生態(tài)反應(yīng)及生物量分配的初步研究 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，12(4):496-500.]

WANG SG，LIN XG，SHI YQ, 2001. Effects of arbuscular mycorrhiza on resistance of plants to environment stress [J]. Chin J Ecol，20(3)：27-30. [王曙光，林先貴，施雅琴，2001. 叢枝菌根(AM)與植物的抗逆性 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志，20(3):27-30.]

WANG XL，WANG J, 1989. Morphology and structure of plant and environment [M]. Lanzhou: Lanzhou University Press: 105-138. [王勛陵，王靜，1989. 植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與環(huán)境 [M]. 蘭州: 蘭州大學(xué)出版社: 105-138.]

WU QS，XIA RX，HU ZJ, 2005. Effects of arbuscular mycorrhiza on drought tolerance ofPoncirustrifoliate[J]. Chin J Appl Ecol，16(3)：459-463. [吳強(qiáng)盛，夏仁學(xué)，胡正嘉，2005. 叢枝菌根對枳實(shí)生苗抗旱性的影響研究 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，16(3):459-463.]

WU QS，XIA RX, 2004. The relation between vesiculararbuscular mycorrhizae and water metabolism in plants [J]. Chin Agr Sci Bull，20(1)：188-192. [吳強(qiáng)盛，夏仁學(xué)，2004. VA菌根與植物水分代謝的關(guān)系 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，20(1):188-192.]

WU QS，XIA RX, 2005. Effects of AM fungi on drought tolerance of citrus grafting seedling trifoliate orange/cara [J]. Chin J Appl Ecol，16(5)：865-869. [吳強(qiáng)盛，夏仁學(xué)，2005. 水分脅迫下叢枝菌根真菌對枳實(shí)生苗生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，16(5):865-869.]

XU GF，ZHANG CY，XIANG ZX, 2009. Comprehensive evaluation of cold resistance on fourLysimachiaplants by subordinate function values analysis [J]. J Northwest For Univ，24(3)：24-26. [許桂芳，張朝陽，向佐湘，2009. 利用隸屬函數(shù)法對4種珍珠菜屬植物的抗寒性綜合評價(jià) [J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，24(3):24-26.]

YANG JY，YANG J，YANG MB，et al, 2009. Mechanisms of ecological adaptation ofCaraganastenophyllato drought stress in different habitats [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，29(12)：2476-2482. [楊九艷，楊劼，楊明博，等，2009. 錦雞兒屬7種植物葉的生理生化分析 [J]. 西北植物學(xué)報(bào)，29(12):2476-2482.]

YANG ZY，LIAO SX，2005. Advances in the research on the effects of arbuscular mycorrhizal fungi on plant stress resistance [J]. World For Res，18(2)：26-29. [楊振寅，廖聲熙，2005. 叢枝菌根對植物抗性的影響研究進(jìn)展 [J]. 世界林業(yè)研究，18(2):26-29.]

ZHANG YC，YAN TZ, 2003. Study on relationship between anatomical structure of leaves ofKareliniacapsia(pall) less and ecological environment [J]. J Ningxia Agric Coll，24(1)：31-33. [章英才，閆天珍，2003. 花花柴葉片解剖結(jié)構(gòu)與生態(tài)環(huán)境關(guān)系的研究 [J]. 寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，24(1):31-33.]

ZHU LQ，LI JY，ZHAO L，2007. Comparison on leaf anatomical structures and drought resistance of six broad leaved plant species [J]. Guihaia，27(3)：431-436. [朱栗瓊，李吉躍，招禮軍，2007. 六種闊葉樹葉片解剖結(jié)構(gòu)特征及其耐旱性比較 [J]. 廣西植物，27(3):431-436.]

Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on anatomical structure ofNyssayunnanensisleaves under drought stress

ZHANG Shan-Shan, KANG Hong-Mei, YANG Wen-Zhong*，XIANG Zhen-Yong

( Key Laboratory of Rare and Endangered Forest Plant of State Forestry Administration, Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, China )

The objective of this study was to verify the effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on drought resistance ofNyssayunnanensis, and to explore the mycorrhizal ways of plant conservation. A pot experiment was conducted to study the effects of AMF on anatomical structure characteristics ofN.yunnanensisseedlings and their drought resistances under different water conditions. Six water conditions (soil water content) were designed in this pot experiment: 32.32%, 29.63%, 25.86%, 19.39%, 12.93% and 6.46%, and at each water treatment, both sterilization (Low AMF) and no sterilization (High AMF) were contained through adding fungicide benomyl to control AMF. The results showed that AMF colonization rate were significantly decreased in “Low AMF” treatment under different water treatments. Moreover, AMF colonization rate ofN.yunnanensisroots significantly decreased with the intensity of increased drought. No significant difference was found in anatomical structure characteristics under mild drought stress conditions (soil water content was 29.63%) whereasN.yunnanensisseedlings showed higher resistances under severe drought stress conditions (soil water content was less than 25.86%). Benomyl treatment significantly affected seven leaf structure indices, such as the leaf cuticle thickness, palisade tissue thickness, upside epidermal thickness, plisade tissue / spongy tissue ratio, tightness of leaf tissue structure, sponge tissue thickness and leaf institutions looseness when soil water content was less than 25.86%, suggesting that high AMF could enhance leaf structure traits on behalf of the drought resistance ofN.yunnanensisseedlings when under severe drought stress conditions. Effects of AMF onN.yunnanensisseedlings under 25.86%, 19.39% and 12.93% were more significant than under 6.46% water content of soil. That was because AMF colonization was severely restrained by 6.46% water content of soil. Thus, effects of AMF on plant probably positively related to the colonization rate. Based on principal component analysis ofN.yunnanensis10 structure’s index of leaves, and the method of membership function value, leaf traits of main structure index were comprehensively evaluated. The results demonstrated thatN.yunnanensisseedlings showed stronger drought resistance under high AMF conditions. The experimental results provided the theoretical basis for the reasonable use of AMF in the protection of endangered speciesN.yunnanensis.

Nyssayunnanensis, drought stress, endangered plants, anatomical structure of leaves, arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), plant conservation

10.11931/guihaia.gxzw201507004

2015-10-10

2015-12-28

國家自然科學(xué)基金(31460119, 31660164)；國家林業(yè)局珍稀瀕危物種野外救護(hù)與繁育項(xiàng)目(2014YB1004，2015YB1021)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2013FD075) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31460119, 31660164)；State Forestry Administration of China (2014YB1004，2015YB1021)；Yunnan Provincial Natural Science Foundation (2013FD075)]。

張珊珊(1984-)，女，安徽宿州人，博士，助理研究員，主要從事保護(hù)生態(tài)學(xué)研究，(E-mail)zhang_ss1012@163.com。

楊文忠，博士，副研究員，主要從事保護(hù)生物學(xué)及生物多樣性研究，(E-mail)yangwz2004@126.com。

Q944，S718.43

A

1000-3142(2016)10-1265-10

張珊珊，康洪梅，楊文忠，等. 干旱脅迫下AMF對云南藍(lán)果樹葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 廣西植物，2016，36(10):1265-1274

ZHANG SS, KANG HM, YANG WZ，et al. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on anatomical structure ofNyssayunnanensisleaves under drought stress [J]. Guihaia，2016，36(10):1265-1274