任君安，黃文勝，葛毅強(qiáng)，陳 穎,*

肉制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究進(jìn)展

任君安1,2，黃文勝1，葛毅強(qiáng)2,3，陳 穎1,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.中國(guó)農(nóng)村技 術(shù)開發(fā)中心，北京 100045）

肉類制假、摻假問(wèn)題嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者權(quán)益、身體健康和進(jìn)出口貿(mào)易。目前，肉類摻假檢驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)，主要的研究方法有形態(tài)學(xué)、基于代謝物的檢測(cè)和基于蛋白水平及核酸水平的檢測(cè)等幾大 類，主要包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、色譜、質(zhì)譜和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。本文綜述了食品中肉類成分鑒別技術(shù)的研究進(jìn)展，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行討論。

肉制品；真?zhèn)危昏b別；檢測(cè)技術(shù)

肉及其制品營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量約為10%～20%，畜肉中含豐富的B族維生素，禽肉中不飽和脂肪酸含量較高，如人體必需的亞油酸，約占總脂肪含量的20%[1]。全球范圍內(nèi)肉制品的產(chǎn)量和消費(fèi)量持續(xù)升高，2013年我國(guó)成為全球肉類生產(chǎn)第一大國(guó)，年產(chǎn)量達(dá)8 536 萬(wàn)t，伴隨而來(lái)是近年來(lái)肉制品的摻假摻雜事件頻繁發(fā)生。2013年，我國(guó)部分地區(qū)開展了肉 及其制品的摻假情況調(diào)查[2]，結(jié)果顯示有25.6%的樣品與標(biāo)識(shí)不符，肉制品摻假情況較明顯，熟制牛肉和食用羊肉卷是肉類摻假高危品。目前，肉制品的摻假主要表現(xiàn)在：1）原料肉的摻假；2）組織的替換，如用其 他動(dòng)物組織（脂肪等）替換肌肉組織成分；3）非肉成分的添加，如注水以及摻入植物蛋白等[3]。這些問(wèn)題的出現(xiàn)嚴(yán)重干擾了全球范圍內(nèi)的肉業(yè)生產(chǎn)，不僅成為制約肉品質(zhì)量提升的主要因素，而且嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益和知情權(quán)，甚至涉及宗教信仰等問(wèn)題（例如在清真食品中摻雜進(jìn)豬肉或其他血漿成分等非清真食品）。

為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，全球不同國(guó)家和地區(qū)對(duì)肉制品的標(biāo)識(shí)要求都做了不同程度的規(guī)定。歐盟定量成分聲明（quantitative ingredient declaration，QUID）強(qiáng)制要求肉制品需要標(biāo)識(shí)出所有成分及其凈含量，詳細(xì)規(guī)定了凈含量的計(jì)算方法，并規(guī)定肉的主要成分為骨骼肌蛋白、結(jié)締組織蛋白和脂肪等成分需單獨(dú)列出且規(guī)定了最高含量，其中豬肉的脂肪最高限量為30%，結(jié)締組織蛋白限量為25%，鳥類和兔肉的脂肪最高限量為15%，結(jié)締組織蛋白限量為10%，其他哺乳動(dòng)物純?nèi)饧盎?合肉制品脂肪含量和結(jié)締組織蛋白限量為25%，這是最嚴(yán)格的肉類成分標(biāo)識(shí)制度[4]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）食品標(biāo)簽指南規(guī)定肉制品中需要標(biāo)識(shí)出所有成分，并在食品外包裝的主展示面上根據(jù)質(zhì)量按照降序順序羅列所有成分。我國(guó)于2011年發(fā)布預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則，也規(guī)定各種配料應(yīng)按制造或加工食品時(shí)加入量的遞減順序一一排列。

綜上所述，各國(guó)已有肉制品標(biāo)識(shí)的法律法規(guī)來(lái)約束生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者的行為，但要保障相關(guān)法規(guī)的有效執(zhí)行，還需 要借助科學(xué)的檢測(cè)方法[5]。各國(guó)學(xué)者近年來(lái)基于各類技術(shù)平臺(tái)研究肉制品中動(dòng)物種類的定性定量檢測(cè)方法，大致可分為形態(tài)學(xué)方法、基于代謝物的檢測(cè)方法以及基于蛋白、核酸的檢測(cè)方法。本文就各種肉類摻假鑒別方法的研究進(jìn)展進(jìn)行分析和總結(jié)，并對(duì)該領(lǐng)域的未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行探討。

1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法

形態(tài)學(xué)方法是以組織學(xué)特性為基礎(chǔ)，通過(guò)立式顯微鏡和復(fù)合光學(xué)顯微鏡觀察樣品粗糙顆粒和細(xì)小顆粒形態(tài)學(xué)構(gòu)造來(lái)區(qū)分不同動(dòng)物組織的一種檢測(cè)方法，此種方法仍然是目前歐盟官方唯一認(rèn)定的可用于肉骨粉仲裁檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]，可以在幾乎不存在假陰性的情況下檢測(cè)出低于0.1%的肉骨粉含量[7]，檢測(cè)假陽(yáng)性率低，檢出限低，分析熱穩(wěn)定性好。但是顯微鏡分析結(jié)果有一定的主觀性，與檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)有較大關(guān)系，例如在有細(xì) 胞存在的 肉骨粉樣品中盡管能夠檢出微量的動(dòng)物源性成分，但無(wú)法區(qū)分動(dòng)物種類，只可以區(qū)分哺乳動(dòng)物、禽類和魚類[8]，因此迫切需要尋找分辨率和靈敏度更高的鑒定方法。近幾年，基于電鏡與數(shù)字圖像分析相結(jié)合的組織學(xué)技術(shù)已成功地應(yīng)用在肉類加工產(chǎn)品中肌肉組織含量的評(píng)價(jià)和檢測(cè)，前提是肉在微切片后的形態(tài)學(xué)改變并不明顯[9]，該技術(shù)成功用于分析美國(guó)熱狗中的骨骼肌含量及結(jié)締組織和 骨組織等其他成分，結(jié)果表明大部分品牌的熱狗產(chǎn)品中肉（骨骼肌）含量均低于10%，水分占50%以上，所有品牌的熱狗中均含有其他組織成分。基于光鏡的圖像分析技術(shù)也被用來(lái)檢 測(cè)4 個(gè)商業(yè)品牌的意大利餃子餡中存在的各種動(dòng)物組織及其骨骼 肌含量[10]，并檢測(cè)了不同品牌和批次樣品的骨骼肌密度、骨骼肌蛋白大小和不同批次的均一性，結(jié)果表明該方法的檢測(cè)結(jié)果可靠，可以對(duì)加工肉制品中的微量動(dòng)物組織成分和含量進(jìn)行鑒定。

2 基于代謝物的檢測(cè)方法

廣義上，代謝物包括了生物體內(nèi)除核酸、蛋白之外的所有化合物，如糖類大分子、脂類大分子及各種小分子代謝物，但目前代謝物檢測(cè)只涉及分子質(zhì)量小于2 000 D的小分子代謝物。一些研究者報(bào)道了根據(jù)肉類中的氨基酸、糖和酚類物質(zhì)等生物代謝物組成進(jìn)行動(dòng)物種屬鑒別的方法[11-13]。代謝物檢測(cè)的常用技術(shù)有光譜、色 譜-質(zhì)譜及各類傳感器（如電子鼻和電子舌）等。光譜檢測(cè)常用于研究物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和組成，由于拉曼散射光譜和紅外吸收光譜可以有效表征小分子代謝物中的C、N、O、H之間的化學(xué)鍵及相應(yīng)官能團(tuán)，因此自20世紀(jì)70年代起被廣泛用于有機(jī)物和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)成分的定性定量檢測(cè)。電子鼻和電子舌是基于電化學(xué)傳感器和模式識(shí)別的氣體、液體分子分析儀器，能同時(shí)與樣品中的各類分子相互作用，獲取樣品的整體信息，近年也已用于食品農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì) 檢測(cè)和種類鑒別。

由于各種代謝物往往含有多種官能團(tuán)且多有相似分子結(jié)構(gòu)，因此各物質(zhì)光譜、電子鼻舌等的測(cè)量信號(hào)交叉重疊，無(wú)法直接測(cè)得食品農(nóng)產(chǎn)品中各物質(zhì)的含量，因而這種定量也被稱為“黑匣子” 定量。需要運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)將測(cè)量信號(hào)與典型樣品的已知質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，通過(guò)大量典型樣品的測(cè)量數(shù)據(jù)建立定量分析模型，才能用于樣品定量檢測(cè)，目前常用的建模方法有主成分分析、判別分析、偏最小二乘回歸分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。

2.1 光譜學(xué)技術(shù)

光譜學(xué)方法是一種快速、無(wú)損的食品飼料動(dòng)物成分檢測(cè)鑒別方法，其突出特點(diǎn)是分析速率快，樣品制備簡(jiǎn)單，可同時(shí)測(cè)定多種成分，簡(jiǎn)單無(wú)污染，只需對(duì)比已知譜圖，即可進(jìn)行快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、無(wú)損傷的定性定量分析。拉曼光譜和近紅外光譜檢測(cè)的都是物質(zhì)分子的各種振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)頻率和能級(jí)的信息，反映了樣品分子中有機(jī)物結(jié)構(gòu)和官 能團(tuán)類型，且拉曼光譜與紅外光譜在應(yīng)用對(duì)象上各具特色。近幾年，國(guó)內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室開展了拉曼光譜法和近紅外光譜法鑒別不同動(dòng)物源性成分的方法研究。

拉曼光譜是由物質(zhì)分子對(duì)光源的散射產(chǎn)生的一種非破壞性的指紋成像技術(shù)。Ellis等[11]首次運(yùn)用傅里葉變換拉曼光譜技術(shù)，鑒別了雞肉和火雞鮮肉，同時(shí)對(duì)不同部位的雞肉，如雞胸肉和雞腿肉進(jìn)行了有效地區(qū)分。Sowoidnich等[12]應(yīng)用轉(zhuǎn)移激發(fā)拉曼光譜（shifted-excitationraman difference spectroscopy，SERDS）技術(shù)原位鑒定牛肉、豬肉、雞肉和火雞的鮮肉切片，對(duì)兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明4 種肉類可被明確區(qū)分。但比之于紅外光譜，拉曼光譜的靈敏度較低，待測(cè)物需要較高的含量才可檢測(cè)。

常用波長(zhǎng)在780～2 526 nm范圍的近紅外光譜法。Ding等[14]用近紅外技術(shù)研究牛肉漢堡包摻假問(wèn)題，采用400～2 500 nm波長(zhǎng)范圍的紅外光對(duì)生、熟及碎肉進(jìn)行分析，并通過(guò)建立偏最小二乘回歸（partial least-squares regression，PLS）模型判斷摻假程度，發(fā)現(xiàn)摻假量與準(zhǔn)確度成正比例關(guān)系，其中，摻入量為5%～25%的牛肉樣品，判斷準(zhǔn)確率在92.7%以上。Restaino等[15]將近紅外光譜及化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，應(yīng)用線性判別分析（spatially smooth linear discriminant analysis，SLDA）鑒別意大利肉塊的動(dòng)物種類，對(duì)牛肉、豬肉肉塊的鑒別準(zhǔn)確率為100%。Morsy等[16]利用近紅外光譜對(duì)新鮮的解凍的牛肉嘗試進(jìn)行了定量檢測(cè)。最近Kamruzzaman等[17]應(yīng)用近紅外高頻譜圖像分析法檢測(cè)碎羊肉中摻雜的豬肉含量，該技術(shù)的最大特點(diǎn)為光譜技術(shù)與成像技術(shù)有機(jī)結(jié)合，通過(guò)光譜鑒定分析物的動(dòng)物種類，通過(guò)圖像分析計(jì)算樣品切片中各種肉類的空間分布。筆者選擇4 個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行分析并建立了多重線性回歸（multi-linear regression，MLR）模型，在4%～40%的范圍內(nèi)可檢測(cè)摻雜肉的含量。孫淑敏等[18]用近紅外光譜快速鑒別羊肉產(chǎn)地來(lái)源。對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)5 個(gè)產(chǎn)區(qū)共99 份羊肉樣品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立了羊肉產(chǎn)地來(lái)源的定性判別模型。結(jié)果表明，不同地區(qū)羊肉的近紅外光譜有顯著差異，整體正確判別率達(dá)到100%。證明近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以作為羊肉產(chǎn)地溯源的一種有效技術(shù)手段。近紅外 光譜法的缺點(diǎn)是：1）需要大量有代表性且測(cè)量值已知的樣品建立模型。2）模型不通用，每臺(tái)儀器的模型都不相同，限制它的使用范圍。

2.2 電子鼻和電子舌技術(shù)

電子鼻采用氧化物半導(dǎo)體和固體電解質(zhì)等氣敏傳感器對(duì)氣味進(jìn)行捕捉和檢測(cè)，模擬人鼻的感覺功能，屬于氣味指紋檢測(cè)方法。電子舌以電化學(xué)傳感器模擬人的味蕾功能，用于檢測(cè)液體中 風(fēng)味相關(guān)物質(zhì)，屬于嗅覺指紋檢測(cè)方法。電子鼻和電子舌已在食品品質(zhì)控制、新鮮度評(píng)價(jià)及原料種類鑒別等方面得到了廣泛應(yīng)用[19]，在檢測(cè)肉品時(shí)具有樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、操作方便、成本低、重現(xiàn)性好及可同時(shí)檢測(cè)多種成分等優(yōu)點(diǎn)。

賈洪鋒等[20]嘗試用電子鼻進(jìn)行肉類摻假識(shí)別，對(duì)牦牛肉、牛肉和豬肉樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，電子鼻能夠有效識(shí)別樣品中的豬、牛肉，并能對(duì)牦牛肉和普通牛肉的不同部位進(jìn)行有效區(qū)分，但不能區(qū)分豬肉的不同部位。在牛肉餡中摻入不同比例的豬肉餡時(shí)，電子鼻響應(yīng)信號(hào)和豬肉餡摻入比例之間有很好的相關(guān)性，PLS模型預(yù)測(cè)誤差在1.27%～7.00%之間。García等[21]采用多傳感器陣列電子鼻系統(tǒng)，在傳感器陣列中濺射入SnO2薄膜，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（probabilistic neural network，PNN）數(shù)據(jù)分析技術(shù)可以鑒別4 種品牌的火腿肉，準(zhǔn)確率為100%。Tian等[22]利用電子鼻鑒別羊肉中摻雜的豬肉成分，結(jié)果表明，采用線性判別分析可以區(qū)分摻入不同比例豬肉的羊肉樣品，并采用PLS、MLR和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation neural network，BPNN）分析建立預(yù)測(cè)模型，能有效區(qū)分摻入羊肉中的豬肉比例。

田曉靜等[23]報(bào)道了利用電子舌方法對(duì)羊肉中混入不同比例雞肉的樣品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。通過(guò)主成分分析和典型判別分析，電子舌能區(qū)分混入不同比例雞肉的羊肉糜樣品；采用多元線性回歸分析和偏最小二乘回歸分析建立的定量預(yù)測(cè)模型能有效預(yù)測(cè)混入的雞肉比例。韓劍眾等[24]將自行開發(fā)的多頻脈沖電子舌應(yīng)用于鱸魚、鳙魚、鯽魚等3 種淡水魚和馬鲇魚、小黃魚、鯧魚等3 種海水魚的鑒別實(shí)驗(yàn)中，表明電子舌不僅可以有效區(qū)分淡水魚和海水魚，而且還可以辨識(shí)不同品種淡水魚或海水魚之間的差異。

3 基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)通常具有一定種內(nèi)保守性和種間特異性，是適用于物種鑒別技術(shù)的理想分析對(duì)象。Wilkins等[25]首次提出了蛋白質(zhì)組的概念，隨后，研究人員逐漸開始采用電泳方法、基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)方法或質(zhì)譜分析等方法等對(duì)肉及其制品中 的總蛋白或蛋白標(biāo)志物進(jìn)行分析檢測(cè)[26]。每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，需要對(duì)不同樣品找到最適合的檢測(cè)方法。

3.1 蛋白質(zhì)電泳技術(shù)

電泳方法是一種傳統(tǒng)的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法，至今仍得到廣泛的應(yīng)用。動(dòng)物的品種、組織結(jié)構(gòu)、保存時(shí)間和加工技術(shù)都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響。利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)肉類進(jìn)行鑒別的電泳技術(shù)主要包括聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-PAGE，SDS-PAGE）、雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis technology，2-DE）等。

2-DE根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）和分子質(zhì)量（Mw）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，能在一張凝膠上同時(shí)鑒定10 000 個(gè)蛋白點(diǎn)[27]，并且可以實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，對(duì)不同品種的肉制品做定性或定量分析，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要支撐技術(shù)之一。19世紀(jì)80年代雙向凝膠電泳技術(shù)第一次應(yīng)用到了動(dòng)物源性食品鑒別領(lǐng)域，初步鑒定了屠宰后的生肉樣品。隨后，2-DE技術(shù)在過(guò)去20 a中得到了飛速的發(fā)展，部分物種的肌 肉2-DE圖譜已經(jīng)公布，包括豬[28-29]、牛[30]和雞[31]的骨骼肌蛋白圖譜，一些圖譜已被用于獲得與肉類種屬性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。研究人員分析了豬的不同品種[32-33]、不同性別[34]和不同肌肉部位[35]的蛋白表達(dá)量差異，但是表達(dá)量的差異并不能作為不同動(dòng)物源性食品鑒別的依據(jù)[36]。隨后，Montowska等[37]鑒定出牛、豬和雞等生鮮及加工樣品可以差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，可用作動(dòng)物源性成分鑒別的蛋白靶標(biāo)，包括調(diào)節(jié)蛋白、代謝酶和肌纖維血漿蛋白。雙向凝膠電泳技術(shù)本身存在局限性，操作自動(dòng)化程度低，在分離過(guò)程中分子質(zhì)量高于2 000 kD和低于1 000 kD的蛋白質(zhì)易丟失、對(duì)于極酸、極堿、難溶、低豐度的蛋白質(zhì)分離效果差等[38]，因此也對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定的影響。

3.2 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)是通過(guò)抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)和信號(hào)放大技術(shù)達(dá)到鑒別動(dòng) 物源性成分的方法。自從Warneck和Saffle用肌肉水浸液做兔體免疫抗原，解決了血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中最重要的抗體制備問(wèn)題之后，肉類食品品種摻假的免疫學(xué)檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，例如試管沉淀法、瓊脂擴(kuò)散法、對(duì)流免疫電泳法、放射免疫法以及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等，其中以ELISA方法的應(yīng)用最為廣泛[39]。

酶聯(lián)免疫是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析方法[40]。利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，進(jìn)行成分的鑒別和血清學(xué)分型。目前，用于肉類等食品鑒別的ELISA方法主要包括間接酶聯(lián)免疫和夾心酶聯(lián)免疫分析，一些公司（Neogen、ELISA Technologies、SDI和Stamford）已經(jīng)開發(fā)出一系列肉類檢測(cè)的ELISA試劑盒，可以選擇性的進(jìn)行生熟肉樣品的檢測(cè)。20世紀(jì)90年代，Martin等[41]就采用ELISA方法對(duì)牛肉中摻雜0%到80%的豬肉成分繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)豬肉成分含量，最低檢測(cè)限為1%，變異系數(shù)18%，檢測(cè)的牛肉樣品中，最高含有的豬肉成分為48%。之后Ren?ová等[42]通過(guò)將兔肌肉蛋白100 ℃或120 ℃加熱30 min后制備熱穩(wěn)定性多克隆抗體，成功檢測(cè)了62 種市售熱加工產(chǎn)品中的家禽肉、馬肉、袋鼠肉和鼠肉， 檢測(cè)靈敏度為1%～5%。隨后，Liu等[43]利用抗體夾心法，以豬tnI 蛋白為抗原制備了兩種單克隆抗體（MABs 8F10和5H9），最低能夠檢測(cè)雞肉和牛肉中0.05%和0.1%的豬肉成分，并可以檢出經(jīng)過(guò)高溫處理后大豆蛋白基料 飼料中和肉骨粉中的肉成分。Giovannacci等[44]采用ELISA試劑盒成功鑒別了牛肉、豬肉和羊肉，但是無(wú)法區(qū)分禽肉樣品的雞肉和火雞肉。

ELISA法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單方便，非專業(yè)人士也可以熟練掌握，使用范圍廣泛；成本低，靈敏度和通量較高，可以同時(shí)檢測(cè)大量樣品。難點(diǎn)是必須找到一個(gè)熱穩(wěn)定的抗原或者使特異性蛋白復(fù)性，研制出針對(duì)此抗原的特異性單克隆抗體。骨骼肌中的肌鈣蛋白Ⅰ具有高特異性和熱穩(wěn)定性，是理想的抗原之一。如果抗體特異性低，則在鑒別同一物種的不同品種動(dòng)物源性食品時(shí)，容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。另外，該方法對(duì)于加工后樣品成分的鑒定的準(zhǔn)確度會(huì)降低，這是由于環(huán)境因素的改變都會(huì)對(duì)蛋白抗原決定簇的立體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此常常需要其他方法輔助檢測(cè)。

3.3 色譜和質(zhì)譜技術(shù)

液相色譜（氣相色譜）可根據(jù)有機(jī)物的分子質(zhì)量、疏水性和電負(fù)性，將其在色譜柱中分開，而后串聯(lián)的質(zhì)譜儀可根據(jù)荷質(zhì)比確定測(cè)待分子的種類，因而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用也廣泛用于生物有機(jī)物和多肽的定性定量檢測(cè)。

Chou等[45]利用高效液相色譜法鑒別牛肉、豬肉等15 種生熟肉品，變異系數(shù)小于6%。Aristoy等[13]以高效液相色譜法對(duì)肉制品來(lái)源的反芻動(dòng)物飼料進(jìn)行特異性檢測(cè)，通過(guò)確定肌肽和鵝肌肽的含量鑒定加入飼料中的哺乳動(dòng)物源性成分，當(dāng)肌肽和鵝肌肽含量之比大于0.3時(shí)，認(rèn)為飼料中含有哺乳動(dòng)物成分，最低檢測(cè)限為0.5%，證明高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）可作為哺乳動(dòng)物源性成分檢測(cè)的篩選手段，但還需用其他方法進(jìn)一步確定哺乳動(dòng)物種類。Giaretta等[46]利用超高效液相色譜技術(shù)（ultra performance liquid chromatogra phy，UPLC），以肌紅蛋白作為靶蛋白檢測(cè)生牛肉漢堡中的豬源性成分含量。生肉樣品需要通過(guò)亞硝酸鈉預(yù)處理，將氧合肌紅蛋白和脫氧肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的高鐵肌紅蛋白，然后再上柱檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)到5%（25 mg/500 mg）。然而，由于肉制品中蛋白質(zhì)含量變化范圍廣、干擾因素多，導(dǎo)致此類技術(shù)靈敏度較低、易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；對(duì)儀器、試劑和樣品處理均有較高要求，在分析混合成分時(shí)難度較大，因此在實(shí)際應(yīng)用中較少，標(biāo)準(zhǔn)化與推廣應(yīng)用的前景均受到很大局限[47]，因此，一般不作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法或仲裁鑒定方法，而作為快速篩查方法使用。

目前，將鳥槍法和質(zhì)譜法相結(jié)合對(duì)肉制品中不同動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒別成為了新的發(fā)展方向。這種方法操作簡(jiǎn)單，不需要在質(zhì)譜檢測(cè)前通過(guò)雙向凝膠電泳法分離動(dòng)物源性蛋白，只需將總蛋白酶解成肽段，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒別特征肽，并以質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法檢測(cè)特征肽含量，可實(shí)現(xiàn)不 同動(dòng)物源性成分的定量檢測(cè)。Christoph等[48]首次采用此方法，鑒別了牛肉中的馬肉和豬肉成分。他們以雞肉、羊肉和牛肉為陰性對(duì)照，篩選出馬和豬的特征肽，并確定牛肉中馬肉和豬肉的最低定量檢測(cè)限為0.55%。此方法利用三級(jí)質(zhì)譜（multiple reaction monitoring，MRM3）降低基質(zhì)效應(yīng)，提高信噪比，有效提高定量靈敏度，可以定量檢測(cè)牛肉中摻有0.13%的豬肉成分。隨后，Montowska等[49]采用電噴霧解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（desorption electrospray ionization，DESI-MS）與液滴萃取表面分析質(zhì)譜（liquid extraction surface analysis-mass spectrometry，LESA-MS）技術(shù)首次檢測(cè)牛、豬、馬、雞和火雞肉等5 種肉類的骨骼肌蛋白，根據(jù)信噪比和多元分析法（multivariate analysis，MVA）成功檢測(cè)鑒別5 種肉類成分的特征肽，并發(fā)現(xiàn)LESA-M S方法的穩(wěn)定性和靈敏度優(yōu)于DESI-MS方法。

4 基于核酸的檢測(cè)方法

近幾十年來(lái)，以核酸為標(biāo)志物的動(dòng)物種類鑒別檢測(cè)方法飛速進(jìn)步，并獲得了廣泛應(yīng)用。常用技術(shù)有核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及其衍生方法、DNA條碼及新興的數(shù)字PCR技術(shù)等。與蛋白質(zhì)相比，DNA不易受到食品加工方式的影響，穩(wěn)定性更高；存在于大部分的組織細(xì)胞中，即使動(dòng)物組織部位不同，也可得到可靠的鑒定信息。同時(shí)，這些分析方法與紅外光譜法[50]、ELISA[51]、毛細(xì)管電泳等方法相比，更加靈敏，且可以檢測(cè)經(jīng)過(guò)熱處理的肉制品[52]，因此成為動(dòng)物源性成分鑒定的主流技術(shù)。

4.1 核酸雜交技術(shù)

早期研究中多用DNA雜交完成動(dòng)物源性成分鑒定，該方法將用放射性同位素標(biāo)記的動(dòng)物全基因組DNA物種特異性探針與固定到尼龍膜上的樣品DNA進(jìn)行雜交，根據(jù)產(chǎn)生的放射信號(hào)鑒定樣品的物種組成[53]。利用這種方法對(duì)加工過(guò)的雞肉、豬肉樣品[54]以及牛肉和豬肉的混合制品[55]進(jìn)行同源性鑒定，得到了良好的效果。Kirsten等[56]利用此方法鑒定了牛肉中摻雜的豬肉，將提取出的豬DNA固定在尼龍膜上，使其與32P標(biāo)記的豬DNA探針雜交，建立信號(hào)強(qiáng)度與DNA數(shù)量的函數(shù)關(guān)系，可在牛肉樣品中檢測(cè)出0.1%含量的豬肉成分，在加工后的肉制品中最低可檢出0.5%的豬肉成分。這種方法耗時(shí)長(zhǎng)、有放射性、對(duì)DNA的純度要求高，探針信號(hào)的強(qiáng)度常受到樣品組織來(lái)源或其加工方式等因素的影響，且靈敏度不高，定量困難，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到了限制。

4.2 常規(guī)PCR技術(shù)

PCR的突出特點(diǎn)是其具有極高的靈敏度，這在檢測(cè)食品中的豬成分和飼料中的牛羊源性成分時(shí)極為重要，因食品中只要污染了微量的豬成分就不能作為清真食品，目前其他方法不具備如此高的靈敏度。PCR方法的另一特點(diǎn)是它的極高的分辨率，由于采用種屬特異性的DNA序列作為靶標(biāo)，PCR方法不僅可分辨動(dòng)物的種類甚至可用于動(dòng)物的品種鑒別和個(gè)體身份識(shí)別，這在肉類的溯源體系中已獲得廣泛應(yīng)用。PCR檢測(cè)方法的適用范圍廣，因?yàn)榛蚪MDNA序列決定了動(dòng)物的物種、品種和個(gè)體差異，且每個(gè)動(dòng)物個(gè)體的DNA序列都具有唯一性，且終生不變，因此動(dòng)物不同組織或器官的DNA 序列完全相同，無(wú)論肉塊、骨頭、皮、角等，都能從中提取DNA進(jìn)行檢測(cè)。由于DNA不具有揮發(fā)性且比大多數(shù)蛋白的熱穩(wěn)定性高，因此，PCR方法能用于各種加工肉品和產(chǎn)品的檢測(cè)。肉種類鑒定中常選用線粒體基因作為PCR檢測(cè)靶標(biāo)，包括線粒體細(xì)胞色素b基因、D-Loop區(qū)、12S rRNA、16S rRNA等。這是由于線粒體DNA進(jìn)化速度快，具有廣泛的種內(nèi)、種間多態(tài)性和高度的物種特異性，且拷貝數(shù)多，加熱時(shí)不容易被徹底破壞，存活機(jī)率大，更容易被擴(kuò)增，不會(huì)發(fā)生基因重組[47,57]。陳穎等[58-59]根據(jù)牛、羊和馬屬動(dòng)物（馬和驢）mtDNA序列，設(shè)計(jì)了牛、羊和馬屬動(dòng)物源性成分的特異性擴(kuò)增引物，建立了牛、羊源性成分和馬屬動(dòng)物（馬和驢）成分的快速檢測(cè)方法，并首次通過(guò)選用不同的內(nèi)切酶區(qū)分食品和飼料中的馬和驢成分，在食品真?zhèn)舞b別中具有很好的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。Martin等[60]利用線粒體12S rRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)鴨肉混合物進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增的靶基因片段長(zhǎng)度小于100 bp，檢測(cè)限為0.1%～1.0%，因此適用于經(jīng)高壓或熱加工后DNA出現(xiàn)高度降解的肉制品定性分析。Soares等[61]選取線粒體cyt b和12S rRNA作為目的基因，對(duì)豬肉和家禽肉進(jìn)行雙重PCR鑒定，靈敏度為0.1%，具有良好的重復(fù)性。Safdar[62]和Amaral[63]等分別運(yùn)用PCR方法對(duì)馬肉、大豆蛋白、家禽、香腸同時(shí)鑒定和香腸中野兔、家兔、馬鹿、豬和母牛成分鑒別進(jìn)行了研究。近幾年的文獻(xiàn)報(bào)道中多選用線粒體基因組編碼序列作為肉類定性鑒別的目的基因，對(duì)于定量檢測(cè)來(lái)說(shuō)，線粒體基因組在不同組織中數(shù)量變異較大，在動(dòng)物組織種類未知的情況下以之作為定量檢測(cè)的目標(biāo)基因，可能導(dǎo)致定量結(jié)果的偏差。核基因DNA在各個(gè)組織中拷貝數(shù)恒定，在定量方面更加準(zhǔn)確，但由于拷貝數(shù)低，導(dǎo)致靈敏度降低，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求較高[57]。Aslan等[64]對(duì)75～100 ℃加熱條件下牛肉中的GAPDH、CAST和CTSB基因降解程度做了初步研究，發(fā)現(xiàn)在100 ℃的高溫加熱后仍然可以檢測(cè)到大于150 bp的片段，為以核基因?yàn)榘谢虻亩ㄐ远繖z測(cè)提供依據(jù)。

PCR方法也用于動(dòng)物的品種鑒別和個(gè)體身份識(shí)別，歐盟的管理法規(guī)強(qiáng)制要求自2005年1月1日起銷售的肉品都必須具備可追溯性。加拿大、澳大利亞等國(guó)家也都相繼建立肉類溯源管理系統(tǒng)。當(dāng)肉制品發(fā)生污染時(shí)，對(duì)其DNA 標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)可以快速地追溯到它的產(chǎn)地和親本來(lái)源，完成肉品的從生產(chǎn)到餐桌的全程溯源[65]。Vázquez等[66]建立3 個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記，用DNA指紋圖譜技術(shù)對(duì)鮮牛肉片進(jìn)行溯源。Heaton等[67]用SNP標(biāo)記對(duì)牛肉進(jìn)行溯源，錯(cuò)誤識(shí)別率僅為百萬(wàn)分之一。

4.3 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析是指利用限制性內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列并在此將DNA切開，形成長(zhǎng)度不等的限制片段作為指紋圖的分析技術(shù)。PCR-RFLP是結(jié)合了RFLP與PCR技術(shù)各自的特點(diǎn)，通過(guò)第一步對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR特定引物擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，用凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性分析[68]。Chikuni等[69]根據(jù)微衛(wèi)星DNA序列設(shè)計(jì)綿羊和山羊的特異性引物，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表現(xiàn)出92%的同源性，然后通過(guò)4 個(gè)限制性酶切位點(diǎn)區(qū)分綿羊和山羊。Sharma等[70]運(yùn)用RFLP技術(shù)鑒別了生豬肉、高溫蒸煮處理后和高溫高壓處理后的豬肉樣品，檢測(cè)結(jié)果均與生肉樣品一致，并沒(méi)有受到加熱處理的影響。Doosti等[71]利用RFLP技術(shù)研究建立牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、驢肉和馬肉的鑒別方法并進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測(cè)驗(yàn)證。與核酸序列分析相比，這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于省去了直接測(cè)序的環(huán)節(jié)，價(jià)格低廉。缺點(diǎn)是操作中DNA用量大，純度要求高，DNA制品中的污染（如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS、高濃度鹽）均能抑制酶切活性，但可以通過(guò)增加酶濃度、增大反應(yīng)體積稀釋可能的抑制劑和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間加以克服；此外，由于操作環(huán)節(jié)多、周期長(zhǎng)、容易受到目標(biāo)基因序列中酶切位點(diǎn)隨機(jī)突變的影響，易產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果的不確定性，如有些酶由于受旁側(cè)核苷酸甲基化的影響，導(dǎo)致在特異位點(diǎn)的切割效率降低，這些都限制了RFLP技術(shù)大范圍地應(yīng)用。

常規(guī)PCR方法通常要求具有特異性的引物，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析則可使用通用引物。多數(shù)方法選擇線粒體細(xì)胞色素b基因（cyt b）進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的目的片段經(jīng)高溫處理后解鏈并自我復(fù)性，在合適的條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，由于復(fù)性后單鏈DNA長(zhǎng)度、空間構(gòu)象差異，最后形成不同的譜圖，通過(guò)此方法，可以區(qū)分序列中小至單個(gè)堿基的差異。陳穎團(tuán)隊(duì)的吳亞君等[72]采用PCR-CE-SSCP技術(shù)建立了梅花鹿產(chǎn)品的快速篩查方法，在cyt b基因上設(shè)計(jì)出可以擴(kuò)增出梅花鹿、白唇鹿等7 個(gè)鹿種樣品的鹿科通用引物，實(shí)現(xiàn)了大批量梅花鹿保健品中摻假鹿種成分的快速檢測(cè)。但影響SSCP穩(wěn)定性的因素較多，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，鑒定時(shí)要求同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)品以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，實(shí)際應(yīng)用較少[73]。

4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-time PCR）

傳統(tǒng)PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，而實(shí)時(shí)熒光PCR是通過(guò)熒光化合物在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中檢測(cè)和收集擴(kuò)增信號(hào)。由于指數(shù)增長(zhǎng)期是分析數(shù)據(jù)的最佳時(shí)期，樣品中DNA含量與PCR產(chǎn)物在任意的循環(huán)數(shù)內(nèi)存在定量關(guān)系，因此real-time PCR可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品模板濃度進(jìn)行定量分析[74-75]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要包括兩大類：利用雙熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)解離產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化的TaqMan realtime PCR和利用染料分子插入雙鏈DNA產(chǎn)生熒光變化的SYBR Green real-time PCR。SYBR Green法的優(yōu)勢(shì)在于DNA擴(kuò)增后通過(guò)溶解曲線檢測(cè)出單堿基突變[76]。López-Andreo等[77]用之鑒別牛肉、豬肉、馬肉和袋鼠，最低檢測(cè)限達(dá)到了0.04 pg DNA，對(duì)實(shí)驗(yàn)室人工摻雜的肉制品均有良好的檢測(cè)效果，隨后進(jìn)行的二重PCR的檢測(cè)靈敏度略有降低。郭云霞等[78]利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法建立了食品中的鯊魚源性成分鑒定方法，對(duì)9 種鯊魚樣品和48 種非鯊魚類動(dòng)植物樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.000 1 ng/μL DNA，并用此方法對(duì)20 種常見鯊魚產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高。Soares等[79]利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)出了禽肉制品 中摻入的豬肉成分。楊麗霞等[80]利用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)出了肉類產(chǎn)品中的鴨肉成分。

TaqMan real-time PCR技術(shù)通過(guò)TaqMan探針與模板的結(jié)合與水解極大地增強(qiáng)了反應(yīng)特異性，且實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，省去了電泳的環(huán)節(jié)，使得同一反應(yīng)中多種肉類同時(shí)鑒別的可靠性大大提升。這種方法在新鮮樣品和加工品如滅菌罐頭中均可以獲得較好的效果，但一些深加工肉制品如明膠、肉湯類產(chǎn)品由于DNA被高度破壞造成檢測(cè)難度較大?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)鑒別肉類的常見應(yīng)用如表1所示。陳穎團(tuán)隊(duì)的Wang等[81]根據(jù)牦牛的細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)特異性引物探針，對(duì)8 個(gè)不同地方品種的牦牛和9 種其他動(dòng)物DNA擴(kuò)增，只有牦?？梢援a(chǎn)生特異性的擴(kuò)增曲線且與其他動(dòng)物DNA無(wú)交叉反應(yīng)，在混合肉品中檢測(cè)靈敏度達(dá)到了0.001%，并在對(duì)市售牦牛制品檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分商品以黃牛肉冒充牦牛肉。Ulca等[82]針對(duì)土耳其的牛肉、雞肉和火雞肉等42 種肉制品中摻假情況進(jìn)行了檢測(cè)，其中40 種產(chǎn)品沒(méi)有摻假情況，2 種產(chǎn)品不同程度的摻雜其他肉制品，檢測(cè)限低于0.1%。張弛等[83]針對(duì)市售羊肉中常常摻雜鴨肉現(xiàn)象，根據(jù)鴨cyt b基因中的保守序列，建立了肉制品中鴨源性成分定性和定量檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.78 pg DNA。López-Andreo等[84]采用MGB探針對(duì)65～126 ℃條件下加熱10～30 min后的豬肉和牛肉混合樣品中的豬肉成分進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示，處理后與處理前的豬肉樣品Ct值相差2，處理后的DNA降解至大約100 bp左右，證明加熱對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生了一定程度的影響，所建立的方法可以最低定量檢測(cè)到5%的加熱處理后的豬肉成分。Soares等[85]利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)出了肉制品中摻入的大豆成分。Kesmen等[86]通過(guò)基于TaqMan探針的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法定量檢測(cè)了生的和熱加工過(guò)的驢肉和豬肉。陳穎團(tuán)隊(duì)的吳亞君等[87]利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法建立了加工工藝復(fù)雜的阿膠產(chǎn)品中的馬驢成分檢測(cè)方法，為市售商品的監(jiān)管及原料品質(zhì)控制提供了快速有效的技術(shù)手段。

我國(guó)也于近幾年研究建立了利用PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR法鑒別畜、禽、魚類的一系列國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，包括進(jìn)出口食品和飼料中常見禽類[88]（火雞、雞、鵝、鵪鶉、鴨、鴿子、鷓鴣）的品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)，馬、驢、鹿、駱駝[89]和牛[90]等畜類產(chǎn)品的鑒定標(biāo)準(zhǔn)和三文魚、鱈、河豚、黃魚、金槍魚等[91]魚類產(chǎn)品鑒定標(biāo)準(zhǔn)等，為鑒別和檢測(cè)飼料中的不同動(dòng)物源性成分提供一種實(shí)用、有效的分子生物學(xué)方法。

盡管近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)給生熟肉制品及肉類加工品摻假的定性定量檢測(cè)帶來(lái)了長(zhǎng)足的飛躍，但是相關(guān)方法的完善和推廣仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。由于不同動(dòng)物樣品性別、種別、年齡、組織器官和肌肉類型的DNA總量，特別是線粒體DNA總量存在很大差異，使得較難確定標(biāo)準(zhǔn)樣品，并且擴(kuò)增的靶序列不同，PCR反應(yīng)效率之間的差異也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，阻礙方法的標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 以實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的常見肉類鑒別方法國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀Table 1 An overview of species identification of common meat by realtime PCR

4.5 DNA條碼技術(shù)

在2003年發(fā)展起來(lái)的DNA條碼技術(shù)是一種快速、可靠、低成本的鑒定技術(shù)[106]。該方法利用生物體內(nèi)一段幾百個(gè)堿基的DNA序列作為條形碼進(jìn)行物種鑒定。目前，常用線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（COX I）基因的部分序列作為動(dòng)物的條形碼。Eaton等[107]利用基因條碼技術(shù)對(duì)來(lái)自非洲中部及南美的哺乳動(dòng)物和爬行動(dòng)物進(jìn)行分子鑒定，對(duì)23 個(gè)野生動(dòng)物品種設(shè)計(jì)了一段擴(kuò)增長(zhǎng)度為645 bp的通用引物，204 份樣品中有179 份（87.7%）獲得了高質(zhì)量的條碼序列，COX I基因片段的種內(nèi)多態(tài)性普遍較低，平均值為0.24%，而在同屬物種之間的差異達(dá)到了9.77%，證明基因條碼技術(shù)是一種可以用來(lái)監(jiān)管瀕危物種的偷獵和非法交易的有效手段，尤其是針對(duì)不易用形態(tài)學(xué)區(qū)分的半加工產(chǎn)品和野生動(dòng)物產(chǎn)品。

4.6 數(shù)字PCR技術(shù)

PCR方法具有準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光PCR更將原有的常規(guī)PCR技術(shù)發(fā)展成為一種高特異性、高靈敏的半定量基因分析技術(shù)。盡管實(shí)時(shí)熒光PCR方法在肉及其制品的定性和半定量檢測(cè)中發(fā)揮了巨大作用，但是在PCR過(guò)程中影響擴(kuò)增效率的因素很多，反應(yīng)過(guò)程中擴(kuò)增效率的差異，實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴(kuò)增效率的變化，均會(huì)導(dǎo)致循環(huán)閾值發(fā)生改變，進(jìn)而使定量檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，因此實(shí)時(shí)熒光PCR的定量只是半定量，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能滿足行政執(zhí)法和貿(mào)易商品檢測(cè)所用方法的要求。

數(shù)字PCR是一項(xiàng)可以精確定量DNA拷貝數(shù)的核酸檢測(cè)新技術(shù)。它相較實(shí)時(shí)熒光PCR來(lái)說(shuō)，不需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以實(shí)現(xiàn)DNA拷貝數(shù)的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程一般包括兩步，即PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析。在PCR擴(kuò)增階段，要將樣品DNA平均分配到幾千至幾萬(wàn)個(gè)單元中，稀釋到單分子水平進(jìn)行反應(yīng)，并在擴(kuò)增期間或擴(kuò)增結(jié)束后采集每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最后通過(guò)直接技術(shù)或泊松分布計(jì)算樣品DNA的原始濃度和含量[108]。這種方法不同于real-time PCR對(duì)每個(gè)循環(huán)的實(shí)時(shí)熒光進(jìn)行測(cè)定的方法，可消除real-time PCR中本底信號(hào)的影響，提高低豐度靶標(biāo)的擴(kuò)增靈敏度，簡(jiǎn)單計(jì)算出DNA模板拷貝數(shù)，而不需要采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為外標(biāo)。數(shù)字PCR在臨床診斷醫(yī)學(xué)、單細(xì)胞表達(dá)、轉(zhuǎn)基因定量、環(huán)境微生物檢測(cè)和下一代測(cè)序等方面發(fā)揮了重要作用[109]，但尚未見應(yīng)用數(shù)字PCR進(jìn)行肉類定量檢測(cè)的研究報(bào)道，但是由于數(shù)字PCR技術(shù)具有拷貝絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，相信在肉制品的摻假檢測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。

5 結(jié) 語(yǔ)

動(dòng)物源性食品的摻假、摻雜是食品產(chǎn)業(yè)中的重要問(wèn)題。以上方法，是近幾年應(yīng)用于肉制品種屬鑒別的主要方法。形態(tài)學(xué)方法發(fā)展較早，已經(jīng)從最初的更多依賴實(shí)驗(yàn)操作人員的光學(xué)顯微鏡技術(shù)發(fā)展為將電鏡和數(shù)據(jù)圖像分析相結(jié)合的新型鑒別方法；光譜學(xué)技術(shù)樣品制備簡(jiǎn)單，分析速度快，但常需要大量已知樣品建立模型，且模型通用性不強(qiáng)；基于蛋白水平的免疫技術(shù)操作簡(jiǎn)單，通量高，成本低，但是準(zhǔn)確度不高，常用作快速篩查手段；核酸檢測(cè)方法特異性、靈敏度高，結(jié)果較為準(zhǔn)確，成為了國(guó)際上肉類摻假檢驗(yàn)的主流方法，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)為肉類成分檢測(cè)開辟了新的途徑。目前，肉類產(chǎn)品的定性檢測(cè)方法研究較為充分，但是如何判定摻假成分是添加還是污染所致，如何確定摻假嚴(yán)重程度都需要可靠的定量技術(shù)作為依托，因此研發(fā)精準(zhǔn)的定量檢測(cè)技術(shù)將成為檢測(cè)方法的發(fā)展方向。

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Progress in Meat Adulteration Detection Techniques

REN Junan1,2, HUANG Wensheng1, GE Yiqiang2,3, CHEN Ying1,*
(1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. China Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China)

Currently, meat adulteration issues occur frequently, and severely impact import and export trade, consumers’rights and people’s health. The development of reliable and accurate testing methods has become a hot research topic in many countries. The most reported meat authenticity detection techniques for meat products include microscopic examination, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), liquid chromatography, tandem mass spectrometry and polymerase chain reaction, based on the characteristics of morphology, metabolites, proteins and nucleic acids. This paper reviews the progress in identification techniques for meat ingredients and their future trends are discussed.

meat products; authenticity; identification; detection technology

10.7506/spkx1002-6630-201601043

TS207.3

A

1002-6630（2016）01-0247-11

任君安, 黃文勝, 葛毅強(qiáng), 等. 肉制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 201 6, 37(1): 247-257. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601043. http://www.spkx.net.cn

REN Junan, HUANG Wensheng, GE Yiqiang, et al. Progress in meat adulteration detection techniques[J]. Food Science, 2016, 37(1): 247-257. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601043. http://www.spkx.net.cn

2015-01-27

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100807）；中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2014JK027）

任君安（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)與控制。E-mail：renja126@126.com

*通信作者：陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全與控制。E-mail：chenyingcaiq@163.com