馬　冰，代帥帥，程亞增，蔣彩虹，任　民，程立銳，楊愛國(guó)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

烤煙種質(zhì)資源SSR核心引物的篩選及驗(yàn)證

馬冰，代帥帥，程亞增，蔣彩虹，任民，程立銳，楊愛國(guó)*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

為篩選到適合烤煙品種利用的核心引物，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系，利用5份遺傳差異明顯的烤煙種質(zhì)對(duì)分布于煙草24條連鎖群上的2317對(duì)SSR引物進(jìn)行初步篩選，篩選出70對(duì)引物。再利用20份不同地理來源的烤煙種質(zhì)對(duì)初篩引物進(jìn)行復(fù)篩，最終確定24對(duì)核心引物。利用核心引物對(duì)20份烤煙種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，共得到85個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均PIC值為0.52，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.54。同時(shí)對(duì)這20份烤煙種質(zhì)進(jìn)行聚類分析和主坐標(biāo)分析，驗(yàn)證24對(duì)核心引物的有效性。結(jié)果顯示，兩種研究方法結(jié)論一致，與種質(zhì)親緣關(guān)系吻合度較高。表明該SSR核心引物體系準(zhǔn)確有效，可以適用于烤煙種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析。

烤煙；SSR核心引物；遺傳多樣性；聚類分析；主坐標(biāo)分析

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全世界120多個(gè)國(guó)家均有種植。其中我國(guó)主栽的是普通煙草種（Nicotiana tabacum L.）的烤煙類型。在長(zhǎng)期的烤煙育種過程中，由于集中使用幾個(gè)主體親本[1]，從而導(dǎo)致目前煙草品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄[2]。研究烤煙品種的遺傳多樣性，分析其親緣關(guān)系，對(duì)拓寬其種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)，科學(xué)、合理地選配親本組合具有重要的理論意義。

利用分子標(biāo)記分析種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系已經(jīng)在多種重要作物上廣泛開展[3-4]。普通煙草在植物分類上屬于茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana），其基因組大小約4.5 G，在目前已知的茄科植物中基因組較大，并且基因組中70%以上為重復(fù)序列[5]。煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究一直落后于其他作物，之前，煙草種質(zhì)遺傳分析主要采用ISSR和AFLP標(biāo)記[6-7]，自Bindler等[8]公布了煙草高密度SSR標(biāo)記遺傳圖譜后，SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[9]。與其他標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記多態(tài)性高，專一性強(qiáng)[10]，適合多倍體物種的遺傳分析。叢鑫等[11]利用45對(duì)SSR引物將78份抗PVY的煙草種質(zhì)按照遺傳多樣性劃分為3類。陳夏曄等[12]利用34對(duì)多態(tài)性SSR引物對(duì)73份煙草抗黑脛病種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明其遺傳多樣性較差。陳雅瓊等[13]和張雪廷等[14]利用SSR引物分別對(duì)烤煙、白肋煙及晾曬煙品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，證明了國(guó)內(nèi)烤煙遺傳背景狹窄，而晾曬煙品種間遺傳差異性較大。尹國(guó)英[15]利用SSR引物對(duì)140份煙草種質(zhì)進(jìn)行分析，同樣證明了晾曬煙遺傳多樣性豐富的結(jié)論。

目前，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行煙草種質(zhì)遺傳分析時(shí)，如何選擇有代表性的標(biāo)記是研究者面臨的一個(gè)問題。本研究利用煙草育種上常用的5份烤煙種質(zhì)對(duì)已公布的2317對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行初步篩選，再利用20份烤煙種質(zhì)對(duì)初篩獲得的引物進(jìn)行復(fù)篩和驗(yàn)證，以便尋找出適合煙草種質(zhì)遺傳分析的代表性標(biāo)記，為煙草種質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為我國(guó)烤煙育種過程中常用且表型性狀差異較大的5份煙草種質(zhì)，包括3份國(guó)內(nèi)種質(zhì)凈葉黃、小黃金1025、革新3號(hào)和2份美國(guó)引進(jìn)種質(zhì)NC82、Speight G-140。20份不同地理來源的烤煙種質(zhì)見表1。所有材料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫提供。材料均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)基地溫室種植，種植時(shí)間為2014年2月至2014年8月。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取 在5片真葉期每份材料隨機(jī)選取10株混合取樣，采用CTAB法[16]提取DNA，統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 擴(kuò)增體系為10 μL，含50 ng/μL模板DNA 1 μL、10 mol/L–1dNTPs 0.2 μL、50 ng/μL引物1 μL、5 U Taq Polymerase 0.2 μL、10×buffer 1 μL。使用Gene Amp PCR System 9700進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃（根據(jù)引物退火溫度調(diào)整）退火30 s，72℃ 1 min，共35次循環(huán)；72 ℃延伸7 min，12 ℃保存。使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染觀察并記錄數(shù)據(jù)。所用試劑均購于賽尚科貿(mào)（青島）有限公司。

1.2.3核心引物的篩選 利用5份烤煙育種常用種質(zhì)對(duì)已公布的2317對(duì)SSR引物進(jìn)行初步篩選，隨后利用20份不同地理來源的烤煙種質(zhì)對(duì)初篩出來的引物進(jìn)一步篩選，以穩(wěn)定性好、條帶清晰、易于統(tǒng)計(jì)、多態(tài)性信息量（PIC）較高并均勻分布在24條連鎖群上為標(biāo)準(zhǔn)，確定核心引物。引物由六合華大（北京）基因科技有限公司合成。

1.2.4核心引物的驗(yàn)證 利用軟件NTSYS-pc 2.11[17]，采用類平均法（UPGMA），利用篩選出的SSR核心引物對(duì)20份烤煙主要親本進(jìn)行聚類分析和主坐標(biāo)（PCoA）分析[18]，驗(yàn)證核心引物的有效性。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 以0、1、9統(tǒng)計(jì)SSR引物擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。利用DataFormater軟件[19]將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。利用軟件PowerMarker 3.25進(jìn)行遺傳多樣性分析[20]。其中Simpson’s多樣性指數(shù)也稱位點(diǎn)多態(tài)性信息量（PIC），其計(jì)算方法為PIC=1-Σ Pi2[21]；基因型多樣性H′= -Σ Pi ln Pi[22]，Pi為第i個(gè)等位基因變異出現(xiàn)的頻率。

表1　20份供試煙草種質(zhì)及其地理來源Table1　Geographical origins of twenty tested germplasms

2　結(jié) 果

2.1SSR核心引物的篩選

用5份表型和遺傳差異較大的主要烤煙親本對(duì)2317對(duì)核心引物進(jìn)行初步篩選，從中篩選到70對(duì)多態(tài)性較好、帶型清晰的引物，占引物總數(shù)的3.02%。隨后，采用20份不同地理來源的烤煙種質(zhì)對(duì)70對(duì)初篩得到的引物進(jìn)行復(fù)篩，最終確定24對(duì)SSR核心引物，占復(fù)篩引物的34.29%，占總引物的1.04%。

2.2SSR引物的多態(tài)性信息

24對(duì)SSR標(biāo)記在20份烤煙種質(zhì)中共檢測(cè)出85個(gè)等位變異，平均每個(gè)引物等位位點(diǎn)數(shù)為3.54?；蛐投鄻有苑治鲲@示不同引物的變幅為0.19～0.77，平均為0.58；引物多態(tài)性信量（PIC）為0.18～0.73，平均為0.52，說明引物總體上鑒別能力尚可。其中引物PT53936的PIC值最高，表明其有極高的鑒別能力，可以將絕大多數(shù)材料鑒別出來（表2）。

表2　核心引物在參試種質(zhì)中的多態(tài)性信息Table2　Polymorphism information of core primers in tested germplasms

2.3 核心引物的有效性驗(yàn)證

2.3.1核心引物聚類分析 根據(jù)遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA方法對(duì)20份烤煙種質(zhì)（編號(hào)1～20）進(jìn)行聚類分析（圖1）。當(dāng)聚類閥值在0.52時(shí)，可將20份種質(zhì)明顯分為2個(gè)類群，一類為美國(guó)種質(zhì)和中國(guó)臺(tái)灣種質(zhì)（編號(hào)1～10），另一類為中國(guó)大陸種質(zhì)（編號(hào)11～20）。第1類群又可分為3個(gè)亞群，第1亞群包括Coker319（1）和3份中國(guó)臺(tái)灣煙種質(zhì)T.T.8（8）、T.T.9（10）、T.T.10（9），從本研究來看，可初步確定中國(guó)臺(tái)灣種質(zhì)與美國(guó)種質(zhì)有較近的親緣關(guān)系；第2亞群包括FC8（2）、K326（3）、RG8（6）和Speight G-28（7）4份種質(zhì)，都是由Hicks直接或間接育成；NC89（4）和NC567（5）為第3類群，2份種質(zhì)都與NC2326相關(guān)，類群劃分符合種質(zhì)系譜關(guān)系。第2類群也可分為3個(gè)亞群，第1亞群為單育2號(hào)（12）、金星6007（13）、中煙14（17）和中煙15（18）等4份種質(zhì)，它們都直接或間接來源于地方種質(zhì)滕縣金星；第2亞群有CF-90-NF（11）和中煙86（19），這兩份種質(zhì)的遺傳背景中有兩個(gè)共同的親本凈葉黃和Speight G-28；第3亞群的凈葉黃（14）、潘圓黃（15）、長(zhǎng)脖黃（16）和中煙98（20）4份種質(zhì)都具有長(zhǎng)脖黃的背景。

2.3.2主坐標(biāo)分析（PCoA） 前兩個(gè)主坐標(biāo)可以解釋的方差貢獻(xiàn)率為46.06%，其中第一個(gè)可以解釋的方差貢獻(xiàn)率為34.59%。如圖2所示，20份種質(zhì)可以明顯的分為2類。第1類群有7份美國(guó)種質(zhì)（1～7）和3份中國(guó)臺(tái)灣種質(zhì)（8～10）；第2類群為10份中國(guó)大陸種質(zhì)（11～20）。主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致，說明該套核心引物適用于烤煙種質(zhì)的遺傳多樣性分析。

圖1　基于核心引物驗(yàn)證材料的聚類分析Fig. 1　Cluster dendrogram of the tested accessions based on verification with core primers

圖2　核心引物對(duì)驗(yàn)證材料進(jìn)行主坐標(biāo)分析的散點(diǎn)圖Fig. 2　The scatter plot of the principal coordinates analysis on the tested accessions based on verification with core primers

3　討 論

國(guó)內(nèi)外利用SSR標(biāo)記對(duì)煙草種質(zhì)資源篩選以及驗(yàn)證工作日趨完善，楊柳等[23]運(yùn)用102對(duì)SSR引物對(duì)25份普通煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)97個(gè)等位基因片段，平均的等位基因片段數(shù)6.9個(gè)，PIC均值0.694，找到14個(gè)鑒定性較好的引物。陳雅瓊等[13]利用SSR標(biāo)記與熒光技術(shù)相結(jié)合的新方法，通過36對(duì)引物對(duì)63份烤煙和8份白肋煙進(jìn)行遺傳分析，進(jìn)一步證實(shí)了國(guó)內(nèi)栽培品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，豐富度低的結(jié)論[24]。而張雪廷等[14]則通過30對(duì)SSR引物對(duì)38份晾曬煙進(jìn)行多樣性分析，平均等位基因數(shù)為5.77個(gè)，其研究表明晾曬煙有著極好的遺傳豐富性。Fricano等[25]利用49對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)烤煙、深色曬晾煙、白肋煙等6類312份煙草種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，312份煙草材料相同種質(zhì)間烤煙和白肋煙差異相對(duì)較少，而晾曬煙差異較大。

本研究對(duì)Bindler等[8]公布的24條煙草連鎖群的2317對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行逐一篩選，最終確定了一套（24對(duì)）適合烤煙品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的核心SSR標(biāo)記，該組SSR標(biāo)記具有以下特征和優(yōu)點(diǎn)：第一，該組引物擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，易于操作，多態(tài)性高。利用5份種質(zhì)對(duì)2317對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行了統(tǒng)一擴(kuò)增，最大程度保證了篩選出的SSR標(biāo)記擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰單一，操作方便。第二，適合烤煙種質(zhì)間的遺傳多樣性分析。雖然研究中供試種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，親緣關(guān)系相對(duì)簡(jiǎn)單，但聚類分析和主坐標(biāo)分析結(jié)果證實(shí)，20份供試種質(zhì)的類群劃分真實(shí)反映了供試材料的群體結(jié)構(gòu)、地理來源和親緣關(guān)系，說明所選的24對(duì)核心引物可以清楚的檢測(cè)出供試品種的遺傳多樣性，充分說明了該組引物高效可靠。

Lewis等[26]認(rèn)為，在烤煙育種過程中集中利用少數(shù)親本是導(dǎo)致遺傳多樣性降低的主要原因。因此，在烤煙育種過程中，利用合適的分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，選擇遺傳差異大的種質(zhì)作為親本，有助于擴(kuò)大雙親的遺傳基礎(chǔ)，提高煙草育種的效率。

4　結(jié) 論

本研究通過不同來源的煙草種質(zhì)資源篩選出適合烤煙品種使用的24對(duì)核心引物，通過聚類分析和主坐標(biāo)分析驗(yàn)證，證明核心引物可以區(qū)分煙草品種間的差異，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系，也可用于烤煙種質(zhì)資源篩選、遺傳多樣性分析，烤煙核心種質(zhì)構(gòu)建，以及相關(guān)育種研究工作。結(jié)果中引物PT53936的PIC值較高，是核心引物中鑒定性最好的引物，對(duì)煙草種質(zhì)的篩選有重要的作用。

[1] Moon H S, Nicholson J S, Lewis R S. Use of transferable Nicotiana tabacum L. microsatellite markers for investigating genetic diversity in the genus Nicotiana[J]. Genome, 2008, 51(8): 547-559.

[2] 常愛霞，賈興華，羅成剛，等. 我國(guó)主要烤煙品種的親源系譜分析及育種工作建議[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2013， 34（1）：1-6.

[3] 趙慶友，張亞東，王才林，等. 30個(gè)粳稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2010，11（2）：218-223.

[4] 程春明，楊存義，年海，等. 江西野生大豆遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12（6）：928-933.

[5] Arumuganathan K, Earle E D. Nuclear DNA content of some important plant species[J]. Plant Mol Biol Rep, 1991, 9: 208-218.

[6] 祁建民，梁景霞，陳美霞，等. 應(yīng)用ISSR與SRAP分析煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳演化關(guān)系[J]. 作物學(xué)報(bào)，2012，38（8）：1425-1434.

[7] 李鳳霞，王衛(wèi)峰，孫玉合，等. 煙草屬植物遺傳多樣性和親緣進(jìn)化關(guān)系的熒光AFLP分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（12）：2418-2427.

[8] Bindler G, Plieske J, Bakaher N, et al. A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L.) obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theor Appl Genet, 2011, 123(2): 219-230.

[9] 葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等. SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草品種遺傳多樣性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009（1）：56-62.

[10] 尹國(guó)英，楊小燕，何其波，等. 鑒定煙草種質(zhì)資源SSR核心引物篩選和驗(yàn)證[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，15（5）：960-965.

[11] 叢鑫，劉艷華，戴培剛，等. 抗PVY煙草種質(zhì)的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（3）：679-684.

[12] 陳夏曄，劉艷華，張興偉，等. 抗黑脛病煙草種質(zhì)的遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（7）：58-63.

[13] 陳雅瓊，王衛(wèi)峰，丁安明，等. 基于SSR熒光標(biāo)記分析我國(guó)主要審（認(rèn)）定烤煙及白肋煙品種遺傳多樣性[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2013（2）：98-105.

[14] 張雪廷，童治軍，焦芳嬋，等. 38份晾曬煙種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的SSR分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013（4）：653-658，678.

[15] 尹國(guó)英. 煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性和應(yīng)用潛力分析以及核心SSR引物篩選[D]. 重慶：西南大學(xué)，2013.

[16] Bindler G, van der Hoeven R, Gunduz I, et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theor Appl Genet, 2007, 114: 341-349.

[17] Rohlf F J. NTSYS-pc version 2.2 Numerical taxonomy and multivariate analysis system[M]. New York: Exeter Software, 2000.

[18] Sneath P H A, Sokal R R. Numerical taxonomy[M]. San Francisco: Freeman, 1973.

[19] 樊文強(qiáng)，蓋紅梅，孫鑫，等. SSR數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換軟件Data Formater[J]. 分子植物育種，2016（1）：265-270.

[20] Liu K, Muse S V. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis[J]. Bioinformatics, 2005, 21: 2128-2129.

[21] Elston R C. Polymorphism information content. Encyclopedia of Biostatistics[M]. New York: John Wiley and Sons, 2005.

[22] 潘兆娥，孫君靈，王西文，等. 基于棉花參比種質(zhì)的SSR多態(tài)性核心引物篩選[J]. 生物多樣性，2008，16（6）：555-561.

[23] 楊柳，汪斌，童治軍，等. 25份普通煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR標(biāo)記分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013（2）：171-175.

[24] 肖炳光，楊本超. 利用ISSR標(biāo)記分析煙草種質(zhì)的遺傳多樣性[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（10）：2153-2161.

[25] Fricano A N, Bakaher M, Del Corvo P, et al. Molecular diversity, population structure, and linkage disequilibrium in a worldwide collection of tobacco (Nicotiana tabacum L.) germplasm[J]. BMC Genet, 2012, 13: 18.

[26] Lewis R S, Nicholson J S. Aspects of the evolution of Nicotiana tabacum L. and the status of the United States Nicotiana germplasm collection[J]. Genet Resour Crop Ev, 2007, 54: 727-740.

Screen and Identification of SSR Core Primers for Flue-cured Tobacco Germplasm

MA Bing, DAI Shuaishuai, CHENG Yazeng, JIANG Caihong, REN Min, CHENG Lirui, YANG Aiguo*
(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

The purpose of our study is screening out suitable SSR core primers which can accurately evaluate germplasm genetic diversity and genetic relationship of flue-cured tobacco. In this study, 2317 pairs of SSR primers distributed in 24 chromosomes were initially screened on 5 flue-cured tobacco cultivars with distant genetic relationship, and 70 pairs of primers were screened out. Then 20 flue-cured tobacco cultivars with different geographical origins were chosen to screen the initial selected primers. Finally, a total of 24 pairs of SSR core primers were identified. The genetic diversity of 20 flue-cured tobacco cultivars was nalyzed using these core markers. As a result, 85 polymorphism bands were acquired. The average PIC (Polymorphism information content) value is 0.52 and the mean number of alleles detected for each locus was 3.54. These 20 tobacco cultivars were conducted on both genetic diversity analysis and PCoA (Principal Coordinate Analysis) to demonstrate the effectiveness of this 24 core primers. These two methods exhibited similar phylogenesis among the tested cultivars and the results of molecular clustering largely agreed with the pedigree relationship. The results showed that the core primers were effective and accurate, and could be applied to flue-cured germplasm identification and genetic diversity study in tobacco.

flue-cured tobacco; SSR core primers; genetic diversity; cluster analysis; PCoA

S572.03

1007-5119（2016）05-0001-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.001

中國(guó)煙草總公司煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng)“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標(biāo)記開發(fā)及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009）、“煙草重要性狀基因發(fā)掘及功能標(biāo)記開發(fā)”（110201301008）；中國(guó)煙草總公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目“煙草抗主要病毒病（TMV、CMV、PVY）基礎(chǔ)材料創(chuàng)制及育種利用”（110201402006）

馬 冰（1992-），男，在讀碩士。研究方向：煙草遺傳育種。E-mail：jiuzhongma@163.com。*通信作者，E-mail：yangaiguo@caas.cn

2016-03-15

2016-05-22