陳 芳 程磊雨 王 雙 袁其朋

（北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點(diǎn)實驗室，北京 100029）

糖基化學(xué)品的生物制造

陳 芳 程磊雨 王 雙 袁其朋

（北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點(diǎn)實驗室，北京 100029）

目前，糖基化學(xué)品的合成主要通過提取法、化學(xué)合成法來生產(chǎn)，然而這些合成法存在嚴(yán)重的弊端?；瘜W(xué)合成法會帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染且生物活性低；提取法收率較低，原料有限。代謝工程作為一種重要糖基化學(xué)品合成工具，已經(jīng)成為替代原有化學(xué)合成方法的有效策略。綜述了N-乙酰氨基葡萄糖、木糖醇、海藻糖、甘草酸等幾種應(yīng)用廣泛的精細(xì)糖基化學(xué)品的生物制造與應(yīng)用，并討論了生物制造糖基化學(xué)品的前景和挑戰(zhàn)。

由于工業(yè)革命，石油成為能量的主要來源，石油化工產(chǎn)品影響著全球市場，已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)的血液。過度依賴石油一方面加快了城市化進(jìn)程，另一方面造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和破壞。由于燃料和化學(xué)品主要產(chǎn)自于石油化工產(chǎn)品，在過去的150年，石油的過度開采和消耗造成了其儲存量的急劇下降。一般來說，通過化學(xué)法生產(chǎn)化學(xué)品成本較低。然而以石油為基礎(chǔ)的制造方法有以下嚴(yán)重缺點(diǎn)：①催化劑的毒性造成環(huán)境污染且價格昂貴；②產(chǎn)生的中間體有毒；③過程需要高溫高壓；④高能量輸入；⑤生產(chǎn)立體特異性化合物困難。石油危機(jī)和環(huán)境惡化迫使人類尋找其他方法生產(chǎn)石油基燃料和化學(xué)品，其中生物法生產(chǎn)化學(xué)品受到了廣泛關(guān)注。天然產(chǎn)物是食品添加劑、藥物、保健品的豐富來源，通過提取法生產(chǎn)這些化學(xué)品低效且不經(jīng)濟(jì)。利用微生物代謝工程生產(chǎn)石油基化學(xué)品和天然化合物是非常有前景的替代方法。

1 N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的生物合成

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）和氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）是黏多糖類物質(zhì)如透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素前體的主要組成部分，長期以來被用作藥物和保健品治療骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)護(hù)理1。隨著人口老齡化的增長，對這些化合物的需求將持續(xù)增長，預(yù)計2017年全球N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖產(chǎn)量將達(dá)到2.66萬噸2。目前，N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖主要通過酸解螃蟹殼和蝦殼幾丁質(zhì)來生產(chǎn)。然而，這種提取方法存在一些問題，如嚴(yán)重的環(huán)境污染及在消費(fèi)人群中存在潛在的過敏反應(yīng)等。同時，原材料的供給遠(yuǎn)不能滿足日益增長的生產(chǎn)需要。微生物發(fā)酵法的出現(xiàn)為N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的生產(chǎn)提供了一個綠色且可持續(xù)的途徑。Deng等3選擇大腸桿菌作為宿主菌，通過過表達(dá)6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（G lmS）同時抑制氨基葡萄糖分解基因，產(chǎn)物產(chǎn)量提高了15倍，氨基葡萄糖達(dá)到60mg/L；由于6-磷酸氨基葡萄糖對GlmS有很強(qiáng)的抑制作用，通過易錯PCR篩選得到突變體解除抑制作用，過表達(dá)突變酶，氨基葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到17g/L；為了得到另一個發(fā)酵產(chǎn)物N-乙酰氨基葡萄糖，引入了外源6-磷酸氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶（GNA1），1L發(fā)酵罐中N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到110g/L。Zhang等4通過優(yōu)化溶氧來提高Aspergillus sp. BCRC 31742氨基葡萄糖的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在0～12h和12～60h溶氧為30%和50%時，比生產(chǎn)率最高。與大腸桿菌不同的是，B acillus subtilis長期被用作生產(chǎn)GRAS級（一般公認(rèn)為安全的）醫(yī)學(xué)上重要的生化試劑以及工業(yè)上有用成分的宿主5。Liu等6通過過表達(dá)2個關(guān)鍵酶（內(nèi)源GlmS以及來源于釀酒酵母的外源GNA1），敲除3個N-乙酰氨基葡萄糖分解路徑，N-乙酰氨基葡萄糖在搖瓶中最高產(chǎn)量達(dá)到1.85g/L，3L發(fā)酵罐中達(dá)到5.19g/L。Liu等7通過DNA支架進(jìn)行關(guān)鍵酶的空間調(diào)整以及敲除spo0A和sigE基因阻礙孢子形成來提高Bacillus subtilis中N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量，最終3L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到20.58g/L。Liu等8將N-乙酰氨基葡萄糖的合成路徑劃分成3個模塊，包括N-乙酰氨基葡萄糖的合成、糖酵解路徑、肽聚糖的合成，利用模塊優(yōu)化的思路提高產(chǎn)量；首先優(yōu)化兩個關(guān)鍵酶（GlmS、GNA1）的啟動子強(qiáng)度增強(qiáng)N-乙酰氨基葡萄糖合成模塊的轉(zhuǎn)錄，其次敲除基因ldh（乳酸脫氫酶）和pta（磷酸轉(zhuǎn)乙?；福┳钄喔碑a(chǎn)物乳酸和乙酸的合成，同時利用sRNAs和Hfq protein抑制pfk和glmM的表達(dá)，最后組裝不同強(qiáng)度的3個模塊，優(yōu)化產(chǎn)量，最終3L發(fā)酵罐中N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到31.65g/L。

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2 透明質(zhì)酸的生物合成

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種在人體中普遍存在的多糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成，對許多組織和細(xì)胞都有重要的功能，應(yīng)用于臨床已經(jīng)超過30年。透明質(zhì)酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式是動物組織提取法，由于透明質(zhì)酸容易與蛋白聚糖形成聚合物，這

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3 海藻糖的生物合成

海藻糖是一種安全、可靠的天然糖類。在惡劣條件下，可以對物種的生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)揮較好的保護(hù)作用，素有“生命之糖”的美譽(yù)，在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有巨大潛力。目前海藻糖的制備方法有化學(xué)合成法、微生物法、酶合成法和基因工程法等。

海藻糖的化學(xué)合成法產(chǎn)率低，分離比較困難，且污染環(huán)境。微生物提取法是以酵母等含海藻糖的微生物為提取源提取海藻糖的方法。另外，可以通過基因重組等方法選育出高產(chǎn)海藻糖的菌種，再通過發(fā)酵制備海藻糖，但此法產(chǎn)率低，副產(chǎn)物也較多。

酶合成法是以葡萄糖、麥芽糖和淀粉等為底物，通過相應(yīng)的酶（如海藻糖酶、海藻糖合酶等）轉(zhuǎn)化制備海藻糖。酶法合成是一種清潔簡便的生產(chǎn)方法，且轉(zhuǎn)化率較高，可大大降低生產(chǎn)成本。

基因工程法是將海藻糖合成酶的基因?qū)胫参锘蛭⑸铮霉こ涛⑸锘蜣D(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)海藻糖。Tsusaki等13分別從Pimelobacter sp.R48和水生棲熱菌（Thermus aquaticus ATCC33923）這兩種菌中克隆出海藻糖合酶基因。Wei等14獲得了褐色喜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium g l u t a m i c u m）、耐放射異球菌（Deinococcus radiodurans）中的TreS基因，并將這些外源基因成功在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，在生產(chǎn)中取得了較好的成果?；蚬こ谭ㄉa(chǎn)海藻糖具有巨大的發(fā)展前景和空間。

海藻糖還可以作為生物大分子的特效保護(hù)劑和細(xì)胞穩(wěn)定劑，在醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域用來保護(hù)血液制品、疫苗、抗體、酶等生物活性物質(zhì)。LEE等15合成了一種水凝膠海藻糖，并研究了其對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響。植酸酶與水凝膠海藻糖形成共聚體后，可以將植酸酶在90℃的活性由39%提高到100%，且酶還可以回收利用。

海藻糖具有極強(qiáng)的保濕作用和防曬、防紫外線等功能，可應(yīng)用于保濕、防曬等化妝品領(lǐng)域。將海藻糖合成基因?qū)胱魑锟膳嘤隹购悼箖龅霓D(zhuǎn)基因作物，提高農(nóng)作物的抗旱抗寒能力。荷蘭植物生物技術(shù)公司把OtsBA基因?qū)胩鸩?、馬鈴薯中，在獲得大量廉價海藻糖的同時增強(qiáng)了植物的抗旱性和抗寒性16。

目前，我國的海藻糖生產(chǎn)技術(shù)還不夠成熟先進(jìn)，因此加快海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)核心技術(shù)的研究和應(yīng)用開發(fā)，將給我國相關(guān)行業(yè)的新產(chǎn)品開發(fā)帶來新的機(jī)遇和巨大的應(yīng)用價值。

4 木糖醇的生物合成

木糖醇又名木戊醇，廣泛存在于各種水果、蔬菜、谷類中，但含量低。木糖醇的生產(chǎn)主要有提取、化學(xué)合成和生物發(fā)酵法。

提取法是用固液萃取的方法將木糖醇從果蔬食物中提取出來，但含量較低，成本高，不能滿足市場需要。傳統(tǒng)化學(xué)合成法是在稀酸催化劑的作用下，植物纖維原料中的木聚糖經(jīng)水解可制得木糖，木糖在一定壓力下，以鎳為觸媒，加氫制得木糖醇。在工業(yè)化大生產(chǎn)中，主要以傳統(tǒng)的化學(xué)加氫法生產(chǎn)木糖醇，但弊端較多。雖技術(shù)成熟，但成本高，不利于木糖醇的推廣應(yīng)用。

生物轉(zhuǎn)化法是一種新的有效的木糖醇生產(chǎn)途徑，主要是將農(nóng)業(yè)廢棄物中所含的多縮戊糖經(jīng)稀酸水解后得到木糖水解液，然后利用微生物發(fā)酵水解液中的木糖獲得木糖醇，是一種很有前途的生產(chǎn)方法。在微生物中，酵母轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)木糖醇性能最為優(yōu)越，特別是假絲酵母17。Jia等

18評估了熱帶假絲酵母發(fā)酵玉米芯半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇的可行性，并優(yōu)化了條件。發(fā)現(xiàn)通過pH的調(diào)整和活性炭處理可以分別將木糖醇的含量提高到0.77g/g和2.45g/（L·h）。

另外，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行菌種選育，從而提高菌種轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)木糖醇的能力成為研究的熱點(diǎn)。

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K I M等19利用S a c c h a ro m y c e s cerevisiae 280539-40發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，該菌的染色體上克隆了4個拷貝的來自Pichia stipitis的木糖還原酶XYL1基因，結(jié)果表明其體積效率可穩(wěn)定在0.18g/（L·h），木糖醇產(chǎn)量達(dá)到 15g/L。

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Dhar等20從氧化葡萄糖酸桿菌中克隆出編碼木糖醇脫氫酶（XDH）的基因，并過表達(dá)培養(yǎng)研究，結(jié)果顯示重組菌培養(yǎng)得到的木糖醇產(chǎn)量是野生型菌株的3倍，達(dá)到31g/L，是目前利用工程菌生產(chǎn)木糖醇產(chǎn)量最高的報道。

木糖醇是采用高新技術(shù)生產(chǎn)的具有很高實用價值的化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。木糖醇是一種天然甜味劑，食用時有一種涼爽愉快的口感特性，因此常添加在各種食品中（如口香糖、糖果等）。木糖醇還是人體正常糖類代謝的中間體，在體內(nèi)的代謝與胰島素?zé)o關(guān)，故可用于糖尿病患者食品的生產(chǎn)，且木糖醇不致齲還有防齲齒的作用。

木糖醇工業(yè)發(fā)展迅速，原料易得，產(chǎn)品用途廣泛，市場前景廣闊，是一個很有發(fā)展前途的工業(yè)；但其生產(chǎn)工藝落后，很大程度上制約了木糖醇工業(yè)的發(fā)展。努力探索生物發(fā)酵法制備木糖醇工藝，進(jìn)而產(chǎn)業(yè)化，是木糖醇生產(chǎn)發(fā)展的方向。

5 阿卡波糖的生物合成

阿卡波糖（acarbose）作為第一個用于臨床治療Ⅱ型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物，自上市以來，因其高效安全而得到廣泛應(yīng)用。阿卡波糖分子式為C25H43NO18，是典型的C7N-氨基環(huán)醇類假性四糖物質(zhì)，由氨基環(huán)醇、4-氨基-4，6-二脫氧葡萄糖和麥芽糖組成。

目前工業(yè)化生產(chǎn)中所涉及到的菌株主要來自于游動放線菌Actinoplanes sp. SE50/110，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了另一生產(chǎn)菌鏈霉菌Streptomyces glaucescens GLA.O。兩者既有共同之處，也存在一定的差異。在Actinoplanes sp. SE50已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的acb基因簇（目前唯一一個詳細(xì)闡明阿卡波糖合成途徑的基因簇）包含了25個與阿卡波糖合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酶基因21。阿卡波糖的合成分3個過程。①氨基環(huán)醇的合成：7-P-景天庚糖（sedo-heptulose-7-phosphate）通過分子內(nèi)環(huán)化、差向異構(gòu)、脫氫、脫水、磷酸化等一系列酶促反應(yīng)生成NDP-1-epi-valienol-7-phosphate。②4-氨基-4，6-二脫氧葡萄糖的合成：D-1-磷酸葡萄糖經(jīng)過核苷酸化、脫水、轉(zhuǎn)氨基等反應(yīng)，生成dTDP-4-氨基-4，6-雙脫氧葡萄糖。③阿卡波糖的合成：NDP-1-epi-valienol-7-phosphate和dTDP-4-氨基-4，6-雙脫氧葡萄糖在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，生成dTDP-acarviose-7-phosphate，然后與麥芽糖分子直接結(jié)合生成acarbose-7-phosphate，至此完成胞內(nèi)合成。在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助下，dTDP-acarviose-7-phosphate跨膜運(yùn)輸至胞外，發(fā)生去磷酸化作用最后生成阿卡波糖。

Rockser等22發(fā)現(xiàn)了另外一種阿卡波糖生產(chǎn)菌Streptomyces glaucescens GLA.O。研究發(fā)現(xiàn)該菌種攜帶有阿卡波糖合成基因gac基因簇，與acb基因簇有很大相似性，但C7N-環(huán)醇合成的途徑存在較大不同?？偟膩碚f，目前發(fā)現(xiàn)的兩種能夠生產(chǎn)阿卡波糖的微生物，其體內(nèi)合成途徑大致相同。整個過程中雖然涉及到不同來源的酶，但保持了很高的同源性。

6 甘草酸、甘草次酸的生物組成

甘草是中藥常用藥材，其主要藥理學(xué)活性物質(zhì)為甘草酸（GA）和甘草次酸（GTA）。甘草酸類藥物在體內(nèi)代謝過程研究已經(jīng)較為成熟：口服的甘草酸類藥物經(jīng)過胃酸水解或者肝臟中β-D-葡萄糖醛酸酶代謝成為3-單-葡萄糖酸甘草次酸，后者在肝臟中進(jìn)一步代謝進(jìn)入腸道，經(jīng)過腸道中鏈霉菌轉(zhuǎn)變?yōu)?8-β-3-O-β-D葡萄糖甘草次酸和3-表-甘草次酸而發(fā)揮藥物生物活性23。由于葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）具有極性適中、甜度高、更好的藥理活性與生物安全性的特點(diǎn)，目前更為眾多學(xué)者關(guān)注。生物法生產(chǎn)GAMG主要利用β-葡萄糖醛酸苷酶（β-GUS）水解甘草酸得到。Song等24通過克隆基因，成功構(gòu)建了β-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌異源表達(dá)體系，但存在重組酶對鍵選擇差的問題，限制了酶法制備GAMG的工業(yè)化應(yīng)用。呂波等25以β-葡萄糖醛酸苷酶為研究對象，溫度誘導(dǎo)表達(dá)噬菌體裂解酶SRRZ實現(xiàn)原位裂解，構(gòu)建了集培養(yǎng)、產(chǎn)酶、裂解和反應(yīng)于一體的一鍋法甘草酸鍵選擇篩選體系，并獲得了一系列鍵選擇性高的突變酶。

7 前景和挑戰(zhàn)

利用微生物合成糖基化學(xué)品分為3個范疇。①利用傳統(tǒng)的代謝工程實現(xiàn)簡單、天然的糖基化學(xué)品的生產(chǎn)；②生產(chǎn)糖基化學(xué)品前體化合物，再通過化學(xué)合成得到目標(biāo)化合物；③代謝工程實現(xiàn)非天然糖基化學(xué)品的生產(chǎn)。

新的代謝路徑的建立通常需要延伸和調(diào)控原始的代謝。因此，可以利用合成生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程的手段來克服提高產(chǎn)量過程中遇到的瓶頸。調(diào)控代謝途徑、微調(diào)蛋白表達(dá)水平以及提高催化效率已通過反義R N A26、MAG27、劃分代謝路徑28、DNA /蛋白質(zhì)支架 、定向進(jìn)化29等近期發(fā)展起來的技術(shù)得以實現(xiàn)。

盡管已經(jīng)建立了生物合成糖基化學(xué)品的代謝路徑，但能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的并不多，為了實現(xiàn)生物合成的工業(yè)化仍然有許多困難需要克服。首先，宿主微生物必須經(jīng)過系統(tǒng)地改造，才能實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)；此外，通過過程優(yōu)化和放大生產(chǎn)降低成本；最后需要保證分離過程的經(jīng)濟(jì)和有效。

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10.3969/j.issn.1674-0319.2016.05.005

袁其朋，博士，教授。研究方向包括天然產(chǎn)物的生物合成與代謝調(diào)控，功能因子的酶催化轉(zhuǎn)化與活性研究，天然產(chǎn)物的分離提取工藝研究，天然產(chǎn)物的生產(chǎn)過程集成及工業(yè)化研究。

E-mail：yuanqp@mail.buct.edu.cn