孫振歐，王曉彬，王紅，2，穆婉菊，張澤生，王浩，3，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；3.國(guó)家薯類(lèi)深加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，河北秦皇島066000）

黑豆皮提取物升高內(nèi)源抗氧化酶延長(zhǎng)果蠅壽命

孫振歐1，王曉彬1，王紅1，2，穆婉菊1，張澤生1，王浩1，3，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；3.國(guó)家薯類(lèi)深加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，河北秦皇島066000）

黑豆因富含高含量的花青素而被作為天然食品抗氧化劑。本研究探討黑豆皮提取物（Black Soybean Coat Extract，BSCE）對(duì)果蠅壽命的影響及其作用機(jī)制。擬以雄性黑腹果蠅為動(dòng)物模型，飼喂添加0、0.5、1.5、4.5mg/mLBSCE的培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)果蠅壽命，測(cè)定果蠅體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力，丙二醛（malondialdehyde，MDA）及蛋白質(zhì)羰基的含量。Real Time-PCR法測(cè)定果蠅體內(nèi)SOD、CAT、Nrf2及MTH的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示飼喂BSCE可以顯著延長(zhǎng)果蠅的平均壽命（1.5、4.5mg/m L，P＜0.05）；飼喂4.5mg/m LBSCE可以顯著升高果蠅體內(nèi)Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和CAT酶活力（P＜0.05）并極顯著降低蛋白質(zhì)羰基含量和MDA含量（P＜0.01）。Real Time-PCR結(jié)果顯示，給予4.5mg/mLBSCE能夠顯著上調(diào)Mn-SOD、CATmRNA表達(dá)水平（P＜0.05）且極顯著上調(diào)Cu-Zn-SOD、Nrf2mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。因此，黑豆皮提取物可以通過(guò)升高內(nèi)源性抗氧化酶SOD和CAT活性延長(zhǎng)果蠅壽命，且其調(diào)節(jié)機(jī)制與MTH基因有一定聯(lián)系。

黑腹果蠅；黑豆皮提取物；酶活；抗氧化

1　引言

黑豆（Black Soybean）又名櫓豆、烏豆，味甘性平，廣泛種植于我國(guó)河北、山西、陜西等地，因其富含蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸，同時(shí)含有多種微量元素、維生素及異黃酮、強(qiáng)心苷、谷胱甘肽、蘆丁、大豆皂苷、花色苷等營(yíng)養(yǎng)成分，自古即為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用的特色糧油作物［1-2］。至2015年底，已有許多學(xué)者研究證實(shí)黑豆皮具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性［3-4］。Xu等基于DPPH和FRAP方法測(cè)量發(fā)現(xiàn)，黑豆總抗氧化能力90％集中于黑豆皮內(nèi)［5］。趙艷威等發(fā)現(xiàn)黑豆皮可以提高糖尿病大鼠血清中超氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽活性，減少M(fèi)DA生成，提高大鼠抗氧化能力［6］。楊樂(lè)民等發(fā)現(xiàn)黑豆皮提取物可以顯著清除DPPH自由基和羥自由基，其清除率相當(dāng)于維生素C的28.8％和47.0％；總抗氧化能力相當(dāng)于維生素C的10.2％［7］。Takahashi等研究發(fā)現(xiàn)，與黃豆相比，黑豆皮可以使低密度脂蛋白氧化滯后時(shí)間顯著延長(zhǎng)［8］。

目前，基于動(dòng)物模型探討黑豆皮對(duì)壽命影響的研究尚且匱乏。Oregon K野生型黒腹果蠅（Drosophila melanogaster）因其代謝途徑和衰老基因與人類(lèi)十分相似，常被作為研究衰老因素的模式生物［9-10］。本實(shí)驗(yàn)研究黑豆皮提取物對(duì)雄性黑腹果蠅壽命、內(nèi)源性抗氧化酶活力，丙二醛及蛋白質(zhì)羰基的影響，并通過(guò)Real Time-PCR技術(shù)研究黑豆皮提取物對(duì)相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控，探討其延緩衰老的作用機(jī)制。

2　材料與方法

2.1儀器與設(shè)備

HWS-850智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；UVmini-1240紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；Real Time-PCR儀MyiQ2：美國(guó)BIO-RAD公司。

2.2材料與試劑

OregonK野生型黒腹果蠅（Drosophilamelanogaster）：天津科技大學(xué)食品添加劑與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究室。黑豆皮提取物（BSCE）：天津尖峰生物科技有限公司。Trizol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq：寶生物生物工程有限公司（Takara）。SOD、CAT、MDA、蛋白質(zhì)羰基試劑盒：南京建成生物工程研究所。無(wú)水葡萄糖、瓊脂粉、對(duì)羥基苯甲酸乙酯均為分析純；玉米粉為市售。

2.3方法

2.3.1飼養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)選用Oregon K野生型雄性黑腹果蠅，飼養(yǎng)條件、實(shí)驗(yàn)分組及果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方參考實(shí)驗(yàn)室前期文獻(xiàn)方法［11］。給藥組培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.5、1.5、4.5mg/mL黑豆皮提取物。

2.3.2果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

果蠅飼養(yǎng)條件及分組同上。每4天更換培養(yǎng)基，剔除死亡果蠅并計(jì)數(shù)，至各組果蠅全部死亡。計(jì)算果蠅平均壽命和最高壽命（以最后存活的10％果蠅平均壽命計(jì)）。

2.3.3果蠅急性實(shí)驗(yàn)

2.3.3.1雙氧水急性實(shí)驗(yàn)

果蠅飼養(yǎng)條件及分組同上。將25 d齡的果蠅饑餓處理2 h，后轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，瓶口放置含1mL 30％雙氧水的6％葡萄糖溶液的飽和濾紙。每隔2小時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅存活量至全部死亡。

2.3.3.2百草枯急性實(shí)驗(yàn)

前期處理同上，瓶口放置含1mL 20mmol/L百草枯的6％葡萄糖溶液的飽和濾紙。每隔3小時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅存活量至全部死亡。

2.3.4果蠅內(nèi)源性抗氧化酶活力、丙二醛及蛋白質(zhì)羰基測(cè)定

果蠅飼養(yǎng)條件及分組同上。將45 d齡的果蠅饑餓處理2h，CO2麻醉后收集稱(chēng)重，冷凍保存于-80℃?zhèn)溆?。冰上制?％果蠅勻漿（生理鹽水），2 500 r/min、4℃離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定超氧化物歧化酶活力（黃嘌呤氧化酶法）、過(guò)氧化氫酶活力（紫外分光光度法）、丙二醛含量（硫代巴比妥酸法）以及蛋白質(zhì)羰基含量（二硝基苯肼比色法）。

2.3.5Real Time-PCR法分析抗氧化基因mRNA表達(dá)

果蠅飼養(yǎng)條件及分組同上。收集45 d齡的果蠅，Trizol法提取果蠅總RNA，以RP49為內(nèi)參基因，Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和MTH為目的基因，Real Time-PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，95℃預(yù)變性10min，95℃變性5 s，58.5℃褪火30 s，55℃延伸10 s，30個(gè)循環(huán)。（特異性引物設(shè)計(jì)參考實(shí)驗(yàn)室前期文獻(xiàn)［11］）。

2.4數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS statistics17.0軟件進(jìn)行分析，通過(guò)t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異性顯著，P＜0.01為差異性極顯著。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）。

3　結(jié)果與分析

3.1黑豆皮提取物對(duì)果蠅壽命的影響

相對(duì)于對(duì)照組，給藥組果蠅平均體重?zé)o明顯變化（P＞0.05）。飼喂不同濃度黑豆皮提取物的果蠅平均壽命和最高壽命相對(duì)于對(duì)照組均有延長(zhǎng)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系，其中4.5mg/mL組果蠅的平均壽命及最高壽命為55.5 d和80.1 d，分別延長(zhǎng)16.6％（P＜0.01）與21.7％（P＜0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1　果蠅壽命曲線Fig.1 Lifespan Curveof Drosophilamelanogaster

表1　黑豆皮提取物對(duì)果蠅壽命的影響Table1 Effectof BSCE on Lifespan of Drosophilamelanogaster

3.2果蠅急性實(shí)驗(yàn)

3.2.1雙氧水急性實(shí)驗(yàn)

雙氧水實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的BSCE延長(zhǎng)果蠅壽命的作用明顯且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。其中飼喂4.5mg/mL黑豆皮的果蠅平均存活時(shí)間及最高存活時(shí)間為19.5 d和27.7 d，分別延長(zhǎng)37.2％與22.9％（P＜0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。

3.2.2百草枯急性實(shí)驗(yàn)

圖2　雙氧水急性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Hydrogen Peroxide（H2O2）Challenge Test

表2　雙氧水急性實(shí)驗(yàn)Table2 Hydrogen Peroxide（H2O2）Challenge Test

百草枯實(shí)驗(yàn)觀察到與雙氧水實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果。其中4.5mg/mL組果蠅的平均存活時(shí)間及最高存活時(shí)間分別為31.3 d和56.9 d，延長(zhǎng)35.7％與42.9％（P＜0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。

3.3黑豆皮提取物對(duì)果蠅內(nèi)源性抗氧化酶活力、MDA和蛋白質(zhì)羰基含量的影響

相對(duì)于對(duì)照組，給藥組果蠅內(nèi)源性抗氧化酶Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT等活力均有增加，MDA和蛋白質(zhì)羰基含量相對(duì)下降，且與黑豆皮提取物呈劑量依賴(lài)關(guān)系。其中4.5mg/mL組果蠅Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和CAT酶活力顯著增加（P＜0.05），MDA和蛋白質(zhì)羰基含量極顯著下降（P＜0.01）。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

圖3　百草枯急性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Paraquat Challenge Test

表3　百草枯急性實(shí)驗(yàn)Table3 Paraquat Challenge Test

表4　黑豆皮提取物對(duì)果蠅體內(nèi)Cu-Zn-SOD、CAT酶活性、MDA含量和蛋白質(zhì)羰基含量的影響Table4 Effectof BSCE on Cu-Zn-SOD，CAT enzym eactivity，MDA contentand Protein Carbonylvalue in Drosophila melanogaster

3.4Real Time-PCR檢測(cè)抗氧化基因Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2及MTHmRNA表達(dá)水平

相比于對(duì)照組，給藥組果蠅體內(nèi)Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2表達(dá)水平均有上調(diào)而MTHmRNA表達(dá)水平下調(diào)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。其中4.5mg/mL組果蠅體內(nèi)Mn-SOD、CATmRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05），Cu-Zn-SOD、Nrf2mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01）。具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　黑豆皮提取物對(duì)果蠅體內(nèi)Cu-Zn-SOD、M n-SOD、CAT、Nrf2、MTH mRNA表達(dá)的影響Table5 Effectof BSCE on Cu-Zn-SOD，M n-SOD，CAT，MTH mRNA Expression in Drosophilamelanogaster

4　結(jié)果與討論

Harman提出的自由基理論認(rèn)為，組織細(xì)胞氧化性損傷的累積會(huì)引起衰老，隨年齡增長(zhǎng)，線粒體自由基生成增加，造成機(jī)體衰老［12］。減緩自由基的生成可以緩解隨齡抗氧化能力的降低以及減輕隨齡增加的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而增加老齡動(dòng)物的壽命。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明果蠅給予4.5mg/mL黑豆皮提取物后，平均壽命和最高壽命分別延長(zhǎng)了16.6％和21.7％（P＜0.05）。

張楠證實(shí)黑豆提取物能夠延長(zhǎng)小鼠游泳至力竭的時(shí)間，減少體內(nèi)MDA生成，增加SOD酶活力水平，進(jìn)而提高小鼠抗氧化能力［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂黑豆皮提取物的果蠅內(nèi)源性抗氧化酶Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和CAT活力顯著上升，MDA含量和蛋白質(zhì)羰基含量顯著下降。張瑞芬發(fā)現(xiàn)攝入黑豆皮提取物后，老齡小鼠血清超氧化物歧化酶活性和皮膚羥脯氨酸含量明顯增加，而血清MDA生成量和腦組織B型單胺氧化酶活性則顯著降低［14］；張繼曼等研究發(fā)現(xiàn)黑豆皮花色苷可以降低糖尿病小鼠的血糖和血清中MDA含量，同時(shí)提高機(jī)體SOD、GSH-PX活性，具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用［15］，這與本研究呈現(xiàn)結(jié)果相一致。

攝入黑豆皮提取物可以顯著上調(diào)抗氧化基因Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2mRNA的表達(dá)水平，下調(diào)MTHmRNA表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，Cu-Zn-SOD基因過(guò)表達(dá)可以顯著延長(zhǎng)果蠅平均壽命和最高壽命；Mn-SODmRNA過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因果蠅平均壽命和最高壽命分別延長(zhǎng)30％～33％和37％；CAT基因過(guò)表達(dá)對(duì)延長(zhǎng)壽命沒(méi)有顯著影響，但CAT和Cu-Zn-SOD雙基因同時(shí)過(guò)表達(dá)，則可使果蠅的平均壽命延長(zhǎng)34％［16］。

攝食百草枯進(jìn)入體內(nèi)能產(chǎn)生超氧化物陰離子自由基，進(jìn)而損傷果蠅細(xì)胞［17］。攝食雙氧水能生成羥自由基誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生急性氧化應(yīng)激損傷［18］。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂黑豆皮提取物的果蠅壽命顯著延長(zhǎng)，證明其自由基清除能力顯著提高。董李平等研究發(fā)現(xiàn)黑豆皮提取物對(duì)超氧化物陰離子自由基和羥自由基有較明顯的清除效果，清除率與濃度呈劑量依賴(lài)性［19］。

因此，飲食中添加黑豆皮提取物可以延長(zhǎng)果蠅壽命，降低百草枯和雙氧水引發(fā)的死亡率。其抗衰老機(jī)制很可能是通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性抗氧化基因的表達(dá)水平，進(jìn)而增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶活力，清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。

［1］王寅，張坤，趙晉.黑豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及在食品中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用［J］.中國(guó)食品添加劑，2007（6）：132-135

［2］許姜澤.黑豆的醫(yī)藥用途［J］.糧油食品科技，1984（1）：56

［3］李文斌.黑豆?fàn)I養(yǎng)保健功能的研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)［J］.食品工程，2010（4）：19-20

［4］Z Ilic S，Ukalovic V H T，Maksimovic V，et al.Antioxidant properties of soybean with black and yellow kernel coat［C］.Croatia：Croatian and InternationalSymposium on Agriculture，2011：14-18

［5］Xu B，Chang S K C.Antioxidant capacity of seed coat，dehulled bean，and whole black soybeans in relation to their distributions of total phenolics，phenolic acids，anthocyanins and isoflavones［J］. JournalofAgricultural＆amp;Food Chemistry，2008，56（18）：8365-8373

［6］趙艷威，孫靜，李玲，等.黑豆皮花青素對(duì)2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)通路DAG-PKC的影響［J］.中藥藥理與臨床，2012（6）：27-29

［7］楊民樂(lè)，侯俊仙，陳樹(shù)俊，等.黑豆皮花青素提取物的抗氧化活性研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2013（24）：11-13

［8］Takahashi R，Ohmori R，Kiyose C，et al.Antioxidant Activities Of Black And Yellow Soybeans Against Low Density Lipoprotein Oxidation［J］.Journal of Agricultural＆amp;Food Chemistry，2005，53（11）：4578-4582

［9］Helfand SL，BR.GENETICSOFAGING IN THEFRUITFLY，D ROSOPHILA MELANOGASTER［J］.Annual Review of Genetics，2003，37（37）：329-348

［10］Saunders R D.Identification and characterization of a Drosophila ortholog ofWRN exonuclease that is required tomaintain genome integrity［J］.Aging Cell，2008，7（3）：418-425

［11］Zhang Z，Han S，Wang H，et al.Lutein extends the lifespan of Drosophilamelanogaster［J］.Archivesof Gerontology and Geriatrics，2014，58（1）：153-159

［12］Harman D.Aging：a theory based on free radical and radiation chemistry［J］.JournalofGerontology，1956，11（3）：298-300

［13］張楠.黑、黃豆提取物對(duì)訓(xùn)練小鼠運(yùn)動(dòng)及抗氧化能力影響的比較研究［D］.石家莊：河北師范大學(xué)，2011，22-24

［14］張瑞芬，黃昉，徐志宏，等.黑豆皮提取物抗氧化和延緩衰老作用研究［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007（2）：160-162

［15］張繼曼，文漢.黑豆皮花色苷的降血糖作用及其機(jī)理的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011（3）：374-377

［16］陳瑗，周玫，劉尚喜，等.營(yíng)養(yǎng)、衰老與自由基理論［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005（3）：177-180

［17］Xia L I，Yin J，Cheng C M，et al.Paraquat induces selective dopaminergic nigrostriatal degeneration in aging C57BL/6mice.［J］. ChineseMedical Journal，2005，118（16）：1357-1361

［18］趙江，陳純，劉素穩(wěn)，等.紫薯提取物對(duì)雌性果蠅壽命的影響及其作用機(jī)制［J］.中國(guó)食品添加劑，2014（7）：147-152

［19］董李平，吳珍齡.黑豆皮醇提物清除自由基效果的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002（5）：445-446

Black Soybean Coat Extract Extends the Lifespan of Drosophilamelanogaster by Enhancing Endogenous Antioxidant Enzymes

SUNZhen-ou1，WANG Xiao-bin1，WANG Hong1，2，MUWan-ju1，ZHANG Ze-sheng1，WANG Hao1，3，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science＆amp;Technology，Tianjin 300457，China；2.School of Biological Engineering，Tianjin University of Science＆amp;Technology，Tianjin 300457，China；3.The National Potato Processing Industry Technology Innovation Strategic Alliance，Qinhuangdao 066000，Hebei，China）

Black Soybean Coat Extract（BSCE）havebeen used asa natural food antioxidantwith high anthocyanins concentrations.The presentstudy investigate the effectof Black Soybean Coat Extract（BSCE）on the lifespan of Male Drosophila melanogaster and itsmechanism.Male Drosophila melanogaster were reared in medium containing 0，0.5，1.5，4.5mg/mLBSCE till they all died，then themean lifespan and themaximum lifespanwere determined.The activitiesofsuperoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT），themalondialdehyde（MDA）contentand the protein carbonyl value contentwere analyzed.The expression ofantioxidantenzymes（SOD，CAT，Nrf2，MTH）mRNA were detected with Real Time-PCRmethod.Adding BSCE could prolong the lifespan of Drosophilamelanogaster（1.5，4.5mg/mL，P＜0.05）.Antioxidantenzyme activity assay resultsshowed thatadding 4.5mg/mLBSCE could significantly increase Cu-Zn-SOD，Mn-SOD ang CATenzyme activity（P＜0.05）and decrease the contentof protein carbonyl value and MDA level（P＜0.01）.According to the resultsofReal Time-PCR，BSCE of4.5mg/mL could remarkably increase Cu-Zn-SOD，Nrf2mRNA expression（P＜0.01）and CAT，Mn-SODmRNA expression（P＜0.05）.Itwasconcluded thatBSCE at leastpartially has lifespan-prolonging activity onmale Drosophilamelanogaster associated with its interactionswith MTH and endogenousantioxidantenzymes SOD and CAT.

Drosophilamelanogaster；Black SoybeanCoatExtract；enzymeactivity；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.003

國(guó)家薯類(lèi)深加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目（2014GS001A）

孫振歐（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

王浩（1979—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

2015-07-16