張 思王 蕾 張志旭 楊繼國 任 杰 劉東波

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128; 2. 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410128；3. 遼寧晟啟昊天生物醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 沈陽 110000; 4. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640;5. 華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808)

?

16種市售酵素食品功能分析與評價

張 思1,2王 蕾2,3張志旭2楊繼國4,5任 杰5劉東波1,2

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128; 2. 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410128；3. 遼寧晟啟昊天生物醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 沈陽 110000; 4. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640;5. 華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808)

采用紫外分光光度法、滴定法、HPLC法等分別分析了16種市售酵素食品清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的能力，脂肪酶、淀粉酶活力以及有機(jī)酸的種類和含量，并建立其相應(yīng)的評價體系。結(jié)果顯示，16種酵素食品均具有較強(qiáng)的自由基清除能力，總抗氧化性能是20 μg/mL Vc的1～2倍，具有一定的脂肪酶與淀粉酶活性，含有3～7種有機(jī)酸。研究結(jié)果表明，酵素食品具有一定的抗氧化能力及助消化、調(diào)節(jié)腸道菌群的功能。

酵素；抗氧化；功效酶；有機(jī)酸；評價體系

酵素食品是一種以新鮮水果、蔬菜、食用真菌、中草藥等為原料，經(jīng)過酵母菌、乳酸菌及醋酸菌等多種有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生的功能性發(fā)酵產(chǎn)品[1]。酵素富含多種對人體有益的活性物質(zhì)，如酚類、黃酮類、有機(jī)酸類、多糖類以及酶類(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、SOD等)[2]，具有抗氧化、潤腸通便、抗菌消炎、解酒護(hù)肝等作用[3-6]。酵素食品所使用的發(fā)酵技術(shù)，使果蔬原料通過復(fù)雜的中間代謝或交叉代謝，實現(xiàn)代謝物質(zhì)之間的生物轉(zhuǎn)化，不僅可以改善發(fā)酵基質(zhì)原有的一些不良風(fēng)味，還可以產(chǎn)生一些新的生物活性成分，增加酵素食品的風(fēng)味、口感及功效[7-8]。

當(dāng)下，酵素食品發(fā)展迅速，在不少廠家將其產(chǎn)業(yè)化、規(guī)范化的同時，一些自制酵素也開始流行。商品化的酵素從發(fā)酵基質(zhì)、菌種選擇到發(fā)酵工藝、后續(xù)處理都嚴(yán)格把控。與之相比，自制酵素制作過程的不可控因素可能使其對人體造成一定傷害：① 發(fā)酵過程中，由于器具消毒不徹底，發(fā)酵過程密封不嚴(yán)等，可能引入雜菌，造成污染；② 代謝過程受外界環(huán)境的影響，代謝產(chǎn)物不可控；③ 水果的成分復(fù)雜，在發(fā)酵過程中可能會產(chǎn)生雜醇油，它是水果在酒精發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物，如果未分離除去，對人體會有一定的危害[9]。

規(guī)范化生產(chǎn)的酵素食品在食品安全、功效、營養(yǎng)和口感方面都具有明顯的優(yōu)勢，盛行于日本、臺灣、美國和一些歐洲國家及東南亞地區(qū)。2014年，全球酵素市場規(guī)模已超過50億美元，年增長率達(dá)7%以上[10]。中國酵素食品的生產(chǎn)尚處于初級階段，酵素食品的市場也才起步。由于缺乏具有針對性的監(jiān)管和控制，中國市場上出現(xiàn)的酵素食品質(zhì)量參差不齊，并且缺乏相應(yīng)的評價標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。

現(xiàn)代社會人們飲食不規(guī)律、運動時間少，由氧化脅迫、腸道菌群紊亂所導(dǎo)致的消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、心血管疾病等發(fā)病頻繁[13-14]。因此，在良好的市場前景的背景下，研究具有抗氧化性、能夠調(diào)理腸胃功能的酵素食品有著重大的意義。

目前中國對酵素食品的研究主要有功效酶活力[1]、功能驗證[4-6]、體外抗氧化[15]等，結(jié)果顯示其相關(guān)功效酶均有一定活力，也具有較好的抗氧化能力。而對酵素食品抗氧化、功效酶、有機(jī)酸進(jìn)行測定并作出相應(yīng)功能評價目前還沒有。

本研究擬以市售酵素食品為研究對象，對其清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的能力，脂肪酶、淀粉酶這兩種主要功效酶活力以及有機(jī)酸等有益活性物質(zhì)進(jìn)行分析評價，建立抗氧化性能、助消化、改善腸道菌群的評價體系，為酵素食品的理論研究及產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

酵素食品：市售的不同產(chǎn)地，不同品牌的酵素，16種。本研究涉及的16種酵素食品，均為正規(guī)的工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品，經(jīng)過規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的相關(guān)工序，得到生產(chǎn)許可。

1.1.2 主要試劑

DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)：美國Sigma 公司；

抗壞血酸：純度≥99.7%，國藥化學(xué)試劑有限公司；

乳酸、醋酸：色譜純，國藥化學(xué)試劑有限公司；

蘋果酸、琥珀酸、甲酸、檸檬酸、正戊酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、丙酮酸、Tris試劑、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、聚乙烯醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、福林試劑等：分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，日本島津公司；

高速離心機(jī)：2-16R型，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵素清除DPPH自由基能力的測定 在文獻(xiàn)[16]的基礎(chǔ)上進(jìn)行部分修改，準(zhǔn)確稱取20 mg DPPH，用無水乙醇定容于500 mL容量瓶中，得到濃度為 0.04 mg/L 的DPPH溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。分別取酵素樣品1 mL，加1 mL 蒸餾水及2 mL 的DPPH溶液，混勻后黑暗反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光度，用20 μg/mL 的Vc溶液代替酵素作為陽性對照，按式(1)計算清除率：

(1)

式中：

R1——DPPH自由基清除率，%；

A1——DPPH溶液與酵素的吸光度；

A2——酵素與無水乙醇的吸光度；

A3——DPPH溶液與無水乙醇的吸光度。

1.2.2 酵素清除超氧陰離子能力的測定 在文獻(xiàn)[15]基礎(chǔ)上稍有改進(jìn)。取 pH 8.2的Tris—HCL緩沖液4.5 mL，分別加入4.2 mL 蒸餾水和 25 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，混勻后25 ℃ 反應(yīng)5 min，立即加入1 mL 8 mol/L 的HCl，終止反應(yīng)，在299 nm測定吸光度，空白管以 Tris—HCL 緩沖液作參比，測得A1。另取緩沖液，在加入鄰苯三酚前加入酵素樣品溶液1 mL，蒸餾水減少相應(yīng)體積，空白管用同樣的酵素樣品作參比，不加鄰苯三酚，測得A2。用20 μg/mL 的Vc溶液代替酵素作為陽性對照，按式(2)計算清除率：

(2)

式中：

R2——超氧陰離子清除率，%；

A1——空白試劑的吸光度；

A2——酵素與試劑的吸光度。

1.2.3 酵素清除羥自由基能力的測定 參照文獻(xiàn)[17]稍作改進(jìn)。在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、酵素樣品1 mL、蒸餾水1 mL、6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm處測定吸光度A1；用蒸餾水代替水楊酸溶液時測得本底吸光度A2；用蒸餾水代替酵素樣品時測得空白對照吸光度A3。用20 μg/mL 的Vc溶液代替酵素作為陽性對照，按式(3)計算清除率：

(3)

式中：

R3——羥自由基清除率，%；

A1——酵素與試劑的吸光度；

A2——本底吸光度；

A3——空白對照的吸光度。

1.2.4 酵素脂肪酶活力測定 按GB/T 23535—2009的滴定法執(zhí)行。

1.2.5 酵素淀粉酶活力測定 在文獻(xiàn)[18]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密量取1 mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0 mL，置試管中，加水至2 mL。再加入2 mL DNS試劑，搖勻，置沸水浴中加熱5 min，取出，流水冷卻，用水轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻，以未加麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相應(yīng)溶液為空白，在540 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) 樣品測定：取試管兩批，分別作為供試管和空白管，各精密加入1%淀粉溶液1 mL，置37 ℃水浴保溫5 min。供試管中精密加入酵素樣品1 mL，37 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，立即加入2 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴10 min；空白管中加入2 mL DNS試劑，37 ℃水浴反應(yīng)5 min，精密加入酵素樣品1 mL，搖勻，沸水浴10 min。在540 nm處測定吸光度。

在上述條件下，每分鐘水解淀粉生成1 μmol麥芽糖的量，為一個淀粉酶活力單位(1 U = 1 μmol/min)。淀粉酶活力按式(4)計算：

(4)

式中：

U——淀粉酶活力單位，U/mL；

m——酵素樣品水解淀粉產(chǎn)生的麥芽糖的質(zhì)量，μg；

M——麥芽糖分子質(zhì)量，342.3；

V1——酵素樣品稀釋體積，mL；

V2——酵素樣品加入量，mL；

W——酵素樣品取樣量，g；

t——反應(yīng)時間，min。

1.2.6 酵素有機(jī)酸的定性及定量試驗 參考文獻(xiàn)[19]，稍作修改。

(1) 色譜分離條件：使用Aminex HPX-87H型色譜柱(300 mm×7.8 mm:Bio-Rad. Hercules)，以0.005 mol/L的H2SO4溶液為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫50 ℃，紫外檢測器波長210 nm。

(2) 樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確量取一定體積的酵素樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min后取上清液1 mL，適當(dāng)稀釋后經(jīng)0.22 μm膜過濾，進(jìn)樣10 μL。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)品制備：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為不同濃度，使用0.22 μm膜過濾進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵素對自由基清除能力的測定

1 mL不同的酵素樣品對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除能力不同(表1)。所檢測的市售酵素樣品對DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除能力。其中4號樣品最高(96.64%)，與20 μg Vc清除能力相當(dāng)(20 μg Vc的1.04倍)；所檢測的酵素樣品對超氧陰離子清除能力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Vc，12號樣品最低，仍有20 μg Vc的6倍之高，15號樣品是20 μg Vc的14倍；對羥自由基的清除能力，所檢測的樣品均高于20 μg Vc，清除率基本上是Vc的2.7～3.2倍。

酵素對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基都具有較好的清除能力，這可能與酵素中所含的有效成分相關(guān)。16種酵素均是以多種蔬菜、水果、食藥用菌以及傳統(tǒng)中藥為原料，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵而成的，含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，其中的酚類、黃酮類物質(zhì)能夠提供氫離子或者自由的羥基，與自由基結(jié)合，使其穩(wěn)定或被還原，從而起到清除或抑制自由基的作用。

2.2 酵素酶活力的測定

酵素樣品脂肪酶、淀粉酶活力測定結(jié)果見表2。所檢測樣品脂肪酶酶活均較低，最高的10號樣品仍只有2 U/mL，與于曉艷等[1]所測定的微生物酵素脂肪酶活力結(jié)果較為一致。麥芽糖線性回歸方程為：y=0.454 4x-0.036 9，R2=0.999 2，不同樣品淀粉酶活力差異較大，15號樣品酶活最高，為43.04 U/mL，而13、14號樣品卻顯示無淀粉酶活，可能與樣品配方的種類、含量及菌種有關(guān)。

脂肪酶、淀粉酶都屬于消化酶，能夠?qū)⒅竞偷矸鄯纸獬扇梭w能夠吸收的小分子，不僅可以維護(hù)胃腸道功能，緩解各種原因引起的消化不良癥狀，同時還可間接向機(jī)體提供各種營養(yǎng)。結(jié)果表明大部分所檢測的酵素食品有一定的脂肪酶活性、淀粉酶活性，但脂肪酶活性較低，推測其起到助消化作用的可能主要是淀粉酶。

表1 不同酵素對自由基的清除率

2.3 酵素有機(jī)酸的定性及定量試驗

乳酸、乙酸的線性回歸方程分別為：y=1 112.3x-54.278，R2=0.999 9；y=577.09x+3 425.9，R2=0.999 7。

表2 不同酵素的酶活力

有機(jī)酸是水果和蔬菜中的天然產(chǎn)物，強(qiáng)烈影響著果蔬的感官品質(zhì)、顏色、味道和香味以及水果飲料的穩(wěn)定性[20]。本研究測定酵素樣品的有機(jī)酸種類，主要包括乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸和異丁酸，部分還有丙酮酸、正戊酸、琥珀酸、丙酸和異戊酸(表3、4)。不同的有機(jī)酸對酵素風(fēng)味、口感的貢獻(xiàn)不同，乳酸的酸味較強(qiáng)，但較溫和、稍有澀味；乙酸具有刺激性酸味；檸檬酸溫和爽快、有新鮮感、后苦時間短；蘋果酸酸度大、稍苦澀、滯留時間長；異丁酸具有奶酪味與陳酒花味[21]。所檢測的大多數(shù)酵素產(chǎn)品均含有4種以上有機(jī)酸，使其具有較寬泛的風(fēng)味閾值、綜合口感以及較強(qiáng)的風(fēng)味穩(wěn)定性。

在改善有機(jī)酸口味的同時，有機(jī)酸還可通過降低腸道 pH，提高消化酶活性，增殖有益菌、抑制有害菌，從而調(diào)控腸道微生物平衡[22]。由結(jié)果可知酵素食品能夠起到一定的調(diào)節(jié)腸道微生物，改善腸道健康的作用。

2.4 酵素評價體系的建立

2.4.1 酵素抗氧化性能評價體系的建立 以清除自由基測定抗氧化能力的方法，是目前最常用的方法。對于不同的自由基，酵素食品的清除機(jī)制也不相同。所以，為了綜合評價酵素食品抗氧化性能，可以采用式(5)的計算方法，建立評價酵素食品抗氧化性能的體系，定義為總自由基清除能力大于50%時的產(chǎn)品具有較好的抗氧化性能。

(5)

式中：

W——總抗氧化性能，%；

W1——清除DPPH自由基性能，%；

W2——清除超氧陰離子性能，%；

W3——清除羥自由基性能，%。

根據(jù)式(5)計算出結(jié)果見圖1。由圖1可知，其抗氧化性能約為20 μg/mL Vc的1～2倍，總自由基清除能力也都大于50%。由此體系可以初步對酵素食品抗氧化性能進(jìn)行綜合評價。

表3 酵素樣品有機(jī)酸定性?

? “√”表示存在此種物質(zhì)。

表4 酵素樣品有機(jī)酸定量

圖1 不同酵素總抗氧化性能

2.4.2 酵素助消化性能評價體系的建立 消化酶依消化對象的不同而大致可分為蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等幾種。酵素食品的主要功效酶有淀粉酶和脂肪酶，根據(jù)中國人的膳食結(jié)構(gòu)，碳水化合物占總能量的70%左右，脂肪占總能量的20%左右?？梢杂纱私⒔退刂阅艿脑u價體系，見式(6)：

X=U1×0.2+U2×0.7，

(6)

式中：

X——助消化性能，U/mL；

U1——脂肪酶活力，U/mL；

U2——淀粉酶活力，U/mL。

由圖2可知，15號樣品具有最強(qiáng)的助消化能力，13、14號樣品作用基本為零。此體系可以對酵素食品助消化性能進(jìn)行初步評價。

圖2 不同酵素助消化性能

2.4.3 酵素調(diào)節(jié)腸道菌群性能評價體系的建立 有機(jī)酸的抑菌機(jī)制多種多樣且有差異，可能是單一機(jī)制，也可能是多機(jī)制協(xié)同作用[23]。種類越多，越有利于腸道菌群的多樣性。其中，乳酸具有抑菌、延長保質(zhì)期、調(diào)節(jié)pH值、保持食品色澤、調(diào)味、提高產(chǎn)品質(zhì)量等作用，乙酸是一種酸度調(diào)節(jié)劑，為避免細(xì)胞質(zhì)的pH值發(fā)生破壞性改變，通常在細(xì)胞中的乙酸的濃度被嚴(yán)格控制在一個很低的范圍內(nèi)[24]。因此，可以建立酵素食品有機(jī)酸的評價體系：乳酸含量高，乙酸含量低，種類多者有較強(qiáng)的改善腸道菌群性能。

由圖3、4可知，1、4、6、12、14號樣品乳酸含量很高，乙酸含量很低，有機(jī)酸種類也有多種，而11號樣品乙酸含量遠(yuǎn)高于乳酸，其調(diào)節(jié)腸道菌群的性能也就弱于前面幾號樣品。

圖3 不同酵素乳酸、乙酸濃度

圖4 不同酵素有機(jī)酸數(shù)量

3 結(jié)論與討論

(1) 本研究分析了16種市售酵素食品清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的能力，淀粉酶、脂肪酶的活力，以及有機(jī)酸的種類和含量。結(jié)果表明，與20 μg/mL的Vc相比，酵素具有更強(qiáng)的自由基清除能力，但仍需要進(jìn)一步研究其抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，提高其抗氧化能力；酵素食品有一定的脂肪酶、淀粉酶活性，淀粉酶活性較高；有3～7種不等的有機(jī)酸，且乳酸含量高于乙酸。從檢測結(jié)果可知，這16種產(chǎn)品的質(zhì)量良莠不齊，可能與其果蔬配方及生產(chǎn)工藝有關(guān)。

(2) 根據(jù)研究結(jié)果，初步建立了酵素食品抗氧化性能、助消化性能以及調(diào)節(jié)腸道菌群性能的評價體系：將酵素食品對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的清除率進(jìn)行綜合，計算總的抗氧化性能；按照中國人的膳食結(jié)構(gòu)權(quán)重酵素食品中脂肪酶和淀粉酶的活力，建立其助消化性能的評價體系；根據(jù)有機(jī)酸的性質(zhì)與作用機(jī)制建立了酵素食品調(diào)節(jié)腸道菌群性能的評價體系。此評價體系的建立對于酵素食品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

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Functional analysis and evaluation on commercially available enzyme food

ZHANG Si1,2WANGLei2,3ZHANGZhi-xu2YANGJi-guo4,5RENJie5LIUDong-bo1,2

(1.CollegeofHorticultureandLandscape,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;2.StateKeyLaboratoryofSubhealthInterventionTechnology,Changsha,Hunan410128,China;3.LiaoningShengQiHeavenBiomedicalScienceTechnologyCo.,Ltd.,Shenyang,Liaoning110000,China;4.CollegeofFoodScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510640,China; 5.SouthChinaInstituteofCollaborativeInnovation,Dongguan,Guangdong523808,China)

UV spectrophotometric, titration and HPLC method were used to test the scavenging ability of DPPH, superoxide anion and hydroxyl radical, the activities of lipase, amylase and the number of organic acid of 16 kinds of enzymes in market. Further, the corresponding evaluation system was established. The results showed that the enzymes have strong free radical scavenging ability, nearly 1～2 times of 20 μg/mL Vc, a certain lipase and amylase activity and 3～7 kinds of organic acids. Therefore, enzyme foods have good antioxidant capacity, digestive function and intestinal flora regulation.

enzyme; antioxidant capacity; efficacy enzyme; organic acid; evaluation system

張思，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

劉東波(1970-)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。

E-mail：chinasaga@163.com.

2016—06—20