吳文開(kāi)

（江蘇省阜寧縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇阜寧 224400）

阜寧縣2011～2015年生豬口蹄疫血清抗體監(jiān)測(cè)報(bào)告

吳文開(kāi)

（江蘇省阜寧縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇阜寧 224400）

目的:調(diào)查2011年～2015年間阜寧縣19個(gè)鎮(zhèn)（區(qū)）口蹄疫疫苗免疫保護(hù)率情況，為阜寧地區(qū)生豬口蹄疫強(qiáng)制免疫性疾病的免疫方案的制定和完善提供參考。結(jié)論:阜寧縣生豬口蹄疫抗體陽(yáng)性率在2011年～2015年間總體效果較好，能達(dá)到國(guó)家規(guī)定的免疫效果，但還沒(méi)有達(dá)到100% 的免疫效率，建議堅(jiān)持豬口蹄疫疫苗的免疫方案。

阜寧縣豬口蹄疫抗體

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是生豬養(yǎng)殖中重要的傳染病[1］。危害嚴(yán)重，死亡率最高的可達(dá)25%～50%[2］。這些疫病的存在直接影響了養(yǎng)豬的效益，進(jìn)而影響到公共衛(wèi)生的安全。我國(guó)在20世紀(jì)80年代開(kāi)始就對(duì)豬瘟實(shí)行以強(qiáng)制免疫，2002年以后，采取了全面強(qiáng)制免疫與撲殺相結(jié)合的綜合防控策略來(lái)防控豬口蹄疫。如何制定合理的免疫程序，關(guān)系著豬場(chǎng)生產(chǎn)穩(wěn)定與健康發(fā)展[3］。通過(guò)血清抗體跟蹤檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)數(shù)據(jù)觀察，制定合理的免疫程序及調(diào)整后的效果，對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)的疾病防控和生產(chǎn)成績(jī)的提高極為有利的。

為了掌握江蘇省阜寧縣規(guī)模豬場(chǎng)和散養(yǎng)農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的生豬豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬口蹄疫免疫抗體水平，有重點(diǎn)地開(kāi)展相應(yīng)的免疫預(yù)防，制定科學(xué)合理的免疫程序，分別于2011～2015年每年的5月分5批次采集阜寧縣2規(guī)模豬場(chǎng)和散戶(hù)的生豬（50～75kg體重）血樣進(jìn)行生豬口蹄疫血清抗體檢測(cè)，以指導(dǎo)阜寧縣生豬口蹄疫強(qiáng)制免疫方案的制定和實(shí)施，最終提高阜寧縣生豬的健康生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1主要試劑

豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司。

1.2主要儀器

DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀，PYX-DHS數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱型號(hào)，微量反應(yīng)板及封條，TGL-168離心機(jī)型號(hào)，10～1000μl移液槍及300μl排槍。

1.3樣本來(lái)源

分別于2011年～2015年每年5月分5批次采集阜寧縣19個(gè)鎮(zhèn)區(qū)（街道）規(guī)模豬場(chǎng)和散戶(hù)的生豬（50～75kg體重）血樣進(jìn)行生豬口蹄疫血清抗體檢測(cè)，累計(jì)采集樣品數(shù)量為6409份，其每個(gè)鎮(zhèn)區(qū)（街道）的采集數(shù)量詳見(jiàn)表1。

表1　2011年～2015年5批次血清樣品采集記錄表

1.4全血采集后處理

每次抽血后，斜45°室溫放置30min后立即放入有冰塊的疫苗運(yùn)輸箱內(nèi)帶回阜寧縣畜牧獸醫(yī)站實(shí)驗(yàn)室，將血清倒入2mlEP管中，5000r/min離心10min，吸取上清移入另一干凈的2ml EP管中，做好標(biāo)記，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5血清抗體檢測(cè)

每批次樣品全部采集完后，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行豬口蹄疫的血清抗體ELISA檢測(cè)。

1.6FMD抗體ELISA法檢測(cè)

使用上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司的豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒檢測(cè)。使用前所有試劑應(yīng)恢復(fù)至室溫（18℃～25℃）。濃縮洗滌液用蒸餾水10倍稀釋成洗液工作液。ELISA操作步驟如下：

（1）取出試劑盒中的樣品是稀釋板。選擇兩個(gè)陰性對(duì)照和兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔。

（2）在稀釋板的各孔中加入200μl樣品稀釋液，在相應(yīng)的孔中分別加入10μl對(duì)照血清或被檢測(cè)血清，加樣器重復(fù)吹洗3次。

（3）取出抗原包被板，分別從稀釋板上取稀釋后的對(duì)照血清和被檢血清各100μl，加入至抗原包被板的相應(yīng)孔中，加蓋封膜，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育60min。

（4）吸取各孔的液體棄去。300 μl洗滌工作液洗滌板孔3次。每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體，在最后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣掉。

（5）酶結(jié)合物工作液配制：用酶結(jié)合物稀釋液將酶結(jié)合物作100倍稀釋?zhuān)F(xiàn)配現(xiàn)用。每孔加入100μl酶結(jié)合物工作液，封膜后37℃孵育30min。

（6） 重復(fù)步驟（4）。

（7）TMB底物A液和TMB底物B液等量混合后每孔加入100μl TMB底物工作液，封膜后37℃孵育15min。

（8） 10min后每孔立即加入100μl終止液終止反應(yīng)。

（9）測(cè)量樣品與對(duì)照孔在450nm 處的吸光值。

結(jié)果有效性判定：陰性對(duì)照平均OD值應(yīng)小于等于0.2，每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的平均值應(yīng)大于0.5且小于等于2.0，則為有效，否則試驗(yàn)無(wú)效。臨界值=0.23*陰性對(duì)照空平均OD值。

結(jié)果判定：

被檢測(cè)樣品孔OD值小于臨界值時(shí)，為陰性，即為抗口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)大白白抗體陰性。

被檢樣品OD值大于等于0.8時(shí)，判為陽(yáng)性。

2　豬口蹄疫抗體檢測(cè)結(jié)果

豬口蹄疫血清抗體流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表2至表3。阜寧縣豬口蹄疫血清抗體陽(yáng)性率從2011年到2015年間分別為83.9%，86.9%，90.0%，93.8%和94.8%，抗體陽(yáng)性率較高，且呈逐年升高趨勢(shì)。說(shuō)明阜寧縣口蹄疫免疫效果良好。

表2　2011年～2015年口蹄疫抗體檢測(cè)結(jié)果

表3　2011年～2015年口蹄疫抗體檢測(cè)結(jié)果

3　討論

《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》指出[4］，隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷增加，畜禽感染病原機(jī)會(huì)增多，病原變異概率加大，新發(fā)疫病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的動(dòng)物疫病。屬牛、羊、豬和駱駝等偶蹄獸急性、熱性、高度接觸性傳染病。現(xiàn)在的FMD已經(jīng)可以在不同的地區(qū)，一年四季皆可發(fā)生[5］?？谔阋卟《驹谶M(jìn)化過(guò)程中變異很大，各亞型之間不一定有交叉保護(hù)[6］，對(duì)口蹄疫的防治帶來(lái)了極大的困難?？谔阋咭呙缡峭ㄟ^(guò)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，進(jìn)而抑制和殺滅口蹄疫病毒達(dá)到保護(hù)動(dòng)物健康作用的，在預(yù)防和控制動(dòng)物口蹄疫的發(fā)生和流行方面做出了巨大的貢獻(xiàn)。為落實(shí)《國(guó)家疫病防控中長(zhǎng)期規(guī)劃》，促進(jìn)口蹄疫防控工作開(kāi)展.自2013年9月1日起. 國(guó)家強(qiáng)制免疫用口蹄疫疫苗將逐步執(zhí)行新的疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，新生產(chǎn)的口蹄疫滅活疫苗及合成肽疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)由每頭份3PD50提高到6PD50：新生產(chǎn)的口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素每頭份疫苗不超過(guò)50EU。所以，對(duì)口蹄疫疫苗免疫后的血清抗體監(jiān)測(cè)，有助于口蹄疫的防控。龔小莉[23］對(duì)南川地區(qū)2012年豬口蹄疫血清抗體進(jìn)行了檢測(cè)評(píng)估分析，結(jié)果平局合格率達(dá)到89.7%，按照農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)[2012］1號(hào)文件規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，全年各月抗體合格率均超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明阜寧地區(qū)2012-2015年口蹄疫疫苗免疫良好。本研究發(fā)現(xiàn)從2011年5月到2015年5月，阜寧縣豬口蹄疫血清抗體陽(yáng)性率分別為83.9%，86.9%，90.0%，93.8%和94.8%，均達(dá)到了農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2012〕1號(hào)文件規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，且隨著時(shí)間的推移，到2015年平均陽(yáng)性率近95%，說(shuō)明阜寧縣最近5年內(nèi)豬口蹄疫疫苗免疫效果良好，需要堅(jiān)持執(zhí)行豬口蹄疫免疫方案。然而近兩年來(lái)口蹄疫其他毒株如A型毒株的感染率正在升高，必須引起足夠的重視。

疫苗免疫的關(guān)鍵在于疫苗的質(zhì)量和疫苗接種程序及技術(shù)。影響疫苗免疫效率主要有：疫苗質(zhì)量差，滴度不夠，過(guò)期；疫苗污染；防疫操作不規(guī)范，交叉感染意識(shí)不強(qiáng)；春、秋防疫措施的缺陷；母源抗體的干擾及免疫程序不合理等。所以一般疫苗免疫需要注意以下幾個(gè)注意事項(xiàng)：（1）使用正規(guī)廠家生產(chǎn)的疫苗；（2）嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求對(duì)疫苗和稀釋液進(jìn)行保管、運(yùn)輸和使用；（3）注意疫苗包裝完整與過(guò)期與否；（4）免疫前注意預(yù)免疫豬群的健康狀態(tài)；（5）選擇合適免疫方式及合適的注射針頭，做到一畜一針頭，避免交叉感染；（6）疫苗接種前、后各一周內(nèi)，嚴(yán)禁使用抗病毒藥物或抗生素。（7）用過(guò)的疫苗瓶、器具和未用完的疫苗等應(yīng)進(jìn)行消毒處理，嚴(yán)禁隨意丟棄。

4　結(jié)論

在2011年到2012年期間對(duì)江蘇省阜寧縣19個(gè)鎮(zhèn)區(qū)（街道）內(nèi)各地區(qū)口蹄疫血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)的豬口蹄疫血清抗體陽(yáng)性率總體較高，免疫保護(hù)力呈逐漸遞增趨勢(shì)，免疫效果良好，但還未達(dá)到100%保護(hù)率，需堅(jiān)持執(zhí)行疫苗免疫方案。

[1]董保豫，猶銀俊，周啟澤，等.豬瘟、豬口蹄疫、高致病性豬藍(lán)耳病疫苗不同組合免疫效果觀察[J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2011，35 （5）：16-18.

[2]Alexandrov T，Stefanov D，Kamenov P，Miteva A，Khomenko S，Sumption K，Meyer-Gerbaulet H，Depner K. Surveillance of footand-mouth disease（FMD）in susceptible wildlife and domestic ungulates in Southeast of Bulgaria following a FMD case in wild boar[J］.Veterinary microbiology，166（1-2）：84-90.

[3]李國(guó)友，葉陽(yáng).血清抗體跟蹤監(jiān)測(cè)藍(lán)耳病苗和豬瘟苗抗體水平及相互影響[J］.今日畜牧獸醫(yī)，2007，（9）：7-10.

[4]馬雪蓮.對(duì)口蹄疫的綜合防治的探究[J］.畜牧獸醫(yī)，2013，（6）：188.

[5]劉玉梅，趙利平，劉國(guó)英，等.應(yīng)用ELISA方法判定口蹄疫疫苗毒株血清學(xué)相關(guān)關(guān)系[J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2013，38（3）：29-32.

[6]白曉亮，張慶德.使用口蹄疫疫苗的必備知識(shí)[J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2013，（5）：31.

本項(xiàng)目受2015年省年農(nóng)業(yè)三新項(xiàng)目資助