何姍珊，方位寬，經(jīng) 艷，譚 芳，韋永定，韋士評，梁朝旭，李 鳴

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院，廣西 南寧 530007；3.廣西武宣種畜場，來賓 武宣 545900）

甘蔗梢腐病原菌分離純化與ITS序列鑒定

何姍珊1，方位寬2，經(jīng) 艷1，譚 芳1，韋永定3，韋士評3，梁朝旭1，李 鳴1

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院，廣西 南寧 530007；3.廣西武宣種畜場，來賓 武宣 545900）

采集甘蔗梢腐病發(fā)病植株葉片為材料，采用組織分離法，分別取發(fā)病甘蔗葉片和葉片的病健交接處，用PDA培養(yǎng)基對甘蔗梢腐病病原菌進行分離和純化，將純化后的菌株進行形態(tài)學和顯微鏡觀察，采用CTAB法提取菌絲DNA，利用2對真菌ITS通用引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后，回收特異條帶，T克隆測序。結(jié)果表明，甘蔗梢腐病原菌ITS序列與鐮刀菌屬ITS序列高度同源，屬于鐮刀菌屬。

甘蔗梢腐??；病原菌分離純化；ITS序列鑒定

甘蔗梢腐病是一種由鐮刀菌（Gibberella fujikuroi（Saw.）Wolle.，無性階段為Fusarium moniliforme Sheldon），有性態(tài)為串珠赤霉菌（Gibberella moniliforme Wineland）引起的，是甘蔗生產(chǎn)中常見的一種真菌性病害（Martin JP，et al.，1984；Raid RN，et al.1991，2002）。甘蔗梢腐病主要發(fā)生在高溫高濕、甘蔗生長最旺盛的6～9月份，也常發(fā)生在干旱后遇到降雨、干旱后充分灌水或施用氮肥過多等環(huán)境下。甘蔗梢腐病病原菌為鐮刀菌，主要危害蔗莖的梢部和葉片，感病后引起腐爛，故名梢腐病。帶病甘蔗種苗是甘蔗梢腐病的初次侵染來源，分生孢子隨風雨傳播，降落在梢頭心葉上，依靠心葉水分萌芽侵入。被害心葉呈梯形凸凹捻曲，并有縱裂，梢頭部的葉片常扭纏在一起變形，有明顯褐色皺紋。生長點受害時，引起甘蔗頂端腐爛和幼軸壞死，甚至腐爛發(fā)出惡臭，致使甘蔗莖整株干死?；疾〔课怀屎稚戏脚加械壹t色或淡黃色的粉霉狀物，時而伴有黑色小點。該病于1921年印度尼西亞爪哇首次報道，目前幾乎遍及所有甘蔗生產(chǎn)國和地區(qū)，并引起比較嚴重的病害，造成一定的損失（張國棉，2009）。早在1989年，廣東省珠江三角洲蔗區(qū)梢腐病突然爆發(fā)，造成POJ2878品種10%～38%的甘蔗莖枯死（黃鴻能，1993）。目前，甘蔗梢腐病在我國南方如廣西、廣東、福建、臺灣、云南和海南等甘蔗生產(chǎn)區(qū)都普遍發(fā)生。王伯輝報道，2005年廣西部分蔗田甘蔗梢腐病發(fā)生較重，特別是新臺糖23、新臺糖25和新臺糖26品種，病株率高達70%～80%（王伯輝，2007）。韋金菊等報道，2010年廣西主蔗區(qū)如柳州、隆安和北海等地甘蔗梢腐病發(fā)病率在25%以上，最高達40%。隨著新臺糖22等易感病甘蔗品種的引進和大面積推廣種植，甘蔗梢腐病發(fā)生呈逐漸加重的趨勢，已經(jīng)成為甘蔗生長前中期的主要病害（韋金菊，2012）。

近些年來，有關甘蔗梢腐病的研究，國外大多聚焦于病原菌Gibberella fujikuroi及其無性態(tài)串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme Sheldon的分類學、種系發(fā)育，以及代謝產(chǎn)物等方面進行（Hanson J.R，1996；Bacon，C.W，1996；Emma T，4000）。由于我國對甘蔗病害的基礎性研究比較薄弱，與先進國家相比有較大差距，關于甘蔗病害研究還停留在甘蔗梢腐病的發(fā)生和防治（黃鴻能，1990；劉夢林，1991；馮奕璽，2002；盧昌，2002；盧文潔，2007；李釗，2013）。由于傳統(tǒng)真菌的分類、鑒定主要是基于營養(yǎng)體和子實體的形態(tài)學特征并結(jié)合其生理生化性狀的描述。由于真菌形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件和其他因素影響，且許多子實體類型很難獲得，傳統(tǒng)分類方法無法滿足準確鑒定和分類要求。近年來，由于真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列能夠反映出屬間、種間以及菌株間堿基對差異，已被廣泛應用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究。本文除了對純化菌株進行形態(tài)學和顯微鏡觀察外，還利用分子技術在DNA水平對其進行ITS鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

試驗材料采集于廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所田間實驗，實驗材料為桂糖43號。利用組織分離法，分別取患有梢腐病甘蔗植株的病葉葉片，沖洗干凈后，在葉片病健交界處，切下5mm×5mm的小塊，用濃度為0.1%的升汞溶液消毒3min，75%乙醇溶液浸泡1min，用無菌水沖洗3次，在超凈工作臺吹干后轉(zhuǎn)入PDA平板培養(yǎng)基上（取土豆200g，洗干凈，去皮后切成小塊，加水1000 mL煮沸25 min，用紗布過濾，加水將濾液補充至1000 mL，加入20g葡萄糖和20g瓊脂，加熱充分溶解即可），25℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌絲后，在菌落邊緣用無菌接種針挑取小塊帶有菌絲的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至新PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)。反復多次培養(yǎng)、挑菌、轉(zhuǎn)移至新PDA培養(yǎng)基，直至無雜菌出現(xiàn)。

1.1.2 引物選擇

利用2對真菌ITS通用引物ITS1（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），ITS3（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲DNA提取

挑取菌絲，轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落覆蓋培養(yǎng)皿80%左右時刮下菌絲置于2ml離心管中，參照上海生工真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取菌絲DNA。

1.2.2 ITS特異性擴增和序列分析

分別用真菌ITS通用引物對菌絲DNA進行PCR擴增：ITS1（5’-GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3’），ITS3（5’-TCCGTAGGTGAACCTCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGC TT ATTGATATGC-3’），以菌絲DNA為模板，用引物ITS1和ITS2進行PCR擴增，反應體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/LdNTPs Mixture 0.5μL，MAP1和MAP2引物（10μmol/L）各1.0μL，ddH2O 19.3μL，cDNA模板0.5μL，總體積25.0μL。反應程序為：95℃預變性3 min；95℃120 s，54℃30 s，72℃1 min，進行35個循環(huán)，72℃5min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根司）回收目的片段，回收產(chǎn)物連接T載體，反應體系為：5.0μL SolutionⅠ，4.5μL模板，0.5μL pMD18-T載體，16℃保溫2.5 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細胞，37℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)和顯微鏡觀察

在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈放射式，白色絨毛狀（如圖1），菌絲生長速度緩慢，7d左右長滿培養(yǎng)皿，取菌絲在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有大小兩種分生孢子，大分生孢子呈鐮刀形，也有蓮藕狀，有多個黑色小顆粒（圖2）；小分生孢子，呈半月形，紡錘形，且在兩端各有1個黑色小顆粒（圖3）。

2.2 PCR擴增和ITS序列分析

圖1 在PDA培養(yǎng)基上的菌絲

圖2 顯微鏡下大分生孢子形態(tài)

圖3 顯微鏡下小分生孢子形態(tài)

圖4 PCR擴增ITS電泳結(jié)果M：DNA marker

由圖4可知，1%瓊脂糖凝膠電泳表明，PCR擴增產(chǎn)物具有很高的特異性，且產(chǎn)物片段大小在500-750bp之間，與預期結(jié)果一致。T-克隆送上海生個測序，獲得一條長度為493bp的序列如下：

CCCTGTGACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGA TCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCC AGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTT CTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAA CAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA CGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCA GAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAT TGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTT CGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTT GGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGC CGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGC TTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGT ACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTT CTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCG CTGAACTTAAGCATATC

將上述序列在NCBI中進行Blast比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與鐮刀菌屬呈100%的同源性（如圖5）。由此表明，實驗分離和純化得到的菌絲屬于鐮刀菌屬。

圖5 序列在NCBI blast比對結(jié)果

3 結(jié)論和討論

本試驗采用組織分離法對甘蔗梢腐病病原菌進行分離、純化，實驗表明甘蔗梢腐病可以利用PDA培養(yǎng)基，從患有梢腐病甘蔗植株的病葉葉片快速獲得，且純化后的菌絲長勢好，在25℃下生長速度快，并且污染率很低，這有可能與樣品用0.1%升汞3min浸泡時間分不開，75%乙醇浸泡后，用無菌水多次沖洗后，一定置于超凈工作臺吹干樣品，有利于減少污染。試驗使用的PDA培養(yǎng)基不需要添加其他營養(yǎng)成分，培養(yǎng)基含有菌絲生長所需的營養(yǎng)物資和微量元素，完全滿足菌絲分離和生長速度。

本試驗關于菌種鑒定采用ITS法，其準確性高且簡單易行。通過對菌絲體的ITS區(qū)段長度進行比對，驗證了供試菌絲體屬于鐮刀菌屬，為進一步研究甘蔗梢腐病提供了科學依據(jù)。

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S566.108

B

2095-820X（2016）04-05

2016-06-29

國家自然基金（31460093，31400281）；廣西科學研究與技術開發(fā)項目（桂科重14121005-1-2，桂科攻1598006-1-1D）。

何姍珊（1981-），女，甘肅金昌人，大學本科，主要從事甘蔗育種研究，email：shanbh613@126.com。

簡介：李鳴（1977-），博士，副研究員，主要從事甘蔗育種研究工作，email：gxua9606@163.com；梁朝旭（1972-），碩士，副研究員，主要從事甘蔗育種工作，email：nnlzx@126.com。