段俊敏， 佘佳榮， 黃 麗， 黃 軍

(湖南省林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410007)

炭化竹席中羅丹明B的高效液相色譜熒光檢測(cè)法

段俊敏， 佘佳榮， 黃 麗， 黃 軍

(湖南省林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410007)

通過(guò)對(duì)竹席樣品中的羅丹明B用乙醇水溶液提取，經(jīng)C18反相色譜柱分離，熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明： 羅丹明B在0.1～200 μg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9999，在20、500、5000 μg/kg添加水平時(shí)的回收率為80.6%～92.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～2.1%(n=6)，定量檢出限為5.0 μg/kg。高效液相色譜熒光檢測(cè)法適用于竹席中羅丹明B的測(cè)定，并具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

炭化竹席； 羅丹明B； 高效液相色譜； 熒光檢測(cè)

近年來(lái)，炭化竹席因顏色偏深黑，符合人們深色更大氣、上檔次的審美觀，受到消費(fèi)者們的推崇。高溫炭化工藝分解了竹材內(nèi)的糖分、淀粉、脂肪及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，破壞了適合蟲(chóng)卵生存的環(huán)境，不易出現(xiàn)蟲(chóng)蛀。且處理后的竹席比普通竹席更堅(jiān)硬，不易起竹刺。

但有些商家偷工減料，用工業(yè)染料將竹席染制成炭化竹席的顏色，冒稱(chēng)炭化竹席。在夏天竹席直接接觸皮膚，染色竹席上有工業(yè)染料的殘留，不利于身體健康。羅丹明B又名堿性玫瑰精，是染制炭化竹席常用的染料。有關(guān)研究指出，羅丹明B會(huì)引起老鼠皮下組織生肉瘤，半數(shù)致死量(大鼠，經(jīng)口)500 mg/kg[1]。由于羅丹明B具有潛在的毒性、致癌、致突變性現(xiàn)已禁用作為食品染色劑[2]與化妝品著色劑[3]。羅丹明B具有三苯甲烷類(lèi)堿性染料結(jié)構(gòu)，是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料[4]，具體化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 羅丹明B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of rhodamine B

因此，需盡快建立炭化竹席中羅丹明B的檢測(cè)方法，以期達(dá)到區(qū)分目前市場(chǎng)上染色竹席與炭化竹席的目的。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀(島津LC2010A，島津公司)，帶熒光檢測(cè)器(FLD)；電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、WJX — 200型高速多功能粉碎機(jī)；冷凝回流裝置；標(biāo)準(zhǔn)篩：60目，100目；0.45 μm尼龍濾膜；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 羅丹明B( Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)，純度≥98.6 %；甲醇(色譜純)、乙醇(分析純)、水(一級(jí)水)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液： 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。此溶液在0～4 ℃下避光保存。標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇水1∶1的溶液稀釋成0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于0～4 ℃下避光保存。

1.2樣品前處理方法

1.2.1 干燥、恒重 稱(chēng)取去除裝飾后的炭化竹席樣品100 g左右，在(103±2)℃條件下干燥至質(zhì)量恒定(半小時(shí)之后，兩次稱(chēng)量所得的質(zhì)量差小于稱(chēng)量樣品質(zhì)量的0.1%，即為質(zhì)量恒定)，備用。

1.2.2 粉碎、過(guò)篩 將炭化竹席樣品處理成適當(dāng)大小，放入粉碎機(jī)中粉碎，使樣品均通過(guò)60目篩。并去除過(guò)篩后樣品中100目以下的樣品，即得60目至100目之間的樣品。密封保存于干燥器中，備用。

1.2.3 試樣提取 稱(chēng)取(1.2.2)中處理好的60目至100目之間的樣品2 g(精確到0.0001 g)，于150 mL圓底燒瓶中，準(zhǔn)確加入100mL乙醇水1∶1的溶液。記錄加入溶液后，圓底燒瓶的總質(zhì)量。在70 ℃水浴中加熱、回流2 h；將圓底燒瓶取出，冷卻至室溫后，再次稱(chēng)重，并補(bǔ)足減失的乙醇水質(zhì)量。搖勻，靜置5 min后，吸取上清液，過(guò)0.45 μm尼龍有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)入樣品瓶中，待分析[5-6]。

1.3液相色譜條件

色譜柱： Inert Sustain C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，或與此相當(dāng)者；流動(dòng)相A為H2O；流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫：0.01→5 min B∶60%；5→35 min B∶60→95%； 35→38 min B∶95% ；38→42 min B∶95→60%；42→50 min B∶60%；流速：1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器 FLD 激發(fā)波長(zhǎng)Ex∶550 nm ；發(fā)射波長(zhǎng) Em 580 nm ；柱溫箱溫度：40 ℃。

1.4測(cè)定方法

分別向液相色譜儀注入等體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰面積，并與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)峰面積進(jìn)行比較，外標(biāo)法定量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 過(guò)篩目數(shù)的確定 實(shí)驗(yàn)中采用的高速多功能粉碎機(jī)，粉碎程度為50～300目。比較了將同一樣品制備成60～100目與100目以下時(shí)測(cè)定值與重現(xiàn)性的差別，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)據(jù)表明60～100目之間的樣品，具有更好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性。因?yàn)?00目以下的樣品粉碎粒度含100～300目，比表面積相差較大，樣品的均勻性較差。

表1 60～100目與100目以下樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)比較Tab1 Thedeterminationdatacomparisonofthesamplebelow100meshto60～100mesh樣品名稱(chēng)60～100目100目以下濃度(μg/kg)RSD(%)濃度(μg/kg)RSD(%)炭化樣品1698614812125035187197染色樣品1487563861855842623382072530125

2.1.2 提取條件的選擇 提取方式的比較：稱(chēng)取同一樣品2 g左右加入150 mL圓底燒瓶中，超聲1 h后，過(guò)0.45 μm有機(jī)膜，裝入樣品瓶中待分析；另一份按1.2.3樣品處理步驟進(jìn)行處理，均采用雙平行實(shí)驗(yàn)。對(duì)至少3個(gè)以上樣品進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加熱回流2 h比超聲1 h的提取效果要好。

提取溶劑的比較：比較了不同提取溶劑：乙腈，乙腈∶水1∶1，甲醇，甲醇∶水1∶1，乙醇∶水1∶1對(duì)竹席中羅丹明B的提取率，提取結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上述溶劑均能有效提取竹席中羅丹明B，因乙腈、甲醇均具有一定的毒性，本實(shí)驗(yàn)選擇了低毒、價(jià)廉的乙醇水1∶1作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑提取效果比較Fig.2 The compare of the effect of different solvents extraction

提取時(shí)間的比較：以乙醇： 水1∶1為提取溶劑，比較了不同提取時(shí)間對(duì)羅丹明B提取效果的影響，提取結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)比較了30、60、90、120、180、240、300 min時(shí)羅丹明B的提取含量。測(cè)定結(jié)果顯示，開(kāi)始時(shí)，隨時(shí)間增加溶劑中羅丹明B的含量迅速增加，但到達(dá)一定時(shí)間后，提取含量趨向飽和。為保證提取含量測(cè)定的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)選取了飽和點(diǎn)之后的120 min作為提取時(shí)間，以達(dá)到良好的提取效果。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)竹席中羅丹明B提取效果的影響Fig.3 Performance evaluation on the extraction time of rhodamine B in bamboo mat

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇水、甲醇與0.3%乙酸水為流動(dòng)相時(shí)的分離情況[8]。水相中加酸后，并未顯示出更好的分離能力。從圖4標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖可以看出，以甲醇水為流動(dòng)相時(shí)，羅丹明B出峰峰形良好，無(wú)前延與與拖尾現(xiàn)象。

圖4 羅丹明B10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜熒光譜圖Fig.4 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B standard

竹席的乙醇水提取溶液經(jīng)C18柱分離，強(qiáng)極性物質(zhì)先出峰，弱極性物質(zhì)后出峰。實(shí)驗(yàn)比較了乙腈水、甲醇水為流動(dòng)相時(shí)，樣品的分離情況。一般情況下，乙腈相對(duì)甲醇具有更好的洗脫能力。而竹席樣品的乙醇水提取溶液中，羅丹明B出峰附近有極性相近的雜峰，甲醇水為流動(dòng)相有更好的分離能力，見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 原竹樣品的液相色譜熒光譜圖Fig.5 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in bamboo

圖6 染色竹席樣品的液相色譜熒光譜圖Fig.6 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in dyeing bamboo mat

2.2.2 梯度洗脫程序的選擇 以A相純水，B相甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫的程序最終確定為0.01→5 min B 60%；5→35 min B 60%→95%。開(kāi)始時(shí)，采用40%的水相促進(jìn)樣品中不同極性物質(zhì)的分離，后采用高有機(jī)相進(jìn)行洗脫，使得目標(biāo)化合物

羅丹明B獲得良好的峰形，見(jiàn)圖7。即使在染色竹席樣品中，羅丹明B附近干擾峰較多的情況下，分離度仍能達(dá)到1.6以上，理論塔板數(shù)60000多，見(jiàn)圖6。

圖7 漂白竹席樣品液相色譜熒光譜圖Fig.7 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in bleached bamboo mat

2.3羅丹明B檢出的確認(rèn)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，依據(jù)色譜保留時(shí)間定性，原竹、漂白竹席、炭化竹席、染色竹席樣品中均有羅丹明B的檢出，見(jiàn)圖8；而平行的空白對(duì)照中，沒(méi)有羅丹明B的出峰,見(jiàn)圖9。且染色樣品中羅丹明B含量遠(yuǎn)高于其它樣品。

圖8 原竹、炭化竹席、漂白竹席、與羅丹明B10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比液相色譜熒光譜圖Fig.8 A comparison of HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in bamboo, thermo-modified bamboo mat, bleached bamboo mat and rhodamine B standard 10 μg/L

采用色譜保留時(shí)間定性的方式，竹席制品中均有羅丹明B的出峰，為確認(rèn)該出峰為同一物質(zhì)，而非該色譜條件下保留時(shí)間一致的其它化學(xué)物質(zhì)，按照《SN/T 2430-2010 進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》[9]中液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜條件，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，定性、定量離子對(duì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，進(jìn)行了原竹、炭化竹席、染色竹席樣品中羅丹明B的檢測(cè)和確證，均有羅丹明B的檢出見(jiàn)(圖10～圖13)，且羅丹明B的檢出含量與熒光檢測(cè)方法檢出的含量基本一致[10-11]。

圖9 空白對(duì)照的液相色譜熒光譜圖Fig.9 The HPLC fluorescence spectrogram for rhodamine B in blank control

表2 羅丹明B定性離子對(duì)、定量離子對(duì)Tab2 Qualitativeion?pairandquantitativeion?pairwereselectedforrhodamineB化合物羅丹明B母離子(m/z)子離子(m/z)定量離子對(duì)443399定性離子對(duì)443355

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性范圍

以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程。

在0.1～200 μg/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程Y=22204.07X+717.23，R=0.9999。

圖10 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子色譜圖Fig.10 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatograms for rhodamine B standard

圖11 原竹樣品溶液中羅丹明B的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子色譜圖Fig.11 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatogram for rhodamine B in bamboo

圖12 炭化竹席樣品溶液中羅丹明B的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子色譜圖Fig.12 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatogram for rhodamine B in thermo-modified bamboo mat

圖13 染色竹席樣品中羅丹明B的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子色譜圖Fig.13 LC/MS/MS extracting ion current of multiple reaction monitoring chromatogram for rhodamine B in dyeing bamboo mat

2.5方法的回收率和精密度

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定了添加在20 、500、5000 μg/kg加標(biāo)水平時(shí)的羅丹明B的回收率，分

別進(jìn)行回收率和重現(xiàn)性的計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可見(jiàn)，該方法具有較高的準(zhǔn)確度與可靠性[12]。

表3 竹席樣品中羅丹明B的加標(biāo)回收率(n=6)Tab3 TherecoveryofstandardadditionforrhodamineBinbamboomat(n=6)添加水平(μg/kg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)208268158147927808078062150093393090894194391292816500090989690489089592290313

2.6檢出限

本方法中羅丹明B的檢出限用兩種方法表示：檢測(cè)限(LOD)0.5 μg/kg(S/N>3)，定量限(LOQ)為5.0 μg/kg(S/N>10)。

2.7實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)4個(gè)原竹，3個(gè)漂白竹席，10個(gè)染色竹席，6個(gè)炭化竹席樣品中羅丹明B含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)染色樣品中羅丹明B的含量與其它樣品中羅丹明B含量有數(shù)量級(jí)的差別，部分樣品的測(cè)定值見(jiàn)表4。

表4 不同竹席樣品中羅丹明B的含量測(cè)定(n=4)Tab4 DeterminationofrhodamineBindifferentbamboomatsamples樣品名稱(chēng)/序號(hào)測(cè)定濃度(μg/kg)平均濃度(μg/kg)RSD(%)原竹118222423221202858679758164漂白竹席189928894913026365626864411656864776986炭化竹席250475150503537681847579541488674621049298506484875638染色竹席263574631936111661470623382034890845095512844130146647944393994172436304396433926757

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)高效液相色譜 — 熒光檢測(cè)法建立了一種快速、靈敏、簡(jiǎn)單的測(cè)定炭化竹席中羅丹明B含量的方法，該方法具有前處理方法簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點(diǎn)，為鑒定炭化竹席的真?zhèn)翁峁┝思夹g(shù)支持。

竹席制品中染料的檢測(cè)，有的按紡織品C類(lèi)的要求進(jìn)行[13]，禁用可分解致癌的芳香胺染料，并有相關(guān)的檢測(cè)方法[14]《GB/T 17952-2011 紡織品禁用偶氮染料的測(cè)定》，但尚未見(jiàn)到竹席制品中羅丹明B檢測(cè)方面的報(bào)道。目前市場(chǎng)上的“炭化竹席”大部分采用工業(yè)染料羅丹明B染制而成，以假亂真損害著經(jīng)高溫炭化處理工藝制成的炭化竹席的品牌信譽(yù)。炭化竹席中羅丹明B檢測(cè)方法的建立，能達(dá)到區(qū)分目前市場(chǎng)上炭化竹席與染色竹席的目的。對(duì)保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益[15]，規(guī)范炭化竹席產(chǎn)業(yè)，保護(hù)環(huán)境具有重要意義。

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[2] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)[R]http://www.gov.cn/gzdt/2008-12/15/ content _1178408.htm

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DeterminationofrhodamineBinthermo-modifiedbamboomatbyhighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetection

DUAN Junmin, SHE Jiarong, HUANG Li, HUANG Jun

(Hunan Quality Inspection and Testing Center for Forest Products, Changsha 410007, China)

Rhodamine B in samples were extracted with ethanol-water solution, separated on C18 reverse-phase chromatography column and detected by fluorescence detector. The results showed that, linear correlation coefficient was 0.9999, over the range of 0.1～200 μg/L. The recoveries were 806%～92.8% for spiked standards at 20，500，5000 μg/kg levels with RSD of 1.3%～2.1%(n=6)，and the detection limit was 5.0 μg/kg. The high performance liquid chromatography with fluorescence detection method has the advantages of simple，fast and accurate，is suitable for determination of rhodamine B in bamboo mat.

thermo-modified bamboo mat； rodamine B；HPLC； fluorescence detection

2015-05-12

段俊敏(1985-)女，湖南省益陽(yáng)市人，碩士，主要從事分析化學(xué)、林產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)工作。

O 657.7+2

A

1003 — 5710(2016)04 — 0054 — 07

10.3969/j.issn. 1003 — 5710.2016.04.012

(文字編校：楊 駿)