李 斌, 孟慶陽，2， 李言達(dá)，3, 董文攀， 鄭勇奇

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091； 2. 河南科技大學(xué)， 河南 洛陽 471023；3.北京大學(xué) 生命科學(xué)院， 北京 100871； 4.中國科學(xué)院 植物所， 北京 100093)

白皮松種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)

李 斌1, 孟慶陽1，2， 李言達(dá)1，3, 董文攀3，4， 鄭勇奇1

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091； 2. 河南科技大學(xué)， 河南 洛陽 471023；3.北京大學(xué) 生命科學(xué)院， 北京 100871； 4.中國科學(xué)院 植物所， 北京 100093)

采集白皮松3個(gè)新變異類型(盆仙白皮松、瑞王白皮松、9號(hào)樹)、北京良種基地母樹、北京市掛牌古樹等共48個(gè)樣品，應(yīng)用SSR技術(shù)，對(duì)上述樣品分別進(jìn)行鑒定和多樣性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：同一個(gè)變異類型的無性系與其原變異枝之間在所有位點(diǎn)上均不存在差異，說明其無性系及其原變異枝屬于相同的基因型，“瑞王白皮松”和其母株(古樹152)非變異枝間在SSR — Y5位點(diǎn)上存在差異，“瑞王白皮松”與“盆仙白皮松”在SSR — Y2位點(diǎn)上存在差異?！?號(hào)樹”在Y2、Y5 2個(gè)位點(diǎn)上與“盆仙白皮松”、“瑞王白皮松”不同，而與其母樹群體莽山良種基地的母樹相同?？梢酝ㄟ^上述位點(diǎn)的檢測(cè)來鑒定3個(gè)不同的變異類型?！芭柘砂灼に伞薄ⅰ叭鹜醢灼に伞焙汀?號(hào)樹”、古樹群組、莽山群組間的遺傳距離分別為0.0211、0.0114、0.0813、0.0638。 “瑞王白皮松”與“盆仙白皮松”間、“瑞王白皮松”與古樹間存在遺傳上的差異。參試樣品的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s多樣性指數(shù)(Nei’s)的平均值分別為1.230、0.302、0.221、0.189、0.197。多樣性水平略高于白皮松人工群體而與白皮松天然群體接近，說明參試樣品具有較高的遺傳多樣性水平，具有選擇利用的遺傳基礎(chǔ)較好。

白皮松； 種質(zhì)資源； SSR； 鑒定

種質(zhì)資源是國家的重要戰(zhàn)略資源，開展種質(zhì)資源鑒定、評(píng)價(jià)與遺傳多樣性研究是植物遺傳育種和資源開發(fā)利用的前提和基礎(chǔ)，對(duì)于發(fā)掘和利用我國種類豐富的植物種質(zhì)資源有重要意義。然而，由于植物種內(nèi)變異豐富，種質(zhì)資源復(fù)雜多樣，它們的許多重要性狀和種內(nèi)變異類型還沒有得到鑒定、評(píng)價(jià)和發(fā)掘利用，特別是近20年來，一批有價(jià)值的植物種質(zhì)資源得到了保存，當(dāng)然也有一些具有重要價(jià)值的種質(zhì)資源仍然處于野生狀態(tài)，對(duì)人工保存種質(zhì)以及具有潛在價(jià)值的野生種質(zhì)，如何通過鑒定、評(píng)價(jià)并發(fā)掘其利用價(jià)值，以及如何進(jìn)一步對(duì)它們提出科學(xué)合理的保存與利用策略，是植物種質(zhì)資源工作者今后迫切需要研究的問題。傳統(tǒng)的種質(zhì)資源鑒定、評(píng)價(jià)與遺傳多樣性研究的方法是通過建立野外試驗(yàn)林，進(jìn)行長期觀測(cè)。該方法已應(yīng)用于很多樹種的相關(guān)研究中，可以有效用于分析和評(píng)價(jià)樹種種質(zhì)資源。另一方面，近幾十年迅速發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)，直接從DNA水平上揭示種質(zhì)多態(tài)性，并可提高種質(zhì)資源評(píng)價(jià)分析效率。SSR(Simple Sequence Repeats)又稱微衛(wèi)星(Microsatellite)，早在1974年，Skinner[1]研究寄居蟹的基因組時(shí)，就發(fā)現(xiàn)了SSR序列(AC)n/(TG)n的存在。Schafer做了進(jìn)一步的研究使之發(fā)展成為新的DNA分子標(biāo)記。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，盡管出現(xiàn)了諸如AFLP、ISSR、SCAR、SRAP、STS等新的標(biāo)記方法。但SSR分子標(biāo)記因具有諸多的優(yōu)越性，在動(dòng)、植物種質(zhì)資源的遺傳分析中得到了廣泛應(yīng)用[2-3]。

白皮松(Pinusbungeana)天然分布在山西、陜西、甘肅、河南、四川、湖北等地[4]，其樹形優(yōu)美，極具觀賞價(jià)值，是我國華北地區(qū)廣受歡迎的園林綠化樹種，在陵園、寺廟可見到數(shù)百年甚至上千年仍然郁郁蔥蔥的白皮松古樹。白皮松與銀杏、柏木、國槐并稱四大長壽命景觀樹種，在華北、西北等地園林綠化中的應(yīng)用日漸增加，在其他國家如韓國也被列為重要的優(yōu)良風(fēng)景林樹種和行道樹種。白皮松是耐旱、耐低溫和耐污染(SO2、煙塵，臭氧)很強(qiáng)的樹種。此外，白皮松花粉具有保健作用，含有多種參與人體代謝的生理活性物質(zhì)。近年，對(duì)白皮松天然群體種實(shí)形態(tài)多樣性的研究[4]為揭示白皮松的群體遺傳學(xué)提供了大量基礎(chǔ)信息，在等位酶水平上研究白皮松群體保育遺傳也有報(bào)道[5]。本研究使用SSR分子標(biāo)記對(duì)白皮松變異類型、良種母樹、古樹進(jìn)行鑒定分析，并對(duì)其遺傳多樣性水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，為更好的保護(hù)和利用白皮松種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)共采集48個(gè)樣品，包括來自北京昌平十三陵林場(chǎng)白皮松良種基地的樣株30株，來自北京市掛牌保護(hù)的古樹9株，還有以下3個(gè)變異類型及其原株：“盆仙白皮松”無性系2個(gè)及其原株共3個(gè)樣(原株為整株變異)；簇生變異類型“瑞王白皮松”無性系2個(gè)及其原株共3個(gè)樣；密枝變異類型“9號(hào)樹”無性系2個(gè)及其原株共3個(gè)樣。試驗(yàn)樣品中，“瑞王白皮松”母株與9株古樹為同一批，栽植時(shí)間與地點(diǎn)相同，同屬于一個(gè)小群落；“盆仙白皮松”原株和“9號(hào)樹”原株均來自于昌平十三陵林場(chǎng)的白皮松良種基地，同屬于一個(gè)小群落。

“盆仙”白皮松與“瑞王”白皮松在形態(tài)學(xué)上同屬于短枝變異品種，在形態(tài)上表現(xiàn)為矮小、分支短而多，針葉短而稠密，沒有明顯的頂端優(yōu)勢(shì)，但具有很好的觀賞性，是非常有潛力的盆景觀賞品種，兩者來源不同，但形態(tài)類似。“9號(hào)樹”形態(tài)上與普通白皮松相似，但是樹枝和針葉多而密實(shí)，生長較快，適合用作園林景觀樹種。

2013年采集葉片。葉片從樹體取下后和硅膠一起放入自封袋中，帶回試驗(yàn)室后放入-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)材料采集時(shí)間與地點(diǎn)見表1。

續(xù)表1 實(shí)驗(yàn)材料采集時(shí)間與地點(diǎn)ContinuedTab1 Theseclectedtimeandspotofexperi?mentmeteral編號(hào)樣品名稱采集人采集時(shí)間2013年(月-日)采集地點(diǎn)32良-P14李斌、劉建明05-17北京莽山33良-P9 李斌、劉建明05-17北京莽山③34良-P24李斌、劉建明05-17北京莽山35良-P20李斌、劉建明05-17北京莽山36良-P19李斌、劉建明05-17北京莽山37良-P18李斌、劉建明05-17北京莽山38良-P17李斌、劉建明05-17北京莽山39良-P30李斌、劉建明05-17北京莽山40良-P1 李斌、劉建明05-17北京莽山41良-P11李斌、劉建明05-17北京莽山42C3 李斌、劉建明05-17北京昌平④43C3’ 李斌、劉建明05-17北京昌平④44C3-1 李斌、劉建明05-17北京昌平⑤45C2 李斌、劉建明05-17北京昌平⑥46C2’ 李斌、劉建明05-17北京昌平⑥47C9 李斌、劉建明05-17北京昌平⑦48C9’ 李斌、劉建明05-17北京昌平⑦ 注：①“瑞王”白皮松母株(非變異枝)；②“瑞王”白皮松原變異枝；③9號(hào)樹原株；④“盆仙”白皮松無性系；⑤“盆仙”白皮松原株；⑥“瑞王”白皮松無性系；⑦9號(hào)樹無性系。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SSR分析 DNA樣品提取采用天根植物基因組提取試劑盒提??；提取后采用瓊脂糖電泳方法檢測(cè)總DNA。DNA條帶不夠清晰的樣品重新提取。

從松屬相關(guān)文獻(xiàn)中共查詢到309對(duì)SSR引物，然后對(duì)搜索到的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，選出擴(kuò)增效果較好并且具有1條或2條條帶的引物。用所選出的引物對(duì)不同種源的8個(gè)白皮松DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，選出適合白皮松遺傳分析的7對(duì)SSR引物[7]。擴(kuò)增引物采用趙罕篩選的7對(duì)引物序列，其特性見表2和表3。

引物合成采用合同方式委托“上海生工”合成，合成引物包括7對(duì)普通引物+不帶熒光的M13尾巴序列(5’ — TGT AAA ACG ACG GCC AGT — 3’)和1條5’端標(biāo)有CY5熒光標(biāo)記的M13 尾巴引物(CY5 — TGT AAA ACG ACG GCC AGT),便于熒光分析。

PCR擴(kuò)增采用兩步法，優(yōu)點(diǎn)是可以節(jié)省成本和提高效率，缺點(diǎn)是增加試驗(yàn)時(shí)間。第1步擴(kuò)增不添加熒光引物，第2步擴(kuò)增添加熒光引物。

PCR第1步擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°預(yù)變性5 min；95°變性30 s，55°退火30 s，72°延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；第2步擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°變性30 s，53°退火30 s，72°延伸45 s，8個(gè)循環(huán)；72°延伸10 min。

表2 引物序列Tab2 Primersequence編號(hào)名稱序列IDY136567-992-FCCAGACAACCCAAATGAACAGAATCAGGCGTCCAAT36567-992Y2RPtest9-FCCAGACAACCCAAATGAAGGGCCTGCTATCGAATCCAGAAContig1667Y3919347-FTCGCCTGGGCTTTGTCTGGCGGGTTGCATATTTGGTG9193-167Y4ssrPt＿ctg8767-FTGGGGAAAAATGGCATACATGGAGCAGACACCCATGGACTContig8767Y551113-3237-FTCCAGACAACCCAAATGACAGGCGTCCAATACCAGA51113-3237Y648044-7700-FTACGGTGGTCTGTTCTGCAGGCTTCTCCTGGTCTCC48044-7700Y7PtSIFG＿6058RAAGAGGTTGCTCCTCACCAAGCTCCATTTCAGAGCAGGTCCO361898

表3 引物特性Tab3 Primercharacteristics編號(hào)片段長度序列類型最優(yōu)退火溫度片段重復(fù)Y1259，249est 56～60(GAG)5(CAG)12(GCA)5Y2275，265est 54～60(AGC)10Y3411，405，416est 52～63(CTCAGC)5(CTCATC)5Y4210，212est 54～63(AGC)8Y5254，245est 54～63(GAG)5(GCA)11Y6544，596est 55～63(GATTGG)5Y7186，189est545～63(AT)6(GAC)5

SSR毛細(xì)管電泳：將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取15 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣板中，再加入0.4 μL PCR產(chǎn)物。然后使用BECKMAN CEQ8000遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

通過BECKMAN CEQ8000將毛細(xì)管電泳峰值圖按照無峰，有峰的規(guī)律自動(dòng)轉(zhuǎn)換為0,1數(shù)據(jù), 再將0,1數(shù)據(jù)按照每個(gè)引物作為1個(gè)等位基因位點(diǎn)看待，轉(zhuǎn)換成AA、AB、BB格式的基因型數(shù)據(jù)。

1.2.2 SSR多樣性參數(shù)分析 多樣性參數(shù)使用POPGENE32軟件計(jì)算：①觀測(cè)等位基因數(shù)Na；②有效等位基因數(shù)Ne；③Shannon's信息指數(shù) I；④期望雜合度(Ho)與觀測(cè)雜合度(He)；⑤Nei’s期望雜合度(1987)；⑥遺傳距離和遺傳一致度。根據(jù)遺傳相似度與遺傳距離，利用軟件NTSYS — pc2.1，以UPGMA方法，繪制各群體聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1變異位點(diǎn)和多態(tài)性

使用7對(duì)EST — SSR引物在48個(gè)白皮松樣品中共檢測(cè)到14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)?？偟膩碚f，白皮松種內(nèi)多態(tài)性變異不很豐富，這可能與白皮松在松樹中屬于比較保守的原始種類有關(guān)。

2.2優(yōu)良種質(zhì)資源鑒定

白皮松的優(yōu)良變異類型“瑞王白皮松”(C2)松針短硬而密集，顏色深綠，枝條粗短，生長緩慢，其無性系產(chǎn)生花芽，具有觀賞價(jià)值?！芭柘砂灼に伞?C3)與“瑞王白皮松”(C2)形態(tài)特征類似，松針短硬而密集，顏色濃綠，枝條粗短，生長緩慢，其無性系不產(chǎn)生花芽，整個(gè)樹冠更像“一個(gè)仙人球”，具有觀賞價(jià)值?！?號(hào)樹”(C9)是從白皮松良種基地挑選出來的，其樹冠比其周圍的白皮松樹冠濃密，枝葉密實(shí)，生長正常，能正常開花結(jié)實(shí)。經(jīng)過DNA檢測(cè)，結(jié)果如下。

(1) 通過beckman毛細(xì)管電泳可以看出，同一個(gè)變異類型的2個(gè)無性系及其原變異枝間在所有位點(diǎn)均不存在差異，說明同一變異類型的2個(gè)無性系及其原變異枝屬于相同的基因型。

(2) “瑞王白皮松”與其母株的非變異枝間在1個(gè)位點(diǎn)上存在差異，“瑞王白皮松”在Y5位點(diǎn)上呈BB純合子型，而母株的非變異枝為AB雜合子型，其余樣品在這個(gè)位點(diǎn)均呈現(xiàn)AB型或AA型。在Y2位點(diǎn)，“瑞王白皮松”呈現(xiàn)AB雜合型，這與“盆仙白皮松”AA不同，而與其他樣品相同(見圖1、2、3)。

(3) “盆仙白皮松”在Y2位點(diǎn)呈AA純合型，Y5位點(diǎn)呈BB雜合型，這與良種基地的樣品不同(見圖1、2、3)。

(4) “9號(hào)樹”在Y2，Y5 2個(gè)位點(diǎn)均呈現(xiàn)雜合型。在Y6位點(diǎn)，“9號(hào)樹”呈雜合型，良種基地群體其余樣本呈AA純合型或雜合型(見圖1、2、3)。

圖1 Y5位點(diǎn)(中為“瑞王”變異無性系、“盆仙”無性系及其原株基因型，下為“瑞王”母株無變異枝及9號(hào)樹的基因型,上為普通類型)Fig.1 Locus Y5(Top: common type; Center: “Ruiwang bungeana” variation clone, “Penxian bungeana ” clone and its original tree; Bottom: “Ruiwang bungeana” clone and “ancient tree No.9” )

圖2 Y2位點(diǎn)(上為“9號(hào)樹”基因型，中間為“盆仙”無性系及其原株基因型，下為“瑞王”無性系及其母株無變異枝基因型，良種基地的樣品為上下2類基因型)Fig.2 Locus Y2(Top: “ancient tree No.9”; Center: “Penxian bungeana ” clone and its original tree; Bottom: “Ruiwang bungeana” clone and its mother tree stick. The sample of certified seed base as same as top and bottom)

圖3 Y6位點(diǎn)(上為“9號(hào)樹”基因型，中間為“盆仙”無性系及其原株基因型，下為“瑞王”無性系及其母株無變異枝基因型，良種基地其他樣品分別為中、上2類)Fig.3 Locus Y6(Top: “ancient tree No.9”; Center: “Penxian bungeana ” clone and its original tree; Bottom: “Ruiwang bungeana” clone and its mother tree stick. The samples of certified seed base as same as top and center)

2.3變異類型之間及其與古樹群體、良種基地莽山群體的遺傳相似度、遺傳距離及聚類

將各無性系及其原變異枝分別定義為一組，用C2、C3、C9分別代表“瑞王白皮松”、“盆仙白皮松”和“9號(hào)樹”。GS代表古樹群體，MS代表良種基地莽山群體。

從表4可看出： C2與GS遺傳相似度高、遺傳距離小，C2與C9組遺傳相似度最低、遺傳距離最大。C3與C9遺傳相似度較高、遺傳距離較小，C3與GS組相似度最低，遺傳距離最大。這說明C3在遺傳進(jìn)化上與C9較近，而與GS相距最遠(yuǎn)。C9與MS遺傳相似度非常高、遺傳距離非常小，C9與GS組相似度最低，遺傳距離最大。C9可能存在遺傳變異的證據(jù)不充分。

聚類結(jié)果(圖4)表明： 9與MS首先聚在一起，證明了兩者最相似；然后兩者與C3聚在一起，說明C3,C9,MS可能存在相同的起源。事實(shí)上C9的原變株就是MS組中的一份子良 — P9。C2與GS在現(xiàn)實(shí)距離上最近，而與MS最遠(yuǎn)，因?yàn)镃2的原變種就是GS組中的G152，聚類結(jié)果反應(yīng)了這一現(xiàn)實(shí)。

圖4 白皮松種質(zhì)資源遺傳距離聚類圖Fig.4 Genetic distance cluster figure of germplasm resource of Pinus bungeana

2.4遺傳多樣性評(píng)價(jià)

根據(jù)檢測(cè)到的14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行多樣性統(tǒng)計(jì)分析表明，48個(gè)參試樣品的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s多樣性指數(shù)(Nei’s)的平均值分別為1.230、0.302、0.221、0.189、0.197。根據(jù)趙罕等2012年分析結(jié)果[7]，白皮松種質(zhì)資源收集保存項(xiàng)目中人工栽培群的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s多樣性指數(shù)(Nei’s)的平均值分別為1.2263、0.2466、0.1935、0.1511、0.1487[7]。白皮松天然群體的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s多樣性指數(shù)(Nei’s)的平均值分別為1.3097、0.3127、0.2214、0.1994、0.1963[7]。相比而言，參試樣品的遺傳多樣性參數(shù)略高于人工群體，與白皮松天然群體多樣性水平接近，說明參試樣品具有較高的遺傳多樣性水平和較好的選擇利用的遺傳基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

3.1遺傳多樣性評(píng)價(jià)

SSR是一種靈敏度較高的分子標(biāo)記[3]，也是一種共顯性標(biāo)記，廣泛用于種質(zhì)鑒定甚至親子鑒定，也用于遺傳多樣性評(píng)價(jià)。參試樣品的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s多樣性指數(shù)(Nei’s)的平均值分別為1.230、0.302、0.221、0.189、0.197[7]。參試樣品多樣性水平略高于白皮松人工群體而與白皮松天然群體接近，說明其具有較高的遺傳多樣性水平，具有較好的選擇利用的遺傳基礎(chǔ)。

“盆仙白皮松”、“瑞王白皮松”和“9號(hào)樹”、古樹群組、莽山群組間的遺傳距離分別為0.0211、0.0114、0.0813、0.0638。說明“瑞王白皮松”與“盆仙白皮松”間、“瑞王白皮松”與古樹間存在遺傳上的差異。

3.2白皮松變異類型鑒定的遺傳依據(jù)

同一個(gè)變異類型的2個(gè)無性系及其原株(原變異枝)間在所有位點(diǎn)均不存在差異，說明其無性系及其原株(原變異枝)屬于相同的基因型，“瑞王白皮松”和其母株(古樹152)非變異枝間在SSR — Y5位點(diǎn)上存在差異，“瑞王白皮松”與“盆仙白皮松”在SSR — Y2位點(diǎn)上存在差異。

“瑞王白皮松”、“盆仙白皮松”、“9號(hào)樹”相互之間均存在遺傳差異。該研究的結(jié)論可為今后開展白皮松育種和新品種選育利用提供遺傳背景信息，也可為防止種苗調(diào)撥混淆進(jìn)行苗木早期鑒定提供依據(jù)[11-12]。

3.3白皮松優(yōu)良種質(zhì)資源保護(hù)與利用策略

參試的白皮松優(yōu)良種質(zhì)資源遺傳多樣性水平較高，首先必須對(duì)其進(jìn)行有效保護(hù)，可以建立專門的收集保存圃，進(jìn)行集中保護(hù)，防止其遺傳資源丟失[13-15]；然后開展合理利用，以利用促進(jìn)保護(hù)，但利用過程中要防止對(duì)母樹、原株等的人為破壞。白皮松扦插繁殖生根困難，建議采取嫁接繁殖。今后需進(jìn)一步探索白皮松穗條生根機(jī)理，突破白皮松扦插繁殖瓶頸，促進(jìn)其高效可持續(xù)利用[4]。

“盆仙”白皮松等幾個(gè)白皮松優(yōu)良基因型，是目前在白皮松中發(fā)現(xiàn)的非常罕見的具有重要開發(fā)價(jià)值的變異品種，是開展相關(guān)研究的好材料，而且“盆仙”白皮松已經(jīng)培育了10多年，繼代繁殖了10多年，但是未發(fā)現(xiàn)開花結(jié)實(shí)，沒有頂端優(yōu)勢(shì)，因此，很可能在激素基因水平上的形成通路上出現(xiàn)障礙或變異，建議在加強(qiáng)保護(hù)與合理開發(fā)利用的同時(shí)，開展基因水平的深入探索[8-10]。

[1] Kimura M，Crow J F．The Number of Alleles That Can Be Maintained in a Finite Population[J]．Genetics，1964，49(7)，25-38.

[2] 李義良，趙奮成，張應(yīng)中，等．分子標(biāo)記在松樹遺傳與進(jìn)化研究中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2009，7(5)：1004-1009.

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IdentificationandevaluationofgermplasmresourcesofPinusbungeana

LI Bin1, MENG Qingyang1,2, LI Yanda1,3,DONG Wenpan3,4, ZHENG Yongqi1

(1.State Key Laboratory of Tree Breeding and Forest Genetics / Research Institute of Forestry,Chinese Academy of Forestry ，Beijing 100091, China;2.Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;3.School of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China;4.Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

In this paper, a total of 48 samples including threePinusbungeanavariations “Penxianbungeana”, “Ruiwangbungeana” and “ancient tree No. 9”)with their parent strain, mother trees in certified seed base and listed ancient trees in Beijing were selected to make SSR identification and diversity evaluation through SSR technology. The result showed that: There was no difference between all sites of two clones and their original strains (original variation sticks) of a same variation type, which meant the clones and the original strains (original variation sticks) were of a same genotype. There was a difference between “Ruiwangbungeana” and the non-variation stick of locus Y5its mother plants (ancient tree No. 152), and there was also a difference between “Ruiwangbungeana” and the locus Y2of the “Penxianbungeana”. Differences also appeared between the locus Y2of “Tree No. 9” and “ Fairy BallPinusbungeana”, locus Y5of “Tree No. 9” and “Ruiwangbungeana”, while the locus Y2and locus Y5of “Tree No. 9” were the same as the certified seed base in Mountain Mang, which was their parent group. Three different variation types can be detected through the above loci. The genetic distance between “Penxianbungeana”, “Ruiwangbungeana” and “Tree No. 9”, listed tree group and tree group in Mountain Mang were: 0.0211, 0.0114, 0.0813, 0.0638, respectively. The results further show that there were differences between “Pinusbungeana” and “Penxianbungeana”, the same between “Ruiwangbungeana” and the listed trees. The averages of effective number of alleles (Ne), Shannon's information index (I), observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He) and Nei’s diversity heterozygosity (Nei’s) of the tested numbers were 1.230, 0.302, 0.221, 0.189, 0.197, respectively. Diversity levels slightly higher than artificial groups ofPinusbungeanaand close to natural populations ofPinusbungeana, indicating that the tested sample had a higher level of genetic diversity and a better genetic basis which can be chosen from and used.

Pinusbungeana; germplasm resources; SSR; identification

2016-01-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“白皮松種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)”(31370667)；十二五科技支撐計(jì)劃“林木種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用”(2013BA001B06)。

李 斌(1969-)，男，博士，副研究員，湖南省張家界市人，長期從事林木遺傳資源收集、保存、整理、評(píng)價(jià)和利用研究。

鄭勇奇。

S 791.243

A

1003 — 5710(2016)02 — 0001 — 07

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 02. 001

(文字編校：唐效蓉)