曾慧杰， 王曉明， 李永欣， 蔡 能， 喬中全， 許 歡

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.湖南省林木無性系育種重點實驗室， 湖南 長沙 410004)

不育紫薇花粉活力及柱頭可授性研究

曾慧杰1,2， 王曉明1,2， 李永欣1,2， 蔡 能1,2， 喬中全1,2， 許 歡1

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.湖南省林木無性系育種重點實驗室， 湖南 長沙 410004)

以4年生“不育紫薇”和普通“可育紫薇”為研究對象，進行雜交育性分析，并利用液體培養(yǎng)法和熒光顯微技術(shù)測定了兩個紫薇品種的花粉活力和柱頭可授性。結(jié)果表明：“不育紫薇”的花藥表面較光滑濕潤，難以釋放花粉；花粉?；?，不能萌發(fā)，沒有生活力；雌蕊的柱頭對正常成熟的花粉有親和力，具有可授性，但結(jié)實率僅4.0%?！安挥限薄钡牟挥誀钣尚坌圆挥痛菩圆挥餐饔盟?。

紫薇； 不育； 花粉活力； 柱頭可授性

紫薇(Lagerstroemiaindica)為千屈菜科紫薇屬落葉灌木或小喬木，具有樹姿優(yōu)美、花期長、花色豐富等特點，是我國重要的夏季園林觀花樹種[1-4]。普通“可育紫薇”在花期會形成大量果實，消耗過多營養(yǎng)，影響后期花蕾的形成和生長，降低觀賞價值。湖南省林業(yè)科學(xué)院培育出一種只開花、不結(jié)果的“不育紫薇”品種，其無果實生長過程，具有花期長、花色艷、花量大的特點?！安挥限薄逼贩N是極其珍稀的紫薇基因資源，開展其不育機理的研究具有重要意義。

本研究以4年生“不育紫薇”和普通“可育紫薇”為材料，通過雜交育種，對“不育紫薇”進行育性分析。利用液體培養(yǎng)法檢測其花粉活力，運用熒光顯微技術(shù)測定柱頭的可授性，旨在探尋“不育紫薇”不結(jié)實的原因，為系統(tǒng)闡明其不育機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1 試驗材料 湖南省林業(yè)科學(xué)院苗圃內(nèi)4年生“不育紫薇”和“可育紫薇”。

1.1.2 試劑與儀器 OlympusBX51熒光顯微鏡、數(shù)碼照相機、光學(xué)顯微鏡、電子天平、游標卡尺、冰箱、帶凹槽培養(yǎng)皿、尖頭鑷子等。

H3BO3、CaCl2、苯胺藍、蔗糖、蒸餾水；FAA固定液；脫色苯胺藍染色液。

1.2試驗方法

1.2.1 雜交育性研究

(1)雜交組合。將“不育紫薇”與“可育紫薇”分別自交和交叉雜交，形成“不育紫薇♂×不育紫薇♀”、“可育紫薇♂×可育紫薇♀”、“不育紫薇♂×可育紫薇♀”、“可育紫薇♂×不育紫薇♀”四個組合，分別統(tǒng)計雜交結(jié)實率。

(2) 雜交步驟。紫薇花蕾逐漸展開時間為早上05:30-07:00[5]。從05:30開始，選擇將要開放的花蕾，去除花瓣和雄蕊，套袋；約07:30，柱頭出現(xiàn)粘液，花藥出現(xiàn)粉狀顆粒，進行人工授粉，套袋保護。

1.2.2 花粉活力檢測

(1) 培養(yǎng)液配制。設(shè)計不同蔗糖濃度(100、200、300 g/L)、不同硼酸濃度(30、80、150 mg/L)及不同氯化鈣濃度(10、20、30 mg/L)的培養(yǎng)液[6]，開展L9(34)正交試驗。

(2) 花藥采集。上午07:00，采集兩個品種紫薇的長花藥[7]，室溫下放置，備用。

(3)花粉培養(yǎng)。將培養(yǎng)液分別加入帶凹槽的培養(yǎng)皿，將當天采集的花藥分別加入到各培養(yǎng)皿中，攪拌釋放花粉，去除花藥，蓋上蓋玻片，室溫下培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。

(4)花粉萌發(fā)。培養(yǎng)12 h后，用顯微鏡觀察花粉粒形態(tài)以及萌發(fā)狀況，計算萌發(fā)率，比較兩個品種的花粉活力差異。

1.2.3 柱頭可授性研究

(1) 授粉。早上05:30左右，將兩個紫薇品種即將開放的花蕾去雄，套袋；約07:30，待花藥開始散粉時，采集正常成熟的花粉，分別給“不育紫薇”和“可育紫薇”進行授粉，套袋保護。

(2) 固定。授粉4 h、8 h、12 h、24 h后，分別采集兩個品種紫薇的雌蕊，每個時期采5朵花，用FAA固定液室溫下固定24 h。

(3) 染色。將固定好的材料逐級復(fù)水，適當加熱軟化，然后放入脫色苯胺藍染色液中，染色6 h。

(4) 觀察。取出染色材料，流水沖洗，置載玻片上，用鑷子撕去子房外壁和花柱外表皮，滴加45%中性甘油，蓋片，壓片，用OlympusBX51顯微鏡進行熒光(356 nm)觀察[8-9]，比較成熟花粉在“可育紫薇”和“不育紫薇”柱頭上的萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1紫薇雜交育性分析

從雜交結(jié)果來看(見表1)，“可育紫薇”自交育性很強，結(jié)實率高達96.0%。“不育紫薇”自交不能結(jié)實，其花粉授在“可育紫薇”的柱頭上，也不能正常萌發(fā)，由此推測“不育紫薇”可能存在花粉敗育或授粉不親和的問題。同時，將“可育紫薇”的花粉授給“不育紫薇”時，結(jié)實率也極低，僅4.0%，其原因或許是“不育紫薇”雌蕊的發(fā)育也出現(xiàn)了異常。以上問題，須通過檢測花粉活力及顯微切片分析，進一步探尋原因所在。

表1 紫薇雜交結(jié)實率Tab.1 SeedsettingrateofhybridizationinLagerstroemiaindica雜交組合授粉朵數(shù)結(jié)實數(shù)結(jié)實率(%)不育紫薇♂×不育紫薇♀5000.0可育紫薇♂×可育紫薇♀504896.0不育紫薇♂×可育紫薇♀5000.0可育紫薇♂×不育紫薇♀5024.0

2.2花粉活力檢測

“可育紫薇”與“不育紫薇”花藥的顯微觀察結(jié)果表明(見圖1)，“可育紫薇”的花藥較干燥，表面粗糙厚實，花粉呈黃色顆粒狀，數(shù)量多；而“不育紫薇”的花藥較濕潤，表面光滑扁平，未開裂，無黃色顆粒狀花粉?；ㄋ幟撍_裂的過程是一個復(fù)雜的生理生化過程[10-13]，這可能是花藥纖維層細胞結(jié)構(gòu)異常，花藥沒有因失水而開裂，致使花粉粒難以釋放。

花粉培養(yǎng)的正交試驗結(jié)果表明(見表2)，在不同培養(yǎng)液下，“可育紫薇”花粉的萌發(fā)率有較大差異，從9.1%～56.8%。花粉培養(yǎng)液的三種主要成分蔗糖、硼酸和氯化鈣對其萌發(fā)率影響的極差分別為24.7、21.9和1.0，表明蔗糖濃度和硼酸濃度對紫薇花粉的萌發(fā)有更大影響。而“不育紫薇”的花粉在不同培養(yǎng)液條件下都不萌發(fā)，與雜交育性分析的結(jié)果一致。

(a) 不育紫薇

(b) 可育紫薇

Fig.1AnthershapeofsterileandfertileLagerstroemiaindica

表2 花粉培養(yǎng)L9(34)正交試驗結(jié)果Tab.2 TheresultoforthogonaltestofL9(34)試驗處理ABC萌發(fā)率蔗糖濃度(g/L)硼酸濃度(mg/L)氯化鈣濃度(mg/L)可育紫薇(%)不育紫薇(%)Y1100301022.20Y2100802029.20Y31001503045.70Y4200302034.00Y5200803036.40Y62001501056.80Y730030309.10Y8300801015.30Y93001502028.60k132.421.831.4k242.427.030.6k317.743.730.4極差24.721.91.0主優(yōu)順序A>B>C優(yōu)組合A2B3C1 注:ki為同一水平萌發(fā)率平均值,i為正交試驗因素的水平號

在液體培養(yǎng)下“可育紫薇”與“不育紫薇”的花粉呈現(xiàn)不同的形態(tài)(見圖2)。“可育紫薇”花粉粒大多呈現(xiàn)圓球形，萌發(fā)有花粉管；而“不育紫薇”花粉粒呈不規(guī)則形狀，為錐形、四面體形或為紡錘形。這也直觀的證明“不育紫薇”花粉?；危⑶也荒苊劝l(fā)，沒有生活力。

(a) 不育紫薇

(b) 可育紫薇

Fig.2PollenshapeofsterileandfertileLagerstroemiaindica

2.3柱頭可授性研究

將可育紫薇的花粉授予到兩種紫薇的柱頭上，顯微切片后熒光觀察顯示：授粉4 h后，花粉粒在兩種紫薇的柱頭上均能萌發(fā)；8 h后，花粉管已穿過柱頭，延伸入花柱內(nèi)部；12 h后，花粉管都能夠達到子房中上部(見圖3)；24 h后，花粉管到達子房下部。這表明“不育紫薇”的柱頭與“可育紫薇”的柱頭一樣，都對正常成熟的花粉具有親和力，花粉粒能正常萌發(fā)，花粉管可生長至子房內(nèi)。但雜交育性的試驗結(jié)果又表明，“可育紫薇♂×不育紫薇♀”組合的雜交結(jié)實率僅4.0%。之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，綜上分析認為：“不育紫薇”的柱頭在授粉后的發(fā)育過程中，柱頭的可授性雖然正常，花粉管能深入子房，但可能存在兩種紫薇雌雄配子異交不親和，或者受精合子的發(fā)育過程存在障礙，致使果實不能正常形成，結(jié)實率極低。

圖3 花粉在兩個品種紫薇柱頭的萌發(fā)

3 結(jié)論與討論

本研究通過雜交分析了“不育紫薇”的育性，利用液體培養(yǎng)法檢測了其花粉生活力，運用熒光顯微技術(shù)測定了其柱頭可授性。綜合分析可知，“不育紫薇”的不育性狀由“雄性不育”和“雌性不育”共同作用所致：

(1) “不育紫薇”的雄性不育。表現(xiàn)為花藥不開裂和花粉敗育： ① 花藥不開裂可能是由于花藥壁組織脫水異常引起，花藥寬而扁平，表面光滑濕潤，花藥沒有因失水而開裂，致使花粉粒難以散出； ②花粉敗育表現(xiàn)為花粉粒呈現(xiàn)畸形，為不規(guī)則形狀，如錐形、四面體形或紡錘形，不能萌發(fā)，無生活力。

(2) “不育紫薇”的雌性不育。其原因暫無法確定，從外部形態(tài)看來，不育紫薇的柱頭和子房的形態(tài)正常，柱頭具有可授性，授以正常成熟的花粉可以萌發(fā)花粉管進入子房內(nèi)部，但不能正常結(jié)實。原因可能包括：“可育紫薇”的精細胞與“不育紫薇”的卵細胞存在異交不親和[14]；或“不育紫薇”受精后自身基因調(diào)控異常、生理生化過程異常所致；或者“不育紫薇”子房形成后，胚囊發(fā)育異常所致[15-16]。

下一步要圍繞花粉敗育、合子的發(fā)育等問題，深入開展形態(tài)解剖學(xué)、生理生化學(xué)以及分子生物學(xué)研究，以期能系統(tǒng)闡明“不育紫薇”的不育機理，為紫薇乃至木本花木遺傳育種提供有益借鑒。

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PollenviabilityandstigmareceptivityofthesterileLagerstroemiaindica

ZENG Huijie1,2, WANG Xiaoming1,2, LI Yongxin1,2, CAI Neng1,2, QIAO Zhongquan1,2， XU Huan1

(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China; 2.Hunan Key Lab of Trees Clones Breeding Technology, Changsha 410004, China)

Using 4-year-old sterile and fertileLagerstroemiaindicaas the research materials, their seed setting rates were analyzed through hybridization method, and pollen viability were detected by liquid cultivation, stigma receptivity were measured by fluorescent microscopic technology. The results showed that, sterileLagerstroemiaindica’s anthers couldn’t release pollens and these pollens were aborted. Stigma receptivity was normal, but the seed setting rate was only 4.0%.Sterile character caused by the combination of male sterility and female infertility.

Lagerstroemiaindica; sterile; pollen viability; stigma receptivity

2016-07-31

湖南省科技計劃重點項目(2014FJ2016)。

曾慧杰(1977-)，男，湖南省長沙市人，副研究員，主要從事林木遺傳育種研究。

S 685.99

A

1003-5710(2016)05-0057-05

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2016. 05. 011

(文字編校：張 珉)