張徐非，候利娟，邱恒清，黃路生，郭源梅

（1溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，浙江溫州 325000；2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330045）

位置功能候選基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160與豬肢蹄結(jié)實度的關(guān)聯(lián)性

張徐非1，2，候利娟2，邱恒清2，黃路生2，郭源梅2

（1溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，浙江溫州 325000；2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330045）

【目的】建立一種通過內(nèi)在的四肢骨關(guān)節(jié)評分來評估豬肢蹄結(jié)實度的方法，并計算關(guān)節(jié)評分與表觀評估的肢蹄結(jié)實度之間的相關(guān)系數(shù)。此外，在F2、萊蕪、二花臉、蘇太和杜長大5個豬群中，研究三個位置功能候選基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160與豬肢蹄結(jié)實度之間的關(guān)聯(lián)性?！痉椒ā扛鶕?jù)關(guān)節(jié)面裂痕的大小和深淺以及損傷的嚴重程度，對5塊四肢骨的關(guān)節(jié)進行評分（1—5分）。如果關(guān)節(jié)面裂痕很大且很深，或損傷很嚴重，則評為1分；如果關(guān)節(jié)面沒有裂痕和損傷，則評為5分。評分越高，說明關(guān)節(jié)越健康，肢蹄越結(jié)實。此外，基于筆者前期全基因組關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，在豬7號染色體最強關(guān)聯(lián)SNP兩側(cè)翼各0.2 Mb的區(qū)域內(nèi)，篩選出HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160三個位置功能候選基因。在F2群體中，通過基因測序，搜尋這3個基因的多態(tài)位點，并根據(jù)多態(tài)位點在6個物種間的保守性，篩選出11個多態(tài)位點。利用Taqman探針，對3個HMGA1位點和3個C6orf106位點進行基因分型，而另一個基因的5個多態(tài)位點則通過基因型填補（genotype imputation）方法進行基因分型。最后，利用R軟件GenABEL程序包，分析最小等位基因頻率（MAF）大于0.05的多態(tài)位點與肢蹄結(jié)實度之間的關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)果】在C6orf106和ENSSSCG00000023160基因中，分別鑒別到174和5個多態(tài)位點。關(guān)節(jié)評分之間呈顯著的正相關(guān)，絕大部關(guān)節(jié)評分與蹄趾、肢蹄和步態(tài)評分之間無相關(guān)，而與肱二頭肌長度和重量呈顯著的負相關(guān)。公豬的肩胛骨關(guān)節(jié)評分極顯著低于母豬的評分，但是臂骨肩關(guān)節(jié)和后肢跗關(guān)節(jié)評分顯著高于母豬相應(yīng)的關(guān)節(jié)評分。在F2群體中，3個候選基因均與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)，但是ENSSSCG00000023160的關(guān)聯(lián)程度不如另外2個基因強，可以排除它為肢蹄結(jié)實度的因果基因。因此，該基因沒有在其余的4個群體中進行檢測。在二花臉群體中，HMGA1的g.2029C＞T和g.3155A＞G位點均與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)，另一個位點的MAF小于0.05。在其它3個群體中，HMGA1 3個位點的MAF都小于0.05。在萊蕪群體中，僅C6orf106的g.6953T＞C位點的MAF大于0.05，該位點與肢蹄結(jié)實度顯著關(guān)聯(lián)。在蘇太和杜長大群體中，C6orf106的g.2054T＞C和g.6953T＞C位點的MAF大于0.05，但它們與肢蹄結(jié)實度性狀之間無顯著關(guān)聯(lián)?！窘Y(jié)論】建立了一套利用四肢骨關(guān)節(jié)評分來評估肢蹄結(jié)實度的方法，該方法是對現(xiàn)有的表觀評估方法的重要補充。因為蹄趾、肢蹄和步態(tài)評分與關(guān)節(jié)評分無相關(guān)，所以它們不能取代關(guān)節(jié)評分。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果排除了ENSSSCG00000023160是肢蹄結(jié)實度因果基因，但沒有排除HMGA1和C6orf106的可能性，因此，有必要對這2個基因進行更深入的研究。

豬；肢蹄結(jié)實度；關(guān)節(jié)評分；關(guān)聯(lián)分析；基因型填補

0 引言

【研究意義】肢蹄結(jié)實度反映豬前后肢蹄的結(jié)實程度，一般通過外在的肢蹄評分和步態(tài)評分來度量［1］。不結(jié)實的肢蹄是一種病，稱為肢蹄軟弱（leg weakness）。豬肢蹄軟弱發(fā)病率高，病因復(fù)雜，且難以治愈，導(dǎo)致大量種豬和生產(chǎn)母豬被動淘汰。據(jù)報道：在通過了生產(chǎn)性能測定的后備公豬中，有20%—50%的后備公豬因肢蹄軟弱而被淘汰［2-3］；在生產(chǎn)母豬中，也有6.1%—15%的母豬因肢蹄軟弱而被淘汰［4］。肢蹄結(jié)實度作為一個復(fù)雜性狀，它受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。豬肢蹄結(jié)實度具有中等遺傳力，其遺傳力為0.1—0.5［3，5-7］。ROTHSCHILD等在一個杜洛克群體中對肢蹄結(jié)實度進行5個世代的歧化選擇后，正向選擇群體的肢蹄結(jié)實度顯著高于反向選擇群體［7］。因此，對肢蹄結(jié)實度的遺傳解析可以為它的遺傳改良奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】利用全基組連鎖分析，定位了很多肢蹄結(jié)實度的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus， QTL）；通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewide association analysis，GWAS），鑒別了一些與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)的單核苷多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）。在豬的QTL數(shù)據(jù)庫中，一共收錄了278個控制肢蹄結(jié)實度的QTL或與之關(guān)聯(lián)的SNP［8］。本研究小組在白色杜洛克×二花臉的F2資源家系中，利用183個微衛(wèi)星標(biāo)記，通過全基因組掃描，一共定位到42個影響肢蹄結(jié)實度的QTL，其中7號染色體SW1856—S0102區(qū)間內(nèi)的QTL效應(yīng)最大、置信區(qū)間最?。ㄖ挥? cM）［9］。利用Illumina公司豬60K SNP芯片，在該F2資源群體和蘇太群體中，通過GWAS，將影響前后肢步態(tài)評分的基因位點定位在7號染色體上一個2.15 Mb的連鎖不平衡框內(nèi)，其最強關(guān)聯(lián)的SNP為35.18 Mb的MARC0033464［10］?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對肢蹄結(jié)實度的測定僅停留在外觀上，缺乏一種內(nèi)在的評估方法。另外，7號染色體最強關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的基因與肢蹄結(jié)實之間度的關(guān)聯(lián)也沒有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】建立一種通過內(nèi)在的關(guān)節(jié)評分來度量肢蹄結(jié)實度的方法，并與現(xiàn)有方法作比較，評估該方法的必要性。另外，在7號染色體最強關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)篩選3個位置功能候選基因，并對其多態(tài)位點進行搜尋，然后在每個候選基因中篩選3個保守的多態(tài)位點，在F2、蘇太、萊蕪、二花臉和杜長大5個群體中進行關(guān)聯(lián)分析，尋找與肢蹄結(jié)實度顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點，為肢蹄結(jié)實度的標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗群體 本研究一共用了5個試驗豬群，即F2資源群體、蘇太豬、二花臉、萊蕪豬和杜長大群體。F2資源群體以2頭白色杜洛克公豬和17頭二花臉母豬為親本，雜交產(chǎn)生F2代［11］。蘇太豬是杜洛克公豬和太湖母豬雜交，經(jīng)19個世代對繁殖和生長性狀的選育，培育而成的母系品種［10］。331頭二花臉和314頭萊蕪豬分別購自江蘇省焦西二花臉合作社和山東省萊蕪原種豬場。在4—5月齡從購買豬場運至江西省南昌市國鴻生態(tài)園豬場進行肥育。二花臉公母豬均進行了閹割，萊蕪豬只對公豬進行閹割。這4個群體在肥育期間均飼喂含3 100 kJ可消化能、16%粗蛋白和0.78%賴氨酸的全價配合飼料，自由采食和飲水，且采用相同的飼養(yǎng)管理方式，自由采食和飲水。F2資源群體和蘇太豬在240日齡左右屠宰，二花臉和萊蕪豬在300日齡左右屠宰。610頭杜長大來自江西國鴻集團修水商品豬場。公豬在出生時閹割，母豬不閹割。分階段飼喂相應(yīng)的配合飼料，自由采食和飲水，體重在110 kg左右屠宰。

1.1.2 表型測定 各個表型的測定，分別由同一人根據(jù)相同的標(biāo)準(zhǔn)在江西省南昌市進行測定。肢蹄評分和步態(tài)評分采用GUO等建立的方法在飼養(yǎng)場地進行測定［9］。在F2資源群體（2002—2006年）和蘇太豬（2010—2011年）和萊蕪豬（2012—2014年）群體中，肢蹄評分和步態(tài)評分都在220日齡左右進行測定，萊蕪豬（2012—2014年）群體在300日齡左右進行評定。屠宰后，前后蹄從屠體上分割下來，根據(jù)蹄子的大小、均勻度、受損程度等進行評分。蹄子大、均勻且沒有損傷評5分；蹄子很小、非常不均勻或損傷嚴重評1分。左側(cè)的肱二頭肌完整地從前肢剝離下來，用電子天平和游標(biāo)卡尺分別測定其重量和長度。前后肢四肢骨的主要關(guān)節(jié)面，根據(jù)表1的評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分。

表1 豬關(guān)節(jié)面評分標(biāo)準(zhǔn)Table1 The criteria for joint surface score

1.1.3 基因DNA的提取 個體屠宰后，用剪刀剪取適量的耳組織或脾臟，貯存于裝有75%的酒精溶液的EP管中備用。采用常規(guī)酚氯仿法從耳組織或脾臟中提取基因組DNA，經(jīng)質(zhì)量檢測和濃度測定后稀釋成50 ng·μL-1的工作液備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 位置功能候選基因的篩選及其SNP的搜尋在7號染色體上，以最強關(guān)聯(lián)SNP為中心的0.4 Mb范圍內(nèi)一共有6個基因。HMGA1編碼一種影響軟骨細胞生長和分化的非組蛋白［12］；C6orf06基因可能與骨骼生長相關(guān)，因為在C6orf06和HMGA1區(qū)域內(nèi)鑒別到與人類身高顯著關(guān)聯(lián)的SNP［13-15］；ENSSSCG00000023160的功能未知；這3個基因可能會影響肢蹄結(jié)實度，因此把它們作為肢蹄結(jié)實度的候選基因。RPS10編碼一種核糖體蛋白S10，與人的先天性純紅細胞再生障礙性貧血關(guān)聯(lián)［16］；SPDEF編碼上皮特異性ETs轉(zhuǎn)錄因子，與小腸杯狀細胞的分化和成熟有關(guān)［17］；PACSIN1編碼神經(jīng)元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物1，調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的延伸和分支［18］；這3個基因的功能均與肢蹄結(jié)實度不相關(guān)，因此可以排除。

從Ensembl網(wǎng)站上（http://www.ensembl.org/index. html）獲取豬HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160 3個候選基因的基因組序列。根據(jù)其基因組序列，使用在線引物設(shè)計軟件Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）分別設(shè)計16、50和5對引物對這3個基因的多態(tài)位點進行搜尋。

HMGA1和C6orf106 SNP基因多態(tài)位點搜尋的模板為3頭F1公豬（耳號分別為17、29和41號）組成的DNA池。ENSSSCG00000023160則對所有的F0代個體單獨進行測序，搜尋多態(tài)位點。PCR擴增后產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的有效性，合格的DNA樣品經(jīng)QIAquick DNA純化試劑盒純化后，送上海生工進行雙向測序，獲得所需序列。用DNAStar軟件包的Seqman程序進行序列分析，鑒別多態(tài)位點。

1.2.2 多態(tài)位點的篩選及基因型判定 用Clustal W軟件，選取豬、狗、奶牛、人、鼠和兔子6種哺乳動物DNA序列，對C6orf106進行保守性分析［19］。選取3個在這6種動物間保守且具有代表性的SNP用于基因判型，并利用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進行酶切驗證其多態(tài)性。設(shè)計3對探針和引物，使用7900HT Fast Real-time PCR System分別對g.2054T＞C、g.6953T＞C和g34542A＞T進行基因分型［20］。

沈虎群對HMGA1進行測序，搜尋到9個SNP，并在F2資源群體中對其中的g.1149C＞T、g.2029C＞T和g.3155A＞G進行基因型檢測［21］。在F2資源群體中，本研究直接使用他的分型結(jié)果。在另外的4個群體中，對這3個位點進行基因分型。

ENSSSCG00000023160基因采用基因型填補法（genotype imputation）來獲取F2個體所有多態(tài)位點的基因型［22］。首先對全部的F0代和F1代個體的測序，獲取F0和F1代個體該基因所有多態(tài)位點的基因型。然后在該基因兩側(cè)翼臨近區(qū)域內(nèi)選取15個多態(tài)性好的60K SNP芯片上的SNP位點（F0、F1和F2個體的基因型都已知），與該基因的基因型進行整合（F2代個體的基因型均為缺失），利用SimWalk2.9軟件，構(gòu)建所有個體的單倍型［23］。最后根據(jù)個體的單倍型來重建 F2個體的基因型。為了評估基因型填補法的準(zhǔn)確性，在60K SNP芯片中，選取5個位于該基因兩側(cè)翼、且F0和F1代個體的基因型分別與該基因5個多態(tài)位點相類似的SNP，保留F0和F1代個體的基因型，把F2個體的基因型設(shè)為缺失，通過上述方法獲取F2個體的基因。芯片檢測的基因型和基因填補獲得的基因型之間吻合度可以用來評估基因填補的準(zhǔn)確性。吻合度越高，基因型填補法獲取的基因型就越準(zhǔn)確。

1.3 統(tǒng)計分析方法

1.3.1 表型相關(guān)及性別差異檢驗 表型簡單統(tǒng)計量的計算及性別差異檢驗都在統(tǒng)計軟件SAS9.0（SAS Institute Inc.， Cary， NC， USA）上完成的。CORR過程用于計算表型之間的簡單相關(guān)系數(shù)；TTEST過程檢驗表型在性別之間的差異。

1.3.2 關(guān)聯(lián)分析 利用R軟件中的GenABEL軟件包，使用下面模型對肢蹄結(jié)實度相關(guān)性狀進行關(guān)聯(lián)分析［24］：

其中，y是表型向量；b是固定效應(yīng)向量，包括性別和批次，分析肱二頭肌長度和重量是還包括胴體重；u是加性遺傳效應(yīng)向量，服從N（0， G σ2α），G為基因組親緣關(guān)系矩陣，利用豬60K芯片常染色體上SNP的計算得到［25-26］；σ2α為加性方差；a為SNP等位基因的替代效應(yīng)；X和Z分別為b和u的指示矩陣；s是a的指示向量；e是殘差向量，服從N（0， Iσ2e）。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)位點搜尋

設(shè)計了50對引物對C6orf106進行全基因多態(tài)位點的搜尋，一共搜尋到多態(tài)位點個SNP［20］。用Clustal W軟件對這174個多態(tài)位點進行保守性分析，有9個SNP在豬、狗、奶牛、人、鼠和兔子中是保守的［20］。從這9個保守的SNP中，選取3個具有代表的SNP，即g.2054T＞C、g.6953T＞C和g34542A＞T，在這5個群體進行基因分型。

設(shè)計了5對引物對ENSSSCG00000023160進行全基因多態(tài)位點的搜尋，一共搜尋得到5個多態(tài)位點，即g.1129G＞C、g.2284C＞G、g.2430C＞T、g.2813G＞A和g.3231AA＞--。利用基因填補法獲取F2資源群體中F2個體的基因型。根據(jù)兩側(cè)翼5個SNP的基因填補的模擬結(jié)果，基因填補的錯誤率分別為2.73%、0、0.2%、1.0%和0.4%。

表2 性狀之間的表型相關(guān)系數(shù)Table2 The phenotypic correlation coefficients among the measured traits

2.2 多態(tài)位點判型

在資源家系F2群體中，3個候選基因的11個多態(tài)位點的最小等位基因頻率（MAF）均大于0.3。在其余4個群體中，只對C6orf106和HMGA1的6個多態(tài)位點進行了分型。在蘇太和杜長大群體中，只有C6orf106前2個位點的MAF大于0.05；在二花臉群體中，只有HMGA1后2個位點的MAF大于0.05；在萊蕪豬群體中，只有C6orf106第2個位點的MAF大于0.05。MAF大于0.05的位點用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

2.3 表型相關(guān)分析

在萊蕪、二花臉和杜長大混合群體中，表型之間的簡單相關(guān)系數(shù)見表2。肱二頭肌長度和重量與前后蹄和前后肢肢蹄評分之間呈極顯著正相關(guān)，而與關(guān)節(jié)評分之間呈顯著負相關(guān)（除肱二頭肌重量和前臂骨腕關(guān)節(jié)評分不顯著之外）。肱二頭肌長度與前肢步態(tài)評分呈顯著負相關(guān)，與后肢步態(tài)評分不相關(guān)。肱二頭肌重量與前肢步態(tài)評分不相關(guān)，與后肢步態(tài)評分呈顯著正相關(guān)。前蹄評分除了與肱二頭肌長度和重量以及后蹄評分呈正相關(guān)外，還與臂骨肩關(guān)節(jié)、前臂骨肘關(guān)節(jié)、前臂骨腕關(guān)節(jié)和股骨髖關(guān)節(jié)評分呈負相關(guān)，與其他性狀不相關(guān)。后蹄評分除了與肱二頭肌長度和重量以及前蹄評分呈正相關(guān)外，還與肩胛骨關(guān)節(jié)和臂骨肘關(guān)節(jié)評分呈顯著的負相關(guān)，與肢蹄評分和步態(tài)評分呈顯著正相關(guān)，與其他性狀不相關(guān)。關(guān)節(jié)評分之間呈顯著正相關(guān)（除肩胛骨關(guān)節(jié)與前臂骨肘關(guān)節(jié)評分以及前臂骨腕關(guān)節(jié)與肩胛骨關(guān)節(jié)、臂骨肘關(guān)節(jié)和小腿骨跗關(guān)節(jié)評分之間無相關(guān)外），與肢蹄和步態(tài)評分之間無相關(guān)（除股骨膝關(guān)節(jié)評分與前肢肢蹄和步態(tài)評分呈正相關(guān)、前臂骨腕關(guān)節(jié)評分與后肢肢蹄和步態(tài)評分呈負相關(guān)以及臂骨肩關(guān)節(jié)評分和前肢步態(tài)評分呈正相關(guān)外）。肢蹄與步態(tài)之間呈極顯著的正相關(guān)。后肢跗關(guān)節(jié)評分只在杜長大群體中進行了測量，它與前蹄評分（r= 0.0172，P= 0.6726）和后蹄評分（r= 0.0612，P= 0.1322）之間無相關(guān)。

2.4 性別差異檢驗

性別對表型的影響見表3。公豬的肩胛骨關(guān)節(jié)評分極顯著低于母豬的肩胛骨關(guān)節(jié)評分，但是臂骨肩關(guān)節(jié)和后肢跗關(guān)節(jié)評分顯著高于母豬的相應(yīng)關(guān)節(jié)的評分，其余性狀在性別之間沒有顯著差異。

表3 不同性別對肢蹄結(jié)實度的影響Table3 The effects of sexes on the measured traits

2.5 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

在F2資源群體中，11個多態(tài)位點與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4。HMGA1基因的g.2029C＞T和g.3155A＞G位點與肱二頭肌長度和重量、肢蹄評分和步態(tài)評分6個性狀均顯著關(guān)聯(lián)，而g.1149C＞T位點與肢蹄評分和前肢步態(tài)評分顯著關(guān)聯(lián)，與另外3個性狀不關(guān)聯(lián)。C6orf106基因的g.34542A＞T位點與6個性狀均顯著關(guān)聯(lián)，而另外2個位點與步態(tài)評分和前肢肢蹄評分顯著關(guān)聯(lián)，與另外3個性狀不關(guān)聯(lián)。ENSSSCG00000023160基因不與肱二頭肌重量關(guān)聯(lián)。在剩下的5個性狀中，g.2430C＞T和g.3231AA＞--位點與它們顯著關(guān)聯(lián)，g.2284C＞G和g.1129G＞C位點分別與除前肢肢蹄評分和肱二頭肌長度之外的4個性狀顯著關(guān)聯(lián)，而另一個位點不與任何性狀關(guān)聯(lián)。在這11個多態(tài)位點中，HMGA1的g.3155A＞G與前肢步態(tài)評分的關(guān)聯(lián)程度最強。

表4 F2資源群體中11個多態(tài)位點與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)分析Table4 The association analysis results between 11 loci and leg soundness in the F2population

在其余4個群體中，HMGA1和C6orf106與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。在萊蕪群體中，只有C6orf106的g.6953T＞C位點的MAF大于0.05。該位點與臂骨肩關(guān)節(jié)、股骨膝關(guān)節(jié)、后肢步態(tài)和前臂骨肘關(guān)節(jié)評分顯著關(guān)聯(lián)，與其余性狀之間不關(guān)聯(lián)。在二花臉群體中，只有HMGA1的g.2029C＞T和g.3155A＞G位點的MAF大于0.05。前者與股骨髖關(guān)節(jié)評分極顯著關(guān)聯(lián)，后者與股骨髖關(guān)節(jié)和臂骨肘關(guān)節(jié)評分極顯著關(guān)聯(lián)，與其余性狀不關(guān)聯(lián)。在蘇太和杜長大群體中，只有C6orf106的g.2054T＞C和g.6953T＞C位點的MAF大于0.05，但它們均與肢蹄結(jié)實度性狀之間不關(guān)聯(lián)。

3 討論

本研究一共使用了5個試驗豬群。選擇了F2群體是因為7號染色體上的QTL是在F2資源群體中鑒別到的。因此，只有在這群體中顯著關(guān)聯(lián)的位點，才有可能是因果突變位點。蘇太豬與F2資源群體有相似的來源，他們的祖代都是杜洛克和二花臉。但是蘇太豬經(jīng)歷了18個世代的重組，連鎖不平衡區(qū)域會顯著的小于F2群體，因此選擇這個群體有利于區(qū)分因果位點和連鎖不平衡位點。二花臉是F2資源群體的祖代之一，使用這個品種有利于了解這個QTL的起源。萊蕪豬是中國著名地方品種之一，對萊蕪豬肢蹄結(jié)實度的研究，有利于該地方品種的開發(fā)和利用。杜長大是目前中國商品豬生產(chǎn)的主要雜交模式，在杜長大群體中開展肢蹄結(jié)實度的研究，可以為商品豬肢蹄結(jié)實度的分子育種奠定基礎(chǔ)。

群體對肢蹄結(jié)實度的影響是極顯著的（數(shù)據(jù)沒有展示）。杜長大群體的蹄趾評分顯著高于兩個地方品種，二花臉的前蹄趾評分比萊蕪豬的要高，但是后蹄趾評分比萊蕪豬要低。蘇太豬的前后肢的肢蹄評分和步態(tài)評分均極顯著高于萊蕪豬?？傮w來說二花臉的關(guān)節(jié)評分比萊蕪豬要高，如肩胛骨關(guān)節(jié)評分、臂骨肘關(guān)節(jié)評分、股骨膝關(guān)節(jié)評分和小腿骨跗關(guān)節(jié)評分，但萊蕪豬的前臂骨腕關(guān)節(jié)評分比二花臉的高。

DRAPER等報道在肢蹄軟弱品系中，肱二頭肌的長度和重量顯著大于肢蹄正常和結(jié)實的品系［27］。在F2群體中，前肢步態(tài)評分與肱二頭肌的長度和重量呈顯著的負相關(guān)，而肢蹄評分與它們呈顯著正相關(guān)［9］。在蘇太群體中，肱二頭肌的長度和重量與步態(tài)和肢蹄評分不相關(guān)［10］。在萊蕪、二花臉和杜長大混合群體中，前肢步態(tài)評分與肱二頭肌長度呈顯著的負相關(guān)，這重復(fù)了前人的結(jié)果。外觀的蹄趾、肢蹄和步態(tài)評分與關(guān)節(jié)評分之間不相關(guān)，因此，它們不能替代關(guān)節(jié)評分。

表5 HMGA1和C6orf106 的4個SNP與肢蹄結(jié)實度關(guān)聯(lián)分析Table5 The association analysis results between 4 SNPs of HMGA1 and C6orf106 and leg soundness

在F2群體和蘇太群體中，母豬的肢蹄結(jié)實度高于公豬［10］。在萊蕪、二花臉和杜長大混合群體中，公豬的肢蹄和步態(tài)評分以及肱二頭肌長度顯著小于母豬的，但是都沒有達到顯著水平，這和前人的結(jié)果相似［10］。

在F2群體中，ENSSSCG00000023160 的g.2284C＞G、g.2430C＞T和g.3231AA＞--與前肢步態(tài)評分相關(guān)聯(lián)，但關(guān)聯(lián)顯著水平不如HMGA1的兩個位點（表4）。其余位點在不同群體中與肢蹄軟弱的表型性狀關(guān)聯(lián)性不強，未達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平。雖然基因填補存在一定的錯誤，導(dǎo)致檢測效率的下降，但是模擬結(jié)果顯示錯誤在3%以下（與前人的結(jié)果類似［22］），對關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果影響不會很大。基于上述結(jié)果，可以排除該基因為肢蹄結(jié)實度的因果基因。因此，在其余的4個群體中，沒有必要對該基因進行相關(guān)的研究。

HMGA1能提高軟骨細胞增殖活性［12］，并通過調(diào)控透明軟骨細胞增殖和分化來影響軟骨組織的修復(fù)［28］。在關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)，HMGA1和IGFBP-3蛋白表達量均上調(diào)［29］。在F2和二花臉群體中，該基因均與肢蹄結(jié)實度相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)，在其他3個群體中，該的3個體位點的MAF小于0.05，沒有足夠的檢測效率，因此沒有進行關(guān)聯(lián)分析。因此，它仍有可能是肢蹄結(jié)實度因果基因。

在F2群體和萊蕪群體中，C6orf106與肢體結(jié)實度性狀顯著地關(guān)聯(lián)。在二花臉群體中，3個SNP的MAF均小于0.05。在蘇太和杜長大群體中，g.34542A＞T位點的MAF小于0.05，另外2個SNP的MAF雖然大于0.05，但是它們與已測的肢蹄結(jié)實度不關(guān)聯(lián)?？紤]到這個基因還有100多個多態(tài)位點沒有檢測，因此，不能排除其為因果基因的可能性。

4 結(jié)論

本研究建立了一種通過內(nèi)在的關(guān)節(jié)評分來評估肢蹄結(jié)實度的方法。相關(guān)分析結(jié)果表明外觀的蹄趾、肢蹄和步態(tài)評分與關(guān)節(jié)評分之間無顯著相關(guān)性，因此，關(guān)節(jié)評分是對現(xiàn)有肢蹄結(jié)實度度量方法的重要補充。性別對肢蹄結(jié)實度有顯著的影響，在進行肢蹄結(jié)實度的遺傳解析中，需要考慮性別效應(yīng)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果排除了ENSSSCG00000023160是肢蹄結(jié)實度因果基因的可能性，但是HMGA1和C6orf106的可能性沒有排除，有必要對這兩個基因進行更深入的研究。

［1］ 候利娟， 張徐非， 郭源梅. 豬肢蹄結(jié)實度的遺傳解析進展. 豬業(yè)科學(xué)， 2013（12）: 94-97.

HOU L J， ZHANG X F， GUO Y M. The advance of genetic deciphering of leg soundness in pigs. Swine Industry Science，2013（12）: 94-97. （in Chinese）

［2］ STEENBERGEN E J VAN. Description and evaluation of a linears coring system for exteriortraits in pigs. Livestock Production Science，1989， 23: 163-181.

［3］ WEBB A J， RUSSELL W S， SALES D I. Genetics of leg weakness in performance-tested boars. Animal Production， 1983， 36: 117-130.

［4］ STALDER K， SERENIUS T. Sow longevity scrutinized. National Hog Farmer， 2004， 49（7）: 26-30.

［5］ BERESKIN B. Genetic aspects of feet and leg soundness in swine. Journal of Animal Science， 1979， 48: 1322-1328.

［6］ J?RGENSEN B， ANDERSEN S. Genetic parameters for osteochondrosis in Danish Landrace and Yorkshire boars and correlations with leg weakness and production traits. Animal Science， 2000， 71: 427-434.

［7］ ROTHSCHILD M F， CHRISTIAN L L. Genetic control of front-leg weakness in Duroc swine. I. Direct response to five generations of divergent selection. Livestock Production Science， 1988， 19: 459-471.

［8］ HU Z L， PARK C A， WU X L， REECY J M. Animal QTLdb: an improved database tool for livestock animal QTL/association data dissemination in the post-genome era. Nucleic Acids Research， 2013，41（Database issue）: 871-879.

［9］ GUO Y M， AI H S， REN J， WANG G J， WEN Y， MAO H R， LAN L T，MA J W， BRENIG B， ROTHSCHILD M F. A whole genome scan for quantitative trait loci for leg weakness and its related traits in a large F2 intercross population between White Duroc and Erhualian. Journal of Animal Science， 2009， 87（5）: 1569-1575.

［10］ GUO Y M， ZHANG X F， REN J， AI H S， MA J W， HUANG L S. A joint genomewide association analysis of pig leg weakness and its related traits in an F2 population and a Sutai population. Journal of Animal Science， 2013， 91（9）: 4060-4068.

［11］ GUO Y， MAO H， REN J， YAN X， DUAN Y， YANG G， REN D，ZHANG Z， YANG B， OUYANG J. A linkage map of the porcine genome from a large-scale White Duroc x Erhualian resource population and evaluation of factors affecting recombination rates. Animal Genetics， 2009， 40（1）: 47-52.

［12］ CLEYNEN I， VAN DE VEN W J. The HMGA proteins: a myriad of functions （Review）. International Journal of Oncology， 2008， 32（2）: 289-305.

［13］ WEEDON M N， LANGO H， LINDGREN C M， WALLACE C，EVANS D M， MANGINO M， FREATHY R M， PERRY J R，STEVENS S， HALL A S. Genome-wide association analysis identifies 20 loci that influence adult height. Nature Genetics， 2008， 40（5）: 575-583.

［14］ BERNDT S I， GUSTAFSSON S， MAGI R， GANNA A， WHEELER E，F(xiàn)EITOSA M F， JUSTICE A E， MONDA K L， CROTEAU-CHONKA D C， DAY F R. Genome-wide meta-analysis identifies 11 new loci for anthropometric traits and provides insights into genetic architecture. Nature Genetics， 2013， 45（5）: 501-512.

［15］ SORANZO N， RIVADENEIRA F， CHINAPPEN-HORSLEY U，MALKINA I， RICHARDS J B， HAMMOND N， STOLK L， NICA A，INOUYE M， HOFMAN A. Meta-analysis of genome-wide scans for human adult stature identifies novel Loci and associations with measures of skeletal frame size. PLoS Genetics， 2009， 5（4）: e1000445.

［16］ DOHERTY L， SHEEN M R， VLACHOS A， CHOESMEL V，O'DONOHUE M F， CLINTON C， SCHNEIDER H E， SIEFF C A，NEWBURGER P E， BALL S E. Ribosomal protein genes RPS10 and RPS26 are commonly mutated in Diamond-Blackfan anemia. American Journal of Human Genetics， 2010， 86（2）: 222-228.

［17］ NOAH T K， KAZANJIAN A， WHITSETT J， SHROYER N F. SAM pointed domain ETS factor （SPDEF） regulates terminal differentiation and maturation of intestinal goblet cells. Experimental Cell Research，2010， 316（3）: 452-465.

［18］ LIU Y， Lü K， LI Z， YU A C， CHEN J， TENG J. PACSIN1， a Tau-interacting protein， regulates axonal elongation and branching by facilitating microtubule instability. Journal of Biological Chemistry，2012， 287（47）: 39911-39924.

［19］ LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， CHENNA R，MCGETTIGAN P A， MCWILLIAM H， VALENTIN F， WALLACE I M， WILM A， LOPEZ R. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics （Oxford， England）， 2007， 23（21）:2947-2948.

［20］ 張徐非. 位置候選基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160與豬肢蹄結(jié)實度的關(guān)聯(lián)性研究［D］. 江西南昌: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2013.

ZHANG X F. Evaluation of effects of positional candidate genes HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG00000023160 on pig leg soundness traits［D］. Jiangxi， Nanchang: Jiangxi Agricultural University， 2013.（in Chinese）

［21］ 沈虎群. 位置候選基因HMGA1、SRPK1、ZNF76與豬四肢骨骼長度的相關(guān)性研究［D］. 南昌: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

Shen H Q. Evaluation of effects of positional candidate genes HMGA1，SRPK1 and ZNF76 in the SSC7 QTL region on pig limb bone lengths［D］. Nanchang: Jiangxi Agricultural University， 2009. （in Chinese）

［22］ Burdick J T， Chen W M， Abecasis G R， Cheung V G. In silico method for inferring genotypes in pedigrees. Nature Genetics， 2006， 38（9）: 1002-1004.

［23］ Sobel E， Lange K. Descent graphs in pedigree analysis: applications to haplotyping， location scores， and marker-sharing statistics. American Journal of Human Genetics， 1996， 58（6）: 1323-1337.

［24］ Aulchenko Y S， Ripke S， Isaacs A， van Duijn C M. GenABEL: an R library for genome-wide association analysis. Bioinformatics （Oxford，England）， 2007， 23（10）: 1294-1296.

［25］ Amin N， van Duijn C M， Aulchenko Y S. A genomic background based method for association analysis in related individuals. PLoS ONE， 2007， 2（12）: e1274.

［26］ Astle W， Balding D J. Population structure and cryptic relatedness in genetic association studies. Statistical Science， 2009， 24（4）: 451-471.

［27］ Draper D D， Rothschild M F， Christian L L. Effects of divergent selection for leg weakness on muscle and bone characteristics in Duroc swine. Genetics Selection Evolution， 1992， 24: 363-374.

［28］ Richter A， Hauschild G， Murua Escorbar H， Nolte I， Bullerdiek J. Application of high-mobility-group-A proteins increases the proliferative activity of chondrocytes in vitro. Tissue Engeering Part A， 2009， 15（3）: 473-477.

［29］ Gasparini G， De Gori M， Paonessa F， Chiefari E， Brunetti A， Galasso O. Functional relationship between high mobility group A1 （HMGA1）protein and insulin-like growth factor-binding protein 3 （IGFBP-3） in human chondrocytes. Arthritis Research and Therapy， 2012， 14（5）: R207.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

An Association Study of Positional and Functional Candidate Genes HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG00000023160 with Leg Soundness in Pigs

ZHANG Xu-fei1，2， HOU Li-juan2， QIU Heng-qing2， HUANG Lu-sheng2， GUO Yuan-mei2

（1Laboratory Animal Center， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， Zhejiang；2State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045）

【Objective】 The objective of this study is to develop a method to access the leg soundness through scoring the joint of limb bone and calculate the simple correlation coefficients among the scores for leg soundness in pigs. Furthermore， the association between three positional and functional candidate genes， namely HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG0000023160， and leg soundness was also studied in F2， Laiwu， Erhualian， Sutai and DLY populations.【Method】The joint of five limb bones were scored according to the size and depth of rip on the joint surface and the worn-out degree of the joint. If the rip on the joint surface is very big and deep or the joint is seriously worn out， the joint is scored 1. On the other hand， if there is no rip on the joint surface and the joint doesn’t have any degree of worn-out， the joint is scored 5. Higher the joint score is， healthier the joint is and sounder the leg is. Based on the authors’ previous genome-wide association studies， three genes HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG0000023160 were screened as positional and functional candidate genes to leg soundness in a 0.4 Mb region centered on the top SNP on SSC7. To search the polymorphic loci of the three genes in the F2population， their DNA sequences were determined by a short-gun DNA sequence method. A total of 11 polymorphic loci were picked out according to their conservations among 6 species. The genotypes of 3 loci for HMGA1 and 3 loci for C6orf106 were determined using the Taqman method， and the genotypes of the other 5 loci for the third gene were inferred by genotype imputation just in the F2population. At last， the GenABEL package of R was used to perform the association analysis between the loci with MAF＞0.05 and the traits.【Result】A total of 174 and 5 polymorphic loci were identified in C6orf106 and ENSSSCG00000023160 genes， respectively. Joint scores were positively correlated with each other and were negatively correlated with the length and weight of biceps brachii， but most of them had no correlation with toe， leg and gait scores. The male’s scapula joint score was significantly lower than the female’s， but arm shoulder joint score and focile hock joint score were significantly higher than the female’s corresponding joint score. In the F2population， all of the three genes were associated with leg soundness， but ENSSSCG00000023160 was weaker than the other two genes， therefore it was excluded as a candidate gene to leg soundness and was not genotyped in the other 4 populations. In the Erhualian population， two loci g.2029C＞T and g.3155A＞G of HMGA1 were significantly associated with leg soundness， and the other SNP lacked the polymorphism. In the other 3 populations， all of the 3 SNPs of HMGA1 were deficiently polymorphic. Only the g.6953T＞C locus of C6orf106 had enough polymorphic in the Laiwu population， and it was associated with leg soundness. In the Sutai and DLY populations， only two loci g.2054T＞C and g.6953T＞C of C6orf106 were polymorphic， but none was associated with leg soundness.【Conclusion】A method of accessing the leg soundness has been proposed by scoring the joint of limb bones in pigs， and it is a crucial supplement method to access the leg soundness. Because toe， leg and gait scores are not correlation with the joint scores， they can’t replace the joint scores. The association analysis results excluded the ENSSSCG00000023160 gene as candidate gene to leg soundness， but both HMGA1 and C6orf106 genes were not excluded. Therefore， the two genes are worthy for further investigations.

pig； leg soundness； joint score； association analysis； genotype imputation

2015-08-27；接受日期：2016-08-05

國家自然科學(xué)基金（31060153，31460590）、江西省自然科學(xué)基金（20142BAB204017）

聯(lián)系方式：張徐非，E-mail：604120811@qq.com。候利娟，E-mail：397999166@qq.com。張徐非和候利娟為同等貢獻作者。通信作者郭源梅，Tel/Fax：0791-83813080；E-mail：gyuanmei@hotmail.com