高應(yīng)瑞+劉珂飛+孟鐵健+由天立

摘 要：在3種溫度下對(duì)大腸桿菌表達(dá)重組雞α干擾素進(jìn)行了多等溫加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和2 ℃保存的穩(wěn)定性考察，預(yù)測(cè)重組雞α干擾素的穩(wěn)定性，為制品有效期的確定提供依據(jù)。采用多等溫加速試驗(yàn)， 將制品放在3種不同溫度下孵放， 定期取出樣品， 測(cè)定效價(jià)， 根據(jù)制品的效價(jià)下降情況推算其在有效期內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：用加速降解有關(guān)公式可以求出在2 ℃存放1年后的殘余效價(jià)為226 492 682單位，下降率為9.9%，與實(shí)測(cè)值228 000 957單位基本吻合；2年后的殘余效價(jià)為203 868 551單位，下降率為18.9%。即2 ℃保存2年后效價(jià)保持在80%以上，推算的結(jié)果與試驗(yàn)值較吻合，產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。

關(guān)鍵詞：多等溫加速試驗(yàn)；重組雞α干擾素；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.014

Abstract： To forecast the stability of the recombinant chicken interferon α products， and to provide basic information for determining the shelf-life of the products， accelerated stability test was conducted at three different temperatures on E.coli expression of recombinant chicken interferon and stored at 2 ℃ for inspection. By accelerated degradation tests， the products of recombinant chicken interferon α were put at three different temperature conditions for incubation. Some samples were taken out regularly during the incubation in order to test the titer， and to estimate the stability of the products during the shelf-life according to the decline of the titer. The result showed that residual valence for one year after the decline rate was 9.9% at 2 ℃， and was conswastent with the measured value， the residual value after two years of decline rate was 18.9%. In other words， stored at 2 ℃ for two years after the titer remained at more than 80%， the result of calculated the recombinant chicken interferon α had good stability during their shelf-life.

Key words： accelerated degradation tests； the recombinant chicken interferon α； stability

傳統(tǒng)的蛋白類藥物，特別是干擾素在水溶液中的穩(wěn)定性較差。為解決這一難題，在研制過(guò)程中，筆者作了多方面的努力， 減少了純化過(guò)程中失活， 并在改善成品穩(wěn)定性方面取得了進(jìn)展。本研究報(bào)道了重組雞α干擾素的穩(wěn)定性研究結(jié)果， 其中包括加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和2 ℃保存的穩(wěn)定性考察， 并對(duì)加速試驗(yàn)和實(shí)地穩(wěn)定性考察的相關(guān)性作了討論。

1 材料和方法

1.1 重組雞α干擾素

將重組雞α干擾素粗品經(jīng)多步純化， 比活性達(dá)到2.5×108 IU·mL-1以上，加入穩(wěn)定劑， 除菌、分裝。批號(hào)為201103221。

1.2 效價(jià)測(cè)定方法

用微量細(xì)胞病變抑制法[1]。檢測(cè)系統(tǒng)為水泡口炎病毒—VSV攻擊病毒。

1.2.1 干擾素溶液的制備 將待測(cè)干擾素溶液用含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)稀釋3倍，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共9個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做6孔。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)禽易肽溶液用含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)稀釋2倍，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共7個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做6孔。

1.2.3 常規(guī)方法 制水泡口炎病毒接種于96孔板，24 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，用PBS洗兩次后，分別加入不同濃度梯度的干擾素溶液100 μL，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，將保存好的NDV病毒用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至約100 TCID50，每孔100 μL，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，當(dāng)病毒對(duì)照中細(xì)胞病變達(dá)90%以上時(shí)，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，每孔加染色液50 μL，室溫放置30 min，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100 μL，室溫放置3～5 min，用酶標(biāo)儀以630 nm為參考波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算：

供試品生物學(xué)活性=Pr×[（Ds×Es）/（Dr×Er）]

式中，Pr為干擾素標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性；Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；Dr為干擾素標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；Es為供試品相當(dāng)于干擾素標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為干擾素標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。endprint

1.3 試驗(yàn)方法

采用多等溫度下加速試驗(yàn)[2-4]。將樣品分為4組， 一組放在2～8 ℃下保存作為對(duì)照組， 每隔90 d取樣測(cè)定其效價(jià)，其余3組分別放在37，56，66 ℃恒溫孵箱內(nèi)加熱， 溫差范圍均在±0. 5 ℃， 間隔一定時(shí)間取樣作效價(jià)測(cè)定。根據(jù)不同溫度下孵放后效價(jià)下降情況， 按一級(jí)反應(yīng)方程log u= log u0-kt （ k為某一恒溫條件下的反應(yīng)速度常數(shù)） 求出不同恒溫條件下的反應(yīng)速度常數(shù)k， 再利用化學(xué)反應(yīng)速度常數(shù)與反應(yīng)溫度的關(guān)系， 即Arrhenius 方程log k= α-β/T （T為反應(yīng)的絕對(duì)溫度） 推算出低溫下的k值， 預(yù)測(cè)低溫下樣品的效價(jià)， 從而預(yù)測(cè)低溫下樣品的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品加溫降解試驗(yàn)結(jié)果

取一批代表樣品在3種溫度下降解時(shí)，殘余效價(jià)的對(duì)數(shù)與加溫時(shí)間基本上呈直線關(guān)系（圖1和表1）。這說(shuō)明雞a干擾素的降解服從一級(jí)反應(yīng)式：

lg u = lg u0-kt （1）

式（1）中u0為原始效價(jià)，u為加溫t時(shí)間后的殘余效價(jià)，k為一定溫度下的降解速度常數(shù)。由圖1可以看出，不同溫服下降解速度顯著不同，66 ℃最快，56 ℃次之，37 ℃最慢。

2.2 計(jì)算各溫度條件下的降解反應(yīng)速度常數(shù)

按公式（1），將表1的數(shù)據(jù)作直線回歸處理，可求得下列數(shù)值，見(jiàn)表2。再根據(jù)log k與降解溫度T（K）的關(guān)系式log k= α-β/T，將已經(jīng)求出的66 ℃、56 ℃和37 ℃的k值對(duì)式log k= α-β/T作回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2與圖2，可求出在8 ℃，2 ℃時(shí)的k值（表2），分別為2.032×10-4·d-1和1.247×10-4·d-1。

以2 ℃時(shí)的k值代入（1）式，可以求出在2 ℃存放1年后的殘余效價(jià)為226 492 682單位，下降率為9.9%，與實(shí)測(cè)值228 000 957單位基本吻合；2年后的殘余效價(jià)為203 868 551單位，下降率為18.9%。即2 ℃保存2年后效價(jià)保持在80%以上。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)上述結(jié)果，可以認(rèn)為重組雞α干擾素在2～10 ℃條件下保存1年、2年、3年和10年其效價(jià)下降呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)， 重組雞α干擾素在2年有效期內(nèi)的效價(jià)下降率為18.9%。即2 ℃保存2年后效價(jià)保持在80%以上。

穩(wěn)定性是生物制品的重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。高溫下加速降解試驗(yàn)是一種常見(jiàn)的用于考察生物制品穩(wěn)定性的方法，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，采用這一方法對(duì)于預(yù)測(cè)制品穩(wěn)定性具有一定的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

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