張愛君,王秀青,楊鳳琴

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，寧夏銀川 750004；2.寧夏檢驗醫(yī)學(xué)研究所)

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天蠶素A-馬蓋寧雜合肽體外抗白色念珠菌活性實驗研究*

張愛君1,2,王秀青1,2,楊鳳琴1,2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，寧夏銀川 750004；2.寧夏檢驗醫(yī)學(xué)研究所)

目的：本實驗旨在研究天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對白色念珠菌的體外抗菌活性。方法：選取10株臨床分離的白色念珠菌和其標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用K-B法和肉湯稀釋法測定天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對白色念珠菌的抑菌效果和最小抑菌濃度。結(jié)果：天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對11株白色念珠菌均有抑菌作用，且最小抑菌濃度測定為0.16 mg/mL。結(jié)論：天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對白色念珠菌具有一定的抑菌作用。

天蠶素A-馬蓋寧雜合肽；白色念珠菌；最小抑菌濃度

白色念珠菌是寄生在人體皮膚、黏膜的正常真菌,也是臨床上重要的條件致病性真菌。免疫力低下者可引起皮膚、黏膜及內(nèi)臟的念珠菌病,重者可引起系統(tǒng)性感染,危及生命。近年來,隨著抗真菌藥物的廣泛之用,耐藥菌株也大量增加。而免疫抑制劑、廣譜抗生素及皮質(zhì)類固醇激素的廣泛使用、導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)白色念珠菌病的發(fā)病率不斷上升，成為目前臨床上的焦點問題[1],同時給臨床抗真菌治療也帶來困難。

抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有抗菌活性的一類小分子多肽，其分子質(zhì)量小、構(gòu)象簡單、無免疫原性、不易引起耐藥，且具有抗菌譜廣、抗菌活性高等特點，很有可能成為新型抗微生物藥物[2]。本實驗通過體外抑菌試驗測定天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對白色念珠菌的抑菌活性。

1 材料

1.1 實驗菌株 白色念珠菌(ATCC.10231),購于北京生物制品鑒定所。10株臨床標(biāo)本中分離的白色念珠菌由寧夏回族自治區(qū)某醫(yī)院提供。

1.2 試驗藥品 人工合成的天蠶素A-馬蓋寧雜合肽。

1.3 培養(yǎng)基 沙保弱氏液體培養(yǎng)基、沙保弱氏固體培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京陸橋生物制品有限公司，使用時按使用說明配制，高壓蒸汽滅菌備用。

1.4 儀器 AL-204電子天平(梅特樂科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；YQX-LS50A型全自動高壓蒸汽滅菌器(上海申安科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；BHC-1300IIA/B3生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn))；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.5 方法

1.5.1 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽的合成 是由本課題組前期研究、設(shè)計合成，并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的產(chǎn)物，具體方法見文獻(xiàn)[3]。

1.5.2 菌懸液的制備 第一，取待測菌保存液10 μL加入1 mL沙氏液體培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)24 h。第二，對第一步培養(yǎng)液進(jìn)行OD600值測定，沙氏液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度使其OD600值落在0.08～0.1之間，此時菌液濃度約為108CFU/mL。第三，上樣菌液稀釋。將待測菌液在第二步驟所得稀釋倍數(shù)的基礎(chǔ)上再稀釋1 000倍，此時菌液濃度約為105CFU/mL，此時菌液即為上樣菌液。

1.5.3 抗菌藥物制備 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)。用雙蒸水作為抗菌肽的稀釋液，天蠶素A-馬蓋寧雜合肽藥物濃度20 mg/mL，溶解后用0.22 μm孔徑的濾膜過濾。

1.5.4 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽抗真菌活性的初步測定 采用紙片瓊脂擴散法。(1)取兩株白色念珠菌接種于沙氏瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑取沙氏瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，懸于3 mL生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁，調(diào)整濁度至0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?2)用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個沙氏瓊脂培養(yǎng)基表面，保證涂均勻。(3)待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無菌鑷子取無菌紙片貼在平板表面，每個平板貼2張紙片。用每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。在一張紙片上用加樣槍加入抗菌肽4 μL(20 mg/mL)，另一張紙片用加樣槍加入等量的生理鹽水(40 μL)，作為陰性對照。(4)孵育24 h后取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.5 待檢藥物最小抑菌濃度的測定 選擇11株測試菌，對每1株進(jìn)行如下操作：(1)取無菌96孔板第1～11列加入滅菌沙氏液體培養(yǎng)基100 μL；(2)無菌96孔板第1列加入抗菌肽(20 mg/mL)，逐次倍比稀釋至第11列：(3)無菌96孔板每1孔加入菌液100 μL，終體積200 μL；(4)無菌96孔板第12列上兩孔加200 μL/孔滅菌沙氏液體培養(yǎng)基做陰性對照，下兩孔加200 μL菌液做陽性對照；(5)藥液和菌液上樣完畢后，蓋好板蓋，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，以不生長細(xì)菌的最高藥物稀釋度為該藥物對該種細(xì)菌的最小抑菌濃度。平行做3次，以兩次或3次測定結(jié)果相同為準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 K-B法體外抑菌試驗結(jié)果 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對標(biāo)準(zhǔn)菌株-白色念珠菌有抑菌圈，直徑為11 cm，表明天蠶素A-馬蓋寧雜合肽有抗真菌活性。如圖1所示。

2.2 肉湯稀釋法體外抑菌試驗 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對臨床分離的白色念珠菌及標(biāo)準(zhǔn)菌株表現(xiàn)出近乎相同的抑菌效果，其對白色念珠菌的平均最小抑菌濃度為0.16 mg/mL。詳見表1。

表1 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對白色念珠菌的體外抑菌結(jié)果

注：+表示有細(xì)菌生長；-表示無細(xì)菌生長

3 討論

近年來，真菌感染在住院患者的檢出率逐漸升高，其感染率僅次于腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌。其中深部真菌感染，又稱侵襲性真菌感染，指致病性真菌侵及人體表層以下的組織引起的疾病，嚴(yán)重時甚至可以導(dǎo)致全身性感染，危害性極大。而隨著人口老齡化、艾滋病以及糖尿病發(fā)病率的不斷上升。隨著廣譜抗生素、腎上腺皮質(zhì)激索、抗腫瘤藥物和免疫抑制劑等在臨床中的廣泛使用，以及骨髓器官移植、介入治療等技術(shù)不斷推廣，致使許多患者的免疫力下降或缺陷，使得深部真菌感染的發(fā)病率和病死率呈急劇上升的趨勢[4]。80年代初,第一個生物利用度高、可以口服使用的咪唑類抗真菌藥物酮康唑應(yīng)用于臨床,不久就有應(yīng)用酮康唑治療念珠菌感染的患者出現(xiàn)耐藥的報道。氟康唑開始在臨床上應(yīng)用后,由于口服易吸收,抗真菌譜廣,作用強,生物利用度高,不良反應(yīng)低等優(yōu)點,很快取代酮康唑,廣泛用于多種深部真菌感染的治療,但很快出現(xiàn)了耐藥的菌株,伏立康唑是三唑類抗真菌藥,在體內(nèi)、體外可抗多種致病真菌,但有研究顯示三唑類抗真菌藥物之間存在交叉耐藥。

抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有抗菌活性的一類小分子多肽，是生物先天性免疫的重要組成成分。由于其分子質(zhì)量都比較小，大約在18～35 kD之間，分子構(gòu)象簡單，一般不會引起機體的免疫反應(yīng)。隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)、功能與殺菌機理研究的深人，人們開始嘗試設(shè)計殺菌活力更強、抗菌譜更廣的新型抗菌肽。Jaynes以天蠶素B為藍(lán)本設(shè)計并化學(xué)合成的Shiva-1lq和Fink等固相合成法化學(xué)合成的雜合抗菌肽ADr4，其殺菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然抗菌肽，抗菌譜也有所增加。目前抗真菌肽的抗菌機制未完全闡明，被廣泛公認(rèn)的學(xué)說之一是細(xì)胞膜破壞作用，即帶正電的抗菌肽與帶負(fù)電的微生物細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電吸引作用，抗菌肽通過破壞真菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，最終導(dǎo)致菌體裂解死亡。還有研究發(fā)現(xiàn)[5]抗菌肽對真菌的作用方式渦陽，如通過胞膜作用，與真菌細(xì)胞內(nèi)線粒體、核酸大分子等重要細(xì)胞器的相互作用，最終導(dǎo)致真菌死亡。

鑒于此，我們設(shè)計合成了cecA-mag雜合肽的突變體天蠶素A-馬蓋寧雜合肽，通過K-B法和肉湯稀釋法，用合成產(chǎn)物天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對臨床分離的10株白色念珠菌進(jìn)行了體外抗真菌活性的測定。結(jié)果顯示天蠶素A-馬蓋寧雜合肽具有一定的抑制真菌的作用，其最小抑菌濃度是0.16 mg/mL。但在動物體內(nèi)抗菌肽藥物濃度維持、抵抗溫度、酸堿度對藥效的影響等方面仍需進(jìn)一步的研究。

[1] Mayer F,Wilson D,Hube B.Candida albicans pathogenicity mechanisms [J].Virulence，2013,4(2):119-128.

[2] 牛明福，李翔，伍家發(fā).抗菌肽的分子設(shè)計研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008,(4)：2-5.

[3] Wang XQ,Zhu MX，Zhang AJ.et al.Synthesis and secretory expression of hybrid antimicrobial peptide CecA-mag and its mutants in Pichia pastoris [J].Experimental Biology Medicine,2012,237(3)：312-317.

[4] 劉燦,王中新.假絲酵母菌藥敏檢測方法及其耐藥性的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2010,14(2):224-226.

[5] Magill SS ,Shields C,Sears CL ,et a1.Triazole crross-resistance among Candida spp:case report,occurrence among bloodstream isolates,and implications for antifungal therapy〔J〕.J Clin Microbiol,2006,44(2):529-535.

An experimental study on vitro antibacterial effects of cecropin A-magainnin hybrid peptide on candida albicans

ZHANG Aijun1,2，WANG Xiuqing1,2,YANG Fengqin1,2

(1.CollegeofLaboratoryMedicine，NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China; 2.NingxiaMedicalInspectionInstitute,Yinchuan750004,China)

Objective:To study vitro antibacterial effects of cecropin A-magainnin hybrid peptide on candida albicans.Methods：10 strains of candida albicans isolated from clinic and 1 standard bacterial strain were selected.Kirby-bauer (K-B) method and broth dilution method were adopted to determine the antibacterial effect and minimal inhibitory concentration (MIC) of cecropin A-magainnin hybrid peptide against candida albicans.Results：Cecropin A-Maganin has antimicrobial effect on the 11 strains of candida albicans with MIC measured as 0.16mg/mL.Conclusion：Cecropin A-magainnin hybrid peptide has antimicrobial effects on candida albicans to some extend.

Cecropin A-magainnin hybrid peptide; Candida albicans; Minimal inhibitory concentration (MIC)

寧夏醫(yī)科大學(xué)校級面上項目(XM2012017)

2015-08-26)