張宗耐 常迎彬

民航總醫(yī)院普通外科 北京 100123

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Pyk2在結(jié)直腸癌中作用機(jī)制的初步研究

張宗耐 常迎彬

民航總醫(yī)院普通外科 北京 100123

目的 探討富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2(Pyk2)在人類結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制。方法 構(gòu)建有正義Pyk2 cDNA和反義Pyk2 cDNA的質(zhì)粒pcDNA4.1/Zeocin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌sw480細(xì)胞系，利用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞在凋亡和細(xì)胞周期s期細(xì)胞分布的差異。結(jié)果 轉(zhuǎn)染正義Pyk2 cDNA質(zhì)粒的sw480細(xì)胞凋亡水平明顯高于對(duì)照組，s期細(xì)胞數(shù)顯著減少；轉(zhuǎn)染反義Pyk2質(zhì)粒的sw480細(xì)胞凋亡水平明顯低于對(duì)照組，s期細(xì)胞數(shù)顯著增多。結(jié)論 Pyk2可能是通過提高結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡水平，降低其增殖水平而發(fā)揮作用。

結(jié)直腸癌；蛋白酪氨酸激酶2；增殖；凋亡；轉(zhuǎn)染

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)，2011年結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別為23.03/10萬和11.01/10萬，且發(fā)病時(shí)多數(shù)已屬晚期，嚴(yán)重威脅人類健康。富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2(Pyk2)是一種非受體酪氨酸蛋白激酶，主要依賴 Ca2+濃度或 PKC 參與細(xì)胞內(nèi)的MAPK、PI3K或JNK等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，將胞外信息與胞內(nèi)效應(yīng)分子聯(lián)系起來，催化多種含 SH2 結(jié)構(gòu)域的底物蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生與分化、粘附和遷移以及一些轉(zhuǎn)錄因子的活性[1-3]。筆者的前期研究顯示，Pyk2的表達(dá)水平是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子，高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的有利因素[4]，但其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本文通過建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染正義Pyk2 cDNA和反義Pyk2 cDNA質(zhì)粒的結(jié)/直腸癌sw480細(xì)胞系，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Pyk2對(duì)細(xì)胞凋亡水平和s期細(xì)胞分布的差異以探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480，轉(zhuǎn)化有全長(zhǎng)PCDNA4-A-antisense-Pyk2和PCDNA4-A-Pyk2質(zhì)粒的大腸桿菌，由北京大學(xué)第一醫(yī)院大腸癌實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；兔抗人Pyk2多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自Promega公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Lifetech公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司；DMEM、F12 培養(yǎng)基以及胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 直腸癌細(xì)胞系SW480培養(yǎng)條件為10%胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，在37℃，CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選 按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合。質(zhì)粒DNA(PCDNA4-A-Pyk2，PCDNA4-A，PCDNA4-A-antisense Pyk2)4 μg用250 μL無胎牛血清的DMEM稀釋混勻，在另一個(gè)EP管中將10 μL脂質(zhì)體用250 μL無胎牛血清的DMEM稀釋混勻，室溫孵育5 min，馬上將DNA稀釋液與脂質(zhì)體稀釋液充分混勻，室溫放置20 min，以形成DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，PBS洗細(xì)胞2次，加入2 mL無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物加入培養(yǎng)液中，混勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 hr后將細(xì)胞分瓶傳代(細(xì)胞密度最好不超過25%，此時(shí)Zeocin效果好)，再次放入上述條件細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 hr更換培養(yǎng)液，加入Zeocin至終濃度100 μg/mL；每2～3天更換培養(yǎng)液,至細(xì)胞克隆出現(xiàn)；Zeocin濃度減為50 μg/mL，維持既定的克隆生長(zhǎng)6～8周。穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞可傳代培養(yǎng)，仍需加50μg/ mL的Zeocin維持篩選。

1.4 轉(zhuǎn)染成功的鑒定 待4種細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶，常規(guī)提取各組細(xì)胞蛋白，用Western-blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Pyk2蛋白的表達(dá)水平；常規(guī)提取各組細(xì)胞mRNA，進(jìn)行RT-PCR，測(cè)定轉(zhuǎn)染后Pyk2基因表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Pyk2對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡的影響 調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為5×105～1×106個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞，1 000 rpm，4℃離心10 min，加入1 mL冷的PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 rpm，4℃離心10 min。棄上清，重復(fù)步驟3、4次(對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用PBS沖洗)，將細(xì)胞重懸于200 μL binding buffer，加入10 μL Annexin5-FITC，輕輕搖勻，避光室溫反應(yīng)15 min或者4℃反應(yīng)30 min，加入300 μL binding buffer，再加入5 μL PIJ即可上機(jī)檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) Pyk2對(duì)大腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，并收集細(xì)胞；用PBS 洗滌細(xì)胞一次(離心2 000 rpm，5 min)收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL；制備的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液(如需要，細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾一次)加100 μL RNaseA 37℃水浴30 min；再加入400 μL PI 染色混勻，4℃避光30 min；上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 處紅色熒光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sw480細(xì)胞系的成功構(gòu)建 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后各組Pyk2 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定如圖1所示：sw480-Pyk2(+)組中Pyk2 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，sw480-Pyk2(-)組中Pyk2 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，而sw480-vector中Pyk2 mRNA的表達(dá)水平則無明顯變化，這證明建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的高表達(dá)和低表達(dá)Pyk2的sw480細(xì)胞系。

圖2示轉(zhuǎn)染后sw480細(xì)胞Pyk2蛋白的表達(dá)。sw480-Pyk2(+)組中Pyk2蛋白表達(dá)較對(duì)照組sw480明顯增加，sw480-Pyk2(-)組中Pyk2蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；sw480-vector中Pyk2蛋白表達(dá)水平則與對(duì)照組無差異，證明建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的高表達(dá)和低表達(dá)Pyk2的細(xì)胞系。

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡水平的變化 與對(duì)照組sw480細(xì)胞相比，sw480-Pyk2(+)組大腸癌細(xì)胞凋亡率明顯提高，sw480-Pyk2(-)則明顯降低(P<0.05)，而sw480-vector組則無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞細(xì)胞周期分布變化 與對(duì)照組sw480細(xì)胞相比，sw480-Pyk2(+)組大腸癌細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，分布于S期的細(xì)胞減少；而sw480-Pyk2(-)組中分布于S期的細(xì)胞則增多，sw480-vector組大腸癌細(xì)胞在細(xì)胞周期分布上與對(duì)照組相比無明顯變化，見圖4。

3 討論

腫瘤不僅是細(xì)胞增生異常的疾病，也是腫瘤細(xì)胞死亡異常的病理狀態(tài)。腫瘤的生長(zhǎng)本身就是細(xì)胞增殖和凋亡失去平衡的結(jié)果。一系列研究表明，腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡之間存在聯(lián)系[5]。許多與細(xì)胞增殖、周期調(diào)節(jié)有關(guān)的基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同時(shí)也是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因素[6]。因?yàn)榧?xì)胞增生與細(xì)胞凋亡間的不平衡被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤的關(guān)鍵因素，大量的研究集中于如何改變從癌前病變發(fā)展為癌的凋亡通路。

目前對(duì)Pyk2 表達(dá)與凋亡的關(guān)系研究提示Pyk2 在誘導(dǎo)凋亡的過程中發(fā)揮著一定的作用。Xiong 等[7]報(bào)道在幾種纖維母細(xì)胞和上皮細(xì)胞系中有異位表達(dá)的Pyk2 引起凋亡，而且Pyk2 表達(dá)的缺失能導(dǎo)致對(duì)生理性凋亡的抵抗。Chauhan 等[8]在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，由地塞米松誘導(dǎo)的凋亡過程與Pyk2 的活化有關(guān)，首次在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了地塞米松依賴Pyk2 誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路。Ueda 等[9]報(bào)道發(fā)現(xiàn)一種與FAK 家族的激酶相互作用的蛋白FIP-200，其通過與Pyk2 的激酶活性區(qū)結(jié)合而抑制Pyk2 激酶的活性，在大鼠細(xì)胞中FIP-200 與Pyk2 形成的復(fù)合體能抑制Pyk2 誘導(dǎo)的凋亡。

Pyk2是一種非?；钴S的酪氨酸蛋白激酶，可被多種細(xì)胞外的信號(hào)所激活，參與MAPK，c-JNK以及PI3K-Akt等信號(hào)傳導(dǎo)通路。Pyk2在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等細(xì)胞事件中發(fā)揮著重要作用。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)，Pyk2蛋白在大腸癌組織中定位于大腸癌細(xì)胞的胞漿當(dāng)中，其表達(dá)水平與大腸癌分化程度以及TNM分期呈顯著相關(guān)，這表明Pyk2表達(dá)水平能夠反映大腸癌的惡性程度[4]。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生中具有重要作用[10]。筆者在以往研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建正義和反義Pyk2的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA4.1/Zeo及空載體經(jīng)脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大腸癌sw480細(xì)胞系，內(nèi)源性控制大腸癌細(xì)胞中Pyk2的表達(dá)水平，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，sw480-Pyk2(+)組大腸癌細(xì)胞凋亡率明顯提高，并且該組細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，s期細(xì)胞所占比例減少(P<0.05)；sw480-Pyk2(-)組大腸癌細(xì)胞調(diào)往率明顯降低，并且該組細(xì)胞增殖加快，s期細(xì)胞所占比例增加(P<0.05)； sw480-vector組細(xì)胞的凋亡和增殖則沒有明顯變化(P>0.05)。提示Pyk2與大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有密切關(guān)系，它能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抑制大腸癌細(xì)胞從靜息狀態(tài)(G0/G1)到S期過渡，從而抑制大腸癌細(xì)胞的增殖。這進(jìn)一步印證了Pyk2可能是大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，它起著抑癌作用。

目前，Pyk2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚不十分明了，本研究認(rèn)為，Pyk2可能是通過促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖而發(fā)揮其抑癌作用，這為進(jìn)一步研究Pyk2在大腸癌中的作用打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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The preliminary study on the mechanism of Pyk2 in colorectal cancer

ZHANG Zongnai CHANG Yingbin

General Surgery Department,Civil Aviation General Hospital,Peking 100123，P.R.China

Objective To explore the mechanism of proline-rich protein tyrosine kinase-2 (Pyk2) in human colorectal carcinoma.Methods Recombined plasmids pcDNA4.1/Zeocins constructed with sense and antisense Pyk2 cDNA were stably transfected into sw480 cells, respectively.The changes in apoptosis and cell cycle were determined by Flow cytometry (FCM).Results The apoptosis rate of SW480 cells transfected with Pyk2 cDNA plasmid was significantly higher than the control group, the number of cells distributed in s stage decreased significantly; while the apoptosis rate of cells transfected with antisense Pyk2 plasmid was significantly lower than that of the control group,and the number of cells distributed in s stage increased significantly.Conclusion Pyk2 could up-regulate the apoptosis level of sw480 cells,while lower its proliferation .

colorectal carcinoma,Pyk2,proliferation,apoptosis,transfection

常迎彬,E-mail: annianzhang@126.com

R735.3

A

1001-9510(2016)05-0330-03

2016-05-09)