劉海艷　奚偉星　洪瑛　柴瑞

[摘要] 目的 初步探討人CCR9基因?qū)W480結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲功能的影響。 方法 取人外周血單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增提取CCR9的CDS序列，連接pLVX-puro質(zhì)粒，Lipo2000感染人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，嘌呤霉素篩選并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。免疫印跡證實(shí)CCR9基因在SW480結(jié)腸癌細(xì)胞高效表達(dá)。 Transwell方法檢測(cè)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲。 結(jié)果 免疫印跡證實(shí)成功構(gòu)建pLVX-puro-CCR9質(zhì)粒，相比SW480細(xì)胞組，CCR9過(guò)表達(dá)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中CCR9顯著表達(dá)[（26.0±10.7） vs （10.0±4.5），n=8，P=0.0078]，且在體外能夠促進(jìn)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲（P=0.0136）。 結(jié)論 成功構(gòu)建CCR9穩(wěn)定表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株，并能夠在體外顯著促進(jìn)其侵襲功能。

[關(guān)鍵詞] 趨化因子受體；CCR9；分子克??；侵襲；SW480結(jié)腸癌細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）25-0001-03

Influence of over-expressed CCR9 on invasion of SW480 colon cancer cells

LIU Haiyan1 XI Weixing1 HONG Ying1 CHAI Rui2

1.Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou 310012， China； 2.Department of Anorectal Surgery， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To primarily explore the influence of human CCR9 gene on invasion function of SW480 colon cancer cells. Methods PBMC total RNA was extracted and reversely transcribed as cDNA， then amplified to extract CDS sequence of CCR9， which was then connected to pLVX-puro plasmid and Lipo2000 to infect human SW480 colon cancer cells， and screened by puromycin to establish stable transfection cell line. The over-expression of CCR9 gene in SW480 colon cancer cells was confirmed by western blotting. Transwell was used to detect invasion of colon cancer cells. Results PLVX-puro-CCR9 plasmids were successfully established as confirmed by western blotting. Compared with the SW480 cell group， CCR9 was significantly expressed in the CCR9 over-expression SW480 colon cancer cells [（26.0±10.7） vs （10.0±4.5）， n=8， P=0.0078]， and could facilitate invasion of SW480 colon cancer cells in vitro（P=0.0136）. Conclusion Colon cancer cell line with stable-expressed CCR9 can be successfully established， which can significantly facilitate the invasion function in vitro.

[Key words] Chemokine receptor； CCR9； Molecular clone； Invasion； SW480 colon cancer cell

趨化因子受體是一類(lèi)介導(dǎo)趨化因子執(zhí)行生物學(xué)功能的GTP蛋白耦聯(lián)的跨膜受體，常表達(dá)于免疫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上。它由細(xì)胞外N端、3個(gè)細(xì)胞外環(huán)和C端三個(gè)部分組成。趨化因子與細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合后可參與多種生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、組織損傷以及惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等[1，2]。自從2002年以來(lái)已有大量文獻(xiàn)表明趨化因子受體與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，其中研究最為廣泛的是CXCR4趨化因子受體，其能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[3]。近期文獻(xiàn)表明CCR9在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，在肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移、前列腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及肝癌和乳腺癌細(xì)胞株的惡性生物學(xué)功能中具有促進(jìn)作用[3]，但在結(jié)腸癌方面，是否能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的惡性生物學(xué)功能還未見(jiàn)相關(guān)研究。本研究擬構(gòu)建過(guò)表達(dá)CCR9基因的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，并通過(guò)抗生素篩選在SW480細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，并采用Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的生物學(xué)功能影響。

1材料與方法

1.1 結(jié)腸癌細(xì)胞和質(zhì)粒菌株

人SW480細(xì)胞購(gòu)于武漢細(xì)胞庫(kù)，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。DH5α菌株大腸桿菌購(gòu)自杭州優(yōu)寧維生物有限公司，pLVX-puro慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。

1.2 試劑

BamH I和 EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶（貨號(hào)：1605和1040A，日本Takara公司）；質(zhì)粒抽提試劑盒（貨號(hào)：B518191，上海生工公司）；胎牛血清（貨號(hào)：SH300700，美國(guó)Hyclone公司）；T4連接酶（貨號(hào)：2011A，日本Takara公司）；人CCR9一抗（貨號(hào)：ab32556，美國(guó)Abcam公司）；有基質(zhì)膠的Transwell（貨號(hào)：356234，美國(guó)Corning公司）；人淋巴細(xì)胞分離液（貨號(hào)：DKW-KLSH-0100，深圳達(dá)科為生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng) SW480結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2孵育箱貼壁培養(yǎng)，每隔3 d傳代1次。

1.3.2 構(gòu)建pLVX-puro-CCR9融合質(zhì)粒 （1）CCR9的CDS序列獲取 取健康人外周血5 mL，人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），在Pubmed公共數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得CCR9的CDS編碼區(qū)序列https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_031200.2，在克隆引物前后分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，用pfu聚合酶擴(kuò)增CCR9的全長(zhǎng)CDS序列，引物由上海生工公司合成。（2）pLVX-puro-CCR9-SW480穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 取健康人外周血PBMC的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。將pLVX-puro質(zhì)粒和PCR電泳回收產(chǎn)物分別雙酶切并電泳回收，用T4連接酶連接，將質(zhì)粒進(jìn)行DH5α大腸桿菌轉(zhuǎn)化，細(xì)菌固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。將1×105 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞接種于12孔板中，4 μg pLVX-puro-CCR9質(zhì)?；?0 μL Lipo脂質(zhì)體分別用250 μL無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基液稀釋并孵育30 min，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)孵育6 h。6 h后吸去培養(yǎng)液加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基，72 h后用含有0.25 μg/mL嘌呤霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基篩選瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，再挑取單克隆轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。再用0.10 μg/mL嘌呤霉素維持篩選，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 免疫印跡檢測(cè)CCR9蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)量濃度后加含溴酚藍(lán)的上樣緩沖液，100℃變性3 min后進(jìn)行免疫印跡。脫脂奶粉封閉0.5 h，再分別用β-actin及CCR9一抗室溫孵育2 h。PBS緩沖液清洗5次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗并室溫孵育1 h，PBS清洗5次后進(jìn)行顯影并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4 過(guò)表達(dá)CCR9對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響 將0.5×105/mL的SW480和pLVX-puro-CCR9-SW480細(xì)胞加至Transwell上室中。下室加DMEM高糖完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)36 h后取出小室后甲醇固定5 min，結(jié)晶紫染色20 min，最后用雙蒸水清洗并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)分析SW480和CCR9-SW480細(xì)胞之間蛋白表達(dá)水平及侵襲之間的差異，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后CCR9的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞CCR9蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示β-actin和CCR9在42 kD和45 kD有特異性黑色條帶。CCR9-SW480細(xì)胞組較SW480組顏色顯著加深（圖1A），統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示CCR9-SW480細(xì)胞中CCR9的蛋白表達(dá)量（灰度值：26.0±10.7，n=8）較SW480組（灰度值：10.0±4.5，n=8）顯著升高（P=0.0078）。

2.2 CCR9對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外侵襲能力的影響

Transwell結(jié)果顯示CCR9顯著促進(jìn)SW480細(xì)胞體外侵襲能力（圖2A、B），SW480或CCR9-SW480細(xì)胞每組隨機(jī)抽取8個(gè)視野計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示CCR9體外能夠顯著增強(qiáng)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力（P=0.0136）。

3 討論

結(jié)腸癌作為全世界常見(jiàn)惡性腫瘤之一，每年有新發(fā)病例近120萬(wàn)人，已成為全球第四致死性惡性腫瘤，其中結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是其主要原因。結(jié)腸癌伴有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者長(zhǎng)期生存率至今無(wú)法令人滿(mǎn)意。結(jié)腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位主要是肝臟，約50%患者術(shù)前或術(shù)后會(huì)發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移。其中30%患者在手術(shù)前已有影像學(xué)檢測(cè)到陰匿性肝轉(zhuǎn)移。但只有15%的患者適合手術(shù)切除，其中70%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)[4]。因此探討結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)度侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移具有重要的臨床意義。

趨化因子受體是一類(lèi)介導(dǎo)趨化因子行使功能的GTP蛋白耦聯(lián)的跨膜受體，通常表達(dá)于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上。2001年Muller A首次提出了腫瘤細(xì)胞可以利用趨化因子及其受體的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)器官特異性轉(zhuǎn)移。目前，已有大量文獻(xiàn)表明趨化因子受體在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要作用，但關(guān)于CCR9研究較少，少量文獻(xiàn)報(bào)道CCR9及其配體CCL25相互作用，在肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移、前列腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及肝癌和乳腺癌細(xì)胞株的惡性生物學(xué)功能中具有促進(jìn)作用[5-8]，且CCR9的拮抗劑在白血病移植瘤小鼠模型中發(fā)揮治療作用[7，8]。但CCR9在結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中是否具有重要作用[9-11]及其在結(jié)腸癌的腫瘤微環(huán)境中扮演怎樣的角色還未明確，是否通過(guò)增加結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性增殖，還是通過(guò)其侵襲或者轉(zhuǎn)移功能來(lái)增加結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，還需要大量的研究去證實(shí)并闡明這些設(shè)想[12-16]，以便像其他趨化因子受體，為后期設(shè)計(jì)拮抗CCR9的小分子藥物做生物學(xué)功能的鋪墊[17-20]。

在本研究中，首先成功構(gòu)建并建立穩(wěn)定表達(dá)CCR9的結(jié)腸癌細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡證實(shí)CCR9能夠在SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并通過(guò)鋪有基質(zhì)膠的Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)CCR9在結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)CCR9可以促進(jìn)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲，很有可能在結(jié)腸癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能扮演重要角色，從而，為下一步體外和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能研究作了實(shí)驗(yàn)鋪墊。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Li B，Wang Z，Zhong Y，et al. CCR9-CCL25 interaction suppresses apoptosis of lung cancer cells by activating the PI3K/Akt pathway[J]. Med Oncol，2015，32（3）：66.

[2] Tu Z，Xiao R，Xiong J，et al. CCR9 in cancer：Oncogenic role and therapeutic targeting[J]. J Hematol Oncol，2016， 9：10.

[3] Zhang Z，Sun T，Chen Y，et al. CCL25/CCR9 signal promotes migration and invasion in hepatocellular and breast cancer cell lines[J]. DNA Cell Biol，2016，35（7）：348-357.

[4] Winawer SJ. The history of colorectal cancer screening：A personal perspective[J]. Dig Dis Sci，2015，60（3）：596-608.

[5] Krishnamoorthy V，Carr T，De Pooter RF，et al. Repression of Ccr9 transcription in mouse T lymphocyte progenitors by the Notch signaling pathway[J]. J Immunol，2015，194（7）：3191-3200.

[6] Lee S，Heinrich EL，Li L，et al. CCR9-mediated signaling through beta-catenin and identification of a novel CCR9 antagonist[J]. Mol Oncol，2015，9（8）：1599-1611.

[7] Chamorro S，Vela M，F(xiàn)ranco-Villanueva A，et al. Antitumor effects of a monoclonal antibody to human CCR9 in leukemia cell xenografts[J]. MAbs，2014，6（4）：1000-1012.

[8] Wu W，Doan N，Said J，et al. Strong expression of chemokine receptor CCR9 in diffuse large B-cell lymphoma and follicular lymphoma strongly correlates with gastrointestinal involvement[J]. Hum Pathol，2014，45（7）：1451-1458.

[9] Heinrich EL，Arrington AK，Ko ME，et al. Paracrine activation of chemokine receptor CCR9 enhances the invasiveness of pancreatic cancer cells[J]. Cancer Microenviron，2013，6（3）：241-245.

[10] Zhang Z，Qin C，Wu Y，et al. CCR9 as a prognostic marker and therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2014，31（4）：1629-1636.

[11] Ye LF，Huang J，Zhang LP，et al. Intracellular expression profile and clinical significance of the CCR9-CCL25 chemokine receptor complex in nasopharyngeal carcinoma[J]. J Laryngol Otol，2015，129（10）：1013-1019.

[12] Song Lee Y，Kim SY，Song SJ，et al. Crosstalk between CCL7 and CCR3 promotes metastasis of colon cancer cells via ERK-JNK signaling pathways[J]. Oncotarget，2016，10：9209.

[13] Salerno EP，Olson WC，Mcskimming C，et al. T cells in the human metastatic melanoma microenvironment express site-specific homing receptors and retention integrins[J]. Int J Cancer，2014，134（3）：563-574.

[14] Vela M，Aris M，Llorente M，et al. Chemokine receptor-specific antibodies in cancer immunotherapy：Achievements and challenges[J]. Front Immunol，2015，6：12.

[15] Zhong Y，Jiang L，Lin H，et al. Expression of CC chemokine receptor 9 predicts poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma[J]. Diagn Pathol，2015，10：101.

[16] Pal J，Patil V，Mondal B，et al. Epigenetically silenced GNG4 inhibits SDF1alpha/CXCR4 signaling in mesenchymal glioblastoma[J]. Genes Cancer，2016，7（3-4）：136-147.

[17] Rosero RA，Villares GJ，Bar-Eli M. Protease-activated receptors and other G-protein-coupled receptors：The melanoma connection[J]. Front Genet，2016，7：112.

[18] Pozzobon T，Goldoni G，Viola A，et al. CXCR4 signaling in health and disease[J]. Immunol Lett，2016，177：6-15.

[19] Skovdahl HK，Granlund A，Ostvik AE，et al. Expression of CCL20 and its corresponding receptor CCR6 is enhanced in active inflammatory bowel disease，and TLR3 mediates CCL20 expression in colonic epithelial cells[J].PLoS One，2015，10（11）：e0141710.

[20] Wang H，Tao L，Qi KE，et al. CXCR7 functions in colon cancer cell survival and migration[J]. Exp Ther Med，2015， 10（5）：1720-1724.

（收稿日期：2016-05-20）