王春曉 胡永紅 楊文革 等

摘要：通過(guò)地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對(duì)不同病原菌平板抑制試驗(yàn)以及在植物上的定殖試驗(yàn)，初步研究其抑菌作用。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌對(duì)番茄葉霉病菌有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；平板抑制；生物防治

中圖分類號(hào)：S476+.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）04-0904-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.022

The Control Effect of Bacillus licheniformis NJWGYH 833051

WANG Chun-xiao， HU Yong-hong， YANG Wen-ge， WU Gang， GU Peng-fei， DING Zhi-wen， CHEN Zhao-guo

（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering， Nanjing Tech University， Nanjing 211816， China）

Abstract： The control effect of Bacillus licheniformis was preliminary studied through B. licheniformis of different pathogens tablet inhibition experiment and its colonization in the plant. The results showed that the B. licheniformis had good inhibition to Fulvia fulva.

Key words： Bacillus licheniformis； tablet inhibition； biological control

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）分布廣泛，空氣、土壤和其他各種環(huán)境中都有分布，其生理和生化特性也多種多樣，在其生存環(huán)境如植物微生態(tài)和土壤中是一種優(yōu)勢(shì)菌種，具有廣泛的應(yīng)用前景。地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)[1-3]包括溶菌酶、細(xì)菌素、抗菌蛋白和各種抗生素[4]（包括磷脂類、氨基酸類、核酸類、脂肽類、肽類、多烯類）等，對(duì)很多病原微生物具有很好的抑制作用。化學(xué)農(nóng)藥的大量使用造成了殘留物污染，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和食品安全造成威脅[5-9]。地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)某些病原菌具有很好的抑制作用，可以應(yīng)用在生物農(nóng)藥的研究生產(chǎn)上[10，11]。因此，研究地衣芽孢桿菌的抑菌作用，為高效綠色生物農(nóng)藥研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌種為地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051，由南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)與化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保存；番茄早疫病菌、白菜黑斑病菌、辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄枯萎病菌[10，11]均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

供試植物為日本美玉番茄，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

①平板培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5、蛋白胨10、瓊脂20、氯化鈉5、pH 7.0～7.2、去離子水1 000 mL、121 ℃滅菌。②液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15、蛋白胨10、牛肉膏5、氯化鈉5、硫酸錳1、磷酸二氫鉀2、硫酸鎂0.5、pH 7.0～7.2、去離子水1 000 mL、121 ℃滅菌。③PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂15～20、去離子水1 000 mL、pH 7.0、121 ℃滅菌。④LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏5、蛋白胨10、NaCl 10、去離子水1 000 mL、pH 7.0、121 ℃滅菌。⑤YPGA固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨5、葡萄糖5、酵母膏5、瓊脂20、去離子水1 000 mL、pH 7.0、121 ℃滅菌。

菌體代謝液的配制：從平板接種1環(huán)菌液到裝有80 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，按照以上最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h，制備發(fā)酵液，濃度為108 cfu/mL。

菌懸液的配制：取部分上述發(fā)酵液， 10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，保留菌液，經(jīng)干燥測(cè)定其效價(jià)，然后用無(wú)菌水配制菌懸液，濃度為108 cfu/mL。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)不同病原菌的平板抑制試驗(yàn)

1）含地衣芽孢桿菌平板的配制。從平板接種1環(huán)菌液到裝有80 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，按照以上最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，培養(yǎng)24 h，制備發(fā)酵液，此后按一定的比例添加到冷卻至40 ℃平板的培養(yǎng)基中，在超凈臺(tái)上傾注平板，制成含菌體平板備用。

2）含藥及對(duì)照平板的配制。以多菌靈和腐霉利為陽(yáng)性對(duì)照。以0.02 mol/L的稀鹽酸稀釋溶解多菌靈制備成母液，在LB培養(yǎng)基中添加合適的劑量，混合均勻，在超凈臺(tái)上傾注平板，制成含藥平板備用；以丙酮溶解稀釋腐霉利原藥制成濃度為1 000 μg/mL的母液，在培養(yǎng)基中添加合適的劑量，混合均勻，在LB超凈臺(tái)上傾注平板，制成含藥平板備用。

將直徑為0.5 cm病原菌的菌碟菌絲朝下，分別接種在上述3種培養(yǎng)皿中。置于25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)空白對(duì)照菌落鋪滿平板2/3以上時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量各平板的菌落直徑，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)菌落直徑確定藥劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率。

病原菌生長(zhǎng)抑制率=（空白菌落直徑-處理菌落直徑）/（空白菌落直徑-菌餅直徑）×100%

3）番茄葉片離體試驗(yàn)。采摘同一株番茄上兩個(gè)葉片，放入裝有三片用無(wú)菌水浸濕濾紙的平板中，放入光照培養(yǎng)箱中，25 ℃，濕度70%，在兩個(gè)葉片上同時(shí)接種番茄葉霉病菌，其中一個(gè)噴灑地衣芽孢桿菌菌液，另一個(gè)則作為空白對(duì)照。

1.2.2 地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在植物上的定殖試驗(yàn)

1）在番茄葉表的定殖試驗(yàn)。溫室育苗，盆缽單株移栽，待番茄苗長(zhǎng)到20 cm左右時(shí)，取在YPGA培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h的利福平標(biāo)記菌株的菌液，噴霧接種于番茄葉片上，設(shè)不接菌為對(duì)照。每批處理24棵苗，罩膜保溫，光照12 h，溫度18～25 ℃。初始菌量設(shè)定為處理1 h后分離取樣菌體的數(shù)量，此后分別在1、3、5、7、11、15、21 d后取樣分離。

在噴菌的番茄植株上用無(wú)菌刀片隨機(jī)取20 cm2葉片，剪碎，用100 mL無(wú)菌水振蕩洗滌碎片30 min，隨后進(jìn)行梯度稀釋，不同稀釋度洗滌液取0.1 mL進(jìn)行平板涂布，PDA平板含有400 μg/mL的利福平，每個(gè)稀釋梯度涂布3塊平板，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌落數(shù)，并對(duì)其在番茄葉表的定殖數(shù)量（菌量用cfu/cm2表示）進(jìn)行換算。

2）在番茄根部的定殖試驗(yàn)。溫室育苗，盆缽單株移栽，待番茄苗長(zhǎng)到20 cm左右時(shí)，取在YPGA培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h的利福平標(biāo)記菌株的菌液，灌根接種于番茄根部，每株澆灌10 mL，設(shè)不接菌為對(duì)照。每批處理24棵苗。罩膜保溫，光照12 h，溫度18～25 ℃。

處理1 h后取樣分離作為初始菌量，分別在1、3、5、7、11、15、21 d后取樣分離1次。取樣時(shí)將苗拔出，取根部土壤5 g，采用無(wú)菌水洗滌振蕩30 min，然后進(jìn)行梯度稀釋，在含利福平濃度為400 μg/mL的PDA平板中，傾注0.1 mL不同稀釋度洗滌液并進(jìn)行涂布，每個(gè)稀釋梯度涂布3個(gè)平板，36 ℃下培養(yǎng)24 h后，測(cè)定每個(gè)平板的菌落數(shù)，并換算成在番茄根部的定殖數(shù)量（菌量用cfu/g表示）。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌對(duì)不同病原菌的平板抑制作用

2.1.1 對(duì)不同病原菌的平板抑制試驗(yàn) 為考察地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051的抑菌效果，以多菌靈和腐霉利作為對(duì)照，將不同病原菌進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，未離心的地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發(fā)酵液可以有效抑制番茄葉霉病菌，當(dāng)劑量為106 cfu/mL時(shí)對(duì)其的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)87.15%，略低于多菌靈藥劑的抑菌效果；地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051離心后對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率為51.36%，與對(duì)照藥劑腐霉利的抑制率相當(dāng)；地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發(fā)酵液未離心時(shí)對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率高于對(duì)照藥劑腐霉利的抑制率，達(dá)60.23%。地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對(duì)部分病原菌的抑菌效果見(jiàn)表1、圖1、圖2。

2.1.2 番茄葉片離體試驗(yàn) 以離體番茄葉片為研究對(duì)象，考察了地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對(duì)番茄葉霉病菌的抑菌效果，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，1號(hào)對(duì)照葉片接種番茄葉霉病菌后3 d，其接種附近葉面開(kāi)始霉變，而用地衣芽孢桿菌噴灑過(guò)的2號(hào)葉片顏色依然較綠，變化不大，說(shuō)明地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對(duì)番茄葉霉病菌有較好的抑制作用。

2.2 地衣芽孢桿菌在番茄上的定殖效果

2.2.1 地衣芽孢桿菌在番茄葉表的定殖效果 地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051能在番茄葉面上定殖，但隨時(shí)間延長(zhǎng)葉面上定殖的菌量會(huì)有所降低，定殖效果如圖4所示。由圖4可以看出，在0～30 d，噴灑地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051菌株在番茄葉面定殖菌數(shù)為1.30×106～2.47×106 cfu/cm2鮮葉。地衣芽孢桿菌噴灑處理4 d后，菌株可能對(duì)環(huán)境不適應(yīng)，菌數(shù)下降到1.81×106 cfu/cm2鮮葉，噴灑處理后第7天有1個(gè)菌數(shù)高峰，菌數(shù)達(dá)到2.24×106 cfu/cm2鮮葉，這可能是由于地衣芽孢桿菌繁殖能力和定殖能力很強(qiáng)，逐漸適應(yīng)了環(huán)境，在短期內(nèi)形成了種群優(yōu)勢(shì)。在后期，菌數(shù)趨于平穩(wěn)，可能是葉片原有微生物恢復(fù)競(jìng)爭(zhēng)力以及環(huán)境因素導(dǎo)致其菌數(shù)下降，最后趨向于平衡。

2.2.2 地衣芽孢桿菌在番茄根部的定殖效果 地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在番茄根部定殖效果如圖5所示。由圖5可以看出，地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051能在番茄根部很好地定殖，但隨時(shí)間延長(zhǎng)根部定殖的菌量會(huì)有所降低。地衣芽孢桿菌在土壤中20 d內(nèi)菌量由8.26×106 cfu/g下降到2.73×106 cfu/g。處理一周后，菌量下降，表明地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)環(huán)境改變后，產(chǎn)生了不適應(yīng)；處理11 d后，菌量有所增加，說(shuō)明地衣芽孢桿菌已經(jīng)適應(yīng)了新環(huán)境，在番茄根部進(jìn)行了定殖。隨后菌量逐漸下降，可能因?yàn)橥寥乐形⑸锱c地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，最后菌量到達(dá)平衡，20 d后，菌量保持在2.69×106 cfu/g左右，表明地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051可以在番茄根際生長(zhǎng)繁殖。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)考察了地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051對(duì)番茄早疫病菌、白菜黑斑病菌、番茄葉霉病菌、番茄枯萎病菌、番茄灰霉病菌5種致病菌的抑菌效果，結(jié)果表明，未離心的地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發(fā)酵液可以有效抑制番茄葉霉病菌，當(dāng)劑量為106 cfu/mL時(shí)對(duì)番茄葉霉病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)87.15%，抑菌效果略低于多菌靈藥劑。地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051離心后對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率為51.36%，與對(duì)照藥劑腐霉利的抑制率51.49%接近，地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051發(fā)酵液未離心時(shí)對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率高于對(duì)照藥劑腐霉利的抑制率51.49%，達(dá)到60.23%。通過(guò)地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在番茄葉面與根際的定殖效果試驗(yàn)，表明地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051在番茄表面和根際的定殖能力良好，為其發(fā)揮良好的生物防治作用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究證實(shí)了地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051具有抑菌效果，芽孢桿菌往往同時(shí)產(chǎn)生多種對(duì)特定病原菌具有很高活性的抑菌活性物質(zhì)，從地衣芽孢桿菌中分離純化出具有活性的抑菌物質(zhì)對(duì)于新型生物農(nóng)藥的研制具有深遠(yuǎn)意義。后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步研究地衣芽孢桿菌的抑菌機(jī)理，并將探索提取發(fā)酵液中的蛋白類抑菌活性物質(zhì)的方法，對(duì)提取出的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和鑒定。

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