謝體波 易重任 陳旭 等

摘要：建立了黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒檢測的方法，并通過對食用油、花生、谷物中黃曲霉毒素B1測定進行驗證。結(jié)果表明，在25 ℃條件下加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標(biāo)二抗反應(yīng)30 min變異性最?。籈LISA試劑盒檢測靈敏度高，對食用油、谷物、花生樣品中黃曲霉毒素B1最低檢測限分別為88.82 ng/L和48.51、176.56 ng/kg；平均回收率和變異系數(shù)符合相關(guān)規(guī)定；與高效液相色譜法相比，檢測結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；ELISA試劑盒；食用油；花生；玉米

中圖分類號：R155.5；TS201.6 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-1008-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.048

Establishment and Validation of Aflatoxin B1 ELISA Kit Test Method in Foods

XIE Ti-bo1，YI Zhong-ren1，CHEN Xu1，LIU Tian-lei1，ZHANG Lei1，WEI Li-li1，

LUO Gui-kun1，TAO Guang-can1，HE Fang-yang1，2

（1. Gui Zhou Kwinbon Food Safety Science-Technology Co.， Ltd.， Guiyang 550009，China；

2.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.， Ltd.， Beijing 100012，China）

Abstract：This experiment has established the detection method of aflatoxin B1 whit ELISA kit，and based on the determination of aflatoxin B1 in cooking oil， peanuts，corn was validated，the results show that under the condition of 25 ℃，50 μL standard solution，50 μL antibody working liquid， 50 μL enzyme mark two antibody reacted 30min，variability was minimum；ELISA kit is high detection sensitivity，the aflatoxin B1 minimum detection limit in samples of cooking oil，corn，peanuts，were 88.82 ng/L，48.51 ng/kg，176.56 ng/kg；The average recovery and variation coefficient in accordance with relevant provisions and HPLC.

Key words： aflatoxin B1； ELISA kit； edible oil； peanut； maize

黃曲霉毒素（AFT）是由寄生曲霉和黃曲霉在生長的后期分泌產(chǎn)生的一類次生代謝物，是自然界中已發(fā)現(xiàn)的理化性質(zhì)最穩(wěn)定的一類霉菌毒素[1]，具有極強毒性和致癌性。黃曲霉毒素在濕熱地區(qū)飼料和食品中出現(xiàn)的幾率較高，尤其是在谷物和糧油食品中出現(xiàn)的幾率極高，導(dǎo)致榨出的油及飼料中也含有黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1在曲霉毒素群中的毒性最強，分布最廣[2]。

目前對食品、農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[3]、色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）[4]、薄層色譜法[5]、熒光光譜法（FS）[6]和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[7]等。ELISA是測定黃曲霉毒素含量的常用方法，所涉及的儀器及試劑比較少，操作比較簡單，被很多企事業(yè)單位所采用[8]。本試驗建立了ELISA對黃曲霉毒素B1的檢測方法，并通過對食用油、花生、谷物中黃曲霉毒素B1的檢測驗證了該方法的精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等，以期為黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒的制備提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與主要試劑 食用油、花生、谷物均為市售；黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒，北京勤邦生物技術(shù)有限公司；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，美國Sigma公司；抗體工作液，酶標(biāo)二抗，底物A液和B液，終止液，PBST洗液；乙腈、乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、濃鹽酸、十二水合磷酸氫二鈉均為分析純，北京化學(xué)試劑公司；去離子水（自制）。

1.1.2 主要儀器 8010S勻漿機，MK3酶標(biāo)儀，DSY-Ⅲ氮吹儀，2000-SBL電子天平，KS-I1振蕩器，Anke GL-20G-lI高速離心機，QL-901漩渦混合器，微量移液器（單道20～200 μL、100～1 000 μL，多道250 μL ）：Anglent 1200高效液相色譜儀。

1.2 檢測方法的建立

1.2.1 加樣方式的確定

1）分別向板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液，用常規(guī)抗體稀釋液稀釋1∶2×104的抗體和用常規(guī)酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋1∶2 000的酶標(biāo)二抗，振蕩混勻，25 ℃避光反應(yīng)30 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反應(yīng)20 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)。

3）分別測定零標(biāo)準(zhǔn)品OD值、谷物樣本OD值、0.36 μg/kg谷物OD值、0.18 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品OD值，以零標(biāo)準(zhǔn)OD值為1.5～2.0、谷物樣本OD值與零標(biāo)準(zhǔn)品OD值偏差小、0.36 μg/kg陽性谷物樣品的OD值與0.18 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品OD值偏差小、0.18 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品OD值相對較小為判定標(biāo)準(zhǔn)，確定較好的加樣方式。

1.2.2 反應(yīng)溫度的確定

1）向板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液50 μL，用常規(guī)抗體稀釋液稀釋1∶2×104的抗體50 μL和用常規(guī)酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋1∶2 000的酶標(biāo)二抗50 μL，振蕩混勻，4、25 ℃下避光反應(yīng)30 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反應(yīng)20 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)。

3）分別測定零標(biāo)準(zhǔn)品OD值、0.02 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品OD值、谷物樣本OD值，計算抑制率，以零標(biāo)準(zhǔn)品OD值為1.5～2.0，谷物樣本OD值接近零標(biāo)準(zhǔn)品OD值，抑制率在70%～80%為判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇較好的反應(yīng)溫度。

1.2.3 抗原、抗體、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定

1）向板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL、用常規(guī)抗體稀釋液稀釋1∶2×104的抗體50 μL和用常規(guī)酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋1∶2 000的酶標(biāo)二抗50 μL，振蕩混勻，25 ℃下避光反應(yīng)15、30、60 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反應(yīng)20 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)；

3）測定零標(biāo)準(zhǔn)品OD值，重復(fù)3次，每次做6個對照孔，計算不同反應(yīng)時間測定值的變異度CV（%）。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1）根據(jù)上述選定的加樣方式、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間為分析條件，用0、0.02、0.06、0.18、0.54、1.62 μg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行ELISA檢測，測定OD值。

2）以黃曲霉毒素B1濃度為橫坐標(biāo)，各對應(yīng)濃度的抑制率（%）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)線性方程計算IC50。

以優(yōu)化的ELISA條件，對所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)，根據(jù)測定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定零標(biāo)準(zhǔn)品OD值、IC50、變異系數(shù)、R2、0.02 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品抑制率及對空白谷物樣本添加0.36 μg/kg的回收率。

1.3 樣本前處理

1.3.1 食用油樣本 吸取200 μL樣本至2 mL聚苯乙烯離心管中；加入1 mL復(fù)溶工作溶液，加入0.5 mL正己烷，振蕩5 min，室溫離心5 min；除去上層正己烷相，取下層50 μL用于分析。

1.3.2 谷物、花生樣本 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱?。?.0±0.05） g樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中；加入3.0 mL乙腈，再加入3.0 mL去離子水，振蕩5 min，室溫離心5 min；移取3.0 mL上層清液至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入4.5 mL三氯甲烷，振蕩5 min，室溫離心5 min；去除上層液體，取3 mL下層有機相至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60 ℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL正己烷，渦動30 s溶解干燥殘留物，加入1 mL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動30 s，室溫離心5 min；除去上層正己烷相，取下層水相50 μL用于分析。

1.4 ELISA檢測試劑盒技術(shù)參數(shù)的確定

1.4.1 試劑盒靈敏度的確定 分別測定3個批次試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50抑制濃度，確定該值浮動范圍。檢測限（LOD）計算公式如下：

LOD=X+3×■

式中，X為重復(fù)測定空白樣品的平均值，n為樣品數(shù)量。

1.4.2 試劑盒特異性的測定 選擇與黃曲霉毒素B1類似結(jié)構(gòu)的3種物質(zhì)，將不同濃度的黃曲霉毒素B1類似物，替代黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算IC50抑制濃度，計算交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率=

■×100%

1.4.3 試劑盒精密度和準(zhǔn)確度的測定 取食用油樣品分別添加100、200和400 ng/L黃曲霉毒素B1，取花生樣品分別添加200、400和800 ng/kg黃曲霉毒素B1，取谷物樣品分別添加50、100和200 ng/kg黃曲霉毒素B1，每種樣品、每個濃度各6次重復(fù)，用試劑盒提供的操作方法提取測定。抽取3批試劑盒，每批試劑盒測定同一份樣品2次，分別計算測定樣品的回收率及批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

隨機抽取花生、谷物樣本各20份，分別用本試劑盒方法和儀器方法進行檢測。儀器方法參考文獻[9]中的第三法高效液相色譜法（對花生、谷物中黃曲霉毒素B1的檢出限為0.5 μg/kg）。

將制備好的試劑盒保存于2～8 ℃環(huán)境下，分別在8個時間段（第0、1、2、3、6、9、12、15月）取出做保存試驗，測定其IC50，添加100、200、400 ng/L食用油的回收率，添加200、400、800 ng/kg花生的回收率，添加50、100、200 ng/kg谷物的回收率；并將試劑盒保存于37 ℃和-20 ℃環(huán)境中，在4個時間段（第0、3、6、9天）取出做加速和凍融試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 加樣方式的確定

由表1可知，當(dāng)加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標(biāo)二抗進行反應(yīng)時，零標(biāo)準(zhǔn)品OD值在1.5～2.0之間，谷物樣本OD值與零標(biāo)準(zhǔn)品OD值偏差較小，0.36 μg/kg陽性谷物樣品的OD值與0.18 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品OD值偏差較小，故該方式為較好的加樣方式。

2.2 反應(yīng)溫度的確定

由表2可知，加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標(biāo)二抗于25 ℃下避光反應(yīng)，測定的零標(biāo)準(zhǔn)品OD值在1.5～2.0之間，0.02 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率在70%～80%之間，谷物樣品的OD值與零標(biāo)準(zhǔn)品OD值偏差較小，故選擇反應(yīng)溫度為25 ℃。

2.3 反應(yīng)時間的確定

由表3可知，加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、抗體50 μL、酶標(biāo)二抗50 μL，25 ℃反應(yīng)30 min，零標(biāo)準(zhǔn)品OD值均在1.5～2.0，且變異相對較小，故反應(yīng)時間確定為30 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以優(yōu)化的ELISA條件，對所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)，試驗結(jié)果見表4和圖1。

2.5 試劑盒靈敏度的確定

由表5結(jié)果可知，黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50的波動范圍為47.5～63.1 ng/L。

對陰性食用油、花生、谷物樣品進行20次檢測，測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差即為試劑盒檢測實際樣品的最低檢測限，結(jié)果見表6。由表6可以看出，本試劑盒對食用油的最低檢測限為88.82 ng/L，對花生的最低檢測限為176.56 ng/kg，對谷物的最低檢測限為48.51 ng/kg。

2.6 試劑盒特異性的測定

試驗測得與黃曲霉毒素B1結(jié)構(gòu)相似的3種物質(zhì)黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的交叉反應(yīng)率分別為81.3%、62%、22.3%。

2.7 試劑盒精密度和準(zhǔn)確度的測定

對食用油樣品分別添加100、200和400 ng/L 3個濃度的黃曲霉毒素B1，樣品回收率為66.5%～93.2%；對花生樣品分別添加200、400和800 ng/kg 3個濃度的黃曲霉毒素B1，樣品回收率為66.6%～93.0%；對谷物樣品分別添加50、100和200 ng/kg 3個濃度的黃曲霉毒素B1，樣品回收率為65.8%～93.8%。批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。

2.8 與儀器方法的比較

以0.5 μg/kg為陽性判定線，低于陽性判定線的值，檢測結(jié)果以“—”表示，高于或等于陽性判定線的值以實際檢測結(jié)果表示（表7）。由表7可以看出，試劑盒檢測結(jié)果與儀器檢測結(jié)果相吻合。

2.9 試劑盒的穩(wěn)定性

從表8中可看出，將試劑盒保存在2～8 ℃條件下，各樣品的陽性回收率都較高，可以一直保存12個月；在37 ℃和-20 ℃條件下保存時間都較短。

3 結(jié)論

本研究制備了黃曲霉毒素B1 ELISA快速檢測試劑盒，得出了制備該試劑盒的最佳條件，以食用油、谷物、花生為樣本，驗證了該檢測試劑盒的檢測效果，并將其檢測結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果做了對照。結(jié)果表明，在25 ℃條件下加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標(biāo)二抗反應(yīng)30 min變異性最小；ELISA試劑盒檢測靈敏度高，對食用油、谷物、花生樣品中黃曲霉毒素B1最低檢測限分別為88.82 ng/L和48.51、176.56 ng/kg；平均回收率和變異系數(shù)符合相關(guān)規(guī)定；與高效液相色譜法相比，檢測結(jié)果一致。ELISA試劑盒耗時短，樣品前處理方法簡單、檢測設(shè)備投資少、成本低，能夠滿足批量產(chǎn)品中黃曲霉毒素的快速檢測。

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