黃松林 胡德夫 陳 力 黃俊華 陳健東

(1. 北京林業(yè)大學自然保護區(qū)學院，北京，100083；2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京，100091；3. 廣西瑋美生物科技有限公司，南寧，530105)

食蟹猴芯片標記實效評價

黃松林1，2胡德夫1*陳 力2黃俊華3陳健東3

(1. 北京林業(yè)大學自然保護區(qū)學院，北京，100083；2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京，100091；3. 廣西瑋美生物科技有限公司，南寧，530105)

食蟹猴；芯片標記；實效評價

植入式無源微芯片廣泛應(yīng)用于動物個體的標記，在管理CITES附錄物種活體標本方面具有較大潛力。采用無源芯片對食蟹猴進行皮下植入式標記，掃描、監(jiān)測芯片在食蟹猴體內(nèi)的狀態(tài)和效果，觀察和研究芯片植入對食蟹猴的影響，發(fā)現(xiàn)芯片游走率為6%；當植入時間長于6個月時，代碼可識讀的個體1 057只，占90.11%；掃描不出代碼但可觸摸到芯片(芯片斷裂或損壞)的個體60只，占5.12%；掃描不出代碼也觸摸不到芯片的個體56只，占4.77%。評價食蟹猴芯片標記的實際效果和適用性，總結(jié)現(xiàn)存的主要問題，研究并提出有關(guān)食蟹猴芯片標記技術(shù)規(guī)范的建議。

食蟹猴(MacacaFascicularis)又名長尾猴或爪哇猴，在動物分類學上屬于靈長目(Primates)、猴科(Cercopithecidae)、獼猴屬，主要分布于泰國、老撾、緬甸、馬來西亞、越南、柬埔寨、印度尼西亞、菲律賓及印度尼科巴島，棲息于熱帶雨林、紅樹林沼澤、潮汐河流沿岸等熱帶島嶼、海濱[1]，屬瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅱ物種。因生物學特性與人類極為相似，而且易于規(guī)模化飼養(yǎng)，食蟹猴已成為解決人類健康和疾病問題的基礎(chǔ)醫(yī)學研究、臨床研究的理想動物模型[2-3]。據(jù)中國實驗靈長類養(yǎng)殖開發(fā)協(xié)會統(tǒng)計，2007年11月全國有實驗猴養(yǎng)殖企業(yè)32家，存欄量為14.5萬只，其中食蟹猴12萬只[4]。2015年底，全國實驗猴養(yǎng)殖企業(yè)超過40家，存欄數(shù)量也有明顯增長。

為促進馴養(yǎng)繁殖檔案管理，規(guī)范實驗猴的養(yǎng)殖銷售，打擊非法經(jīng)營，國家林業(yè)局于2004年發(fā)布了《關(guān)于加強實驗用猴管理有關(guān)問題的通知》(林護發(fā)〔2004〕124號)，要求對人工養(yǎng)殖的實驗猴進行活體標記。實踐中采用的標記手段為皮下植入微芯片(microchip)[5]，也稱為無源電子標簽(Tag)或者無源應(yīng)答器(passive integrated transponder，PIT)，屬于RFID(射頻識別：radio frequency identification)系統(tǒng)的一部分[6-7]。該芯片置于和生物組織共容的生化玻璃管中，注寫有標記代碼。玻璃管長約12 mm，直徑2.12 mm。一套完整的RFID系統(tǒng)，由閱讀器(Reader)、電子標簽(Tag)及應(yīng)用軟件3個部分組成[8]。RFID基本原理為：電子標簽進入磁場后，接收閱讀器發(fā)出的射頻信號，憑借感應(yīng)電流所獲得的能量激發(fā)出存儲在標簽中的代碼等信息；閱讀器讀取信息并解碼后，送至中央信息系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理[9]。

植入式微芯片在管理公約附錄物種活體標本方面具有較大潛力[10]。1992年在日本京都召開的第8屆CITES締約國大會提議使用植入式微芯片對貿(mào)易中的活體動物進行標記。隨著科技的進步，越來越多的國家開始陸續(xù)采用電子標簽對動物原產(chǎn)地及養(yǎng)殖、防疫、檢疫、監(jiān)督等環(huán)節(jié)進行記錄和追蹤[11-12]，進而把有無追溯手段作為限制動物及其制品進口的貿(mào)易壁壘措施[13]。芯片因其防水、防磁、耐高溫、使用壽命長、數(shù)據(jù)穩(wěn)定、非接觸式讀取、多目標識別和移動識別等優(yōu)勢已成為野生動物活體標記的重要手段[14]，10余年來在我國實驗猴的飼養(yǎng)管理中發(fā)揮了重要作用。然而，其適用性和效果卻從未停止爭論[15-16]。

本文利用無源芯片對食蟹猴進行皮下植入式標記，掃描、監(jiān)測芯片在食蟹猴體內(nèi)的狀態(tài)和效果，觀察和研究芯片植入對食蟹猴的影響。通過大量的實驗數(shù)據(jù)評價了食蟹猴芯片標記的實際效果和適用性，總結(jié)現(xiàn)存的主要問題，并就確保標記效果不可或缺的操作規(guī)范提出了建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗動物包括：待植入芯片的活體食蟹猴100只，年齡13～14個月，體況健康；已植入芯片的死體食蟹猴50只，年齡2～10歲；已植入芯片的活體食蟹猴1 173只，年齡2～6歲，體況健康。

1.1.2 儀器和物品

實驗所用儀器和物品包括：植入式芯片(規(guī)格12 mm×2.12 mm，符合ISO11784/11785)；芯片閱讀器(ETAG-R01，閱讀距離≤5 cm)；X光機(GPX50重慶華倫)及數(shù)字化影像轉(zhuǎn)換器(柯尼卡190CS-2CR)；以及照相機、動物解剖器械、碘伏消毒劑、棉球、75%酒精；《實驗靈長類動物活體標記個體信息表》和記錄紙。

1.2 方法

1.2.1 新植入芯片跟蹤監(jiān)測

選取未植入芯片的活體食蟹猴100只，年齡13～14個月。按照國家林業(yè)局野生動植物研究與發(fā)展中心2007年發(fā)布實施的《活體野生動物植入式芯片標記技術(shù)規(guī)程》(試行)的要求在食蟹猴的左大腿外側(cè)皮下植入芯片。植入完畢后，使用X光機照射定位，記錄植入芯片的位置。

芯片植入后，觀察動物植入部位的反應(yīng)情況并做記錄，1次/d，連續(xù)10 d。芯片植入之日起3個月后，觸摸檢查芯片情況并再次使用X光機照射，確定芯片位置。同時，使用閱讀器掃描芯片代碼。

1.2.2 死體食蟹猴芯片檢查

選擇已正常植入芯片的死體食蟹猴50只，動物死亡時間不超過12 h。對植入芯片的部位進行解剖，詳細觀察芯片與周圍組織的關(guān)聯(lián)情況，包括芯片的完整性、留存位置，植入部位和留存組織是否有炎癥或其他病變反應(yīng)等情況。

1.2.3 早期植入芯片跟蹤監(jiān)測

選取已正常植入芯片6個月以上的活體食蟹猴1 173只，進行植入部位芯片觸摸和外觀檢查，并使用閱讀器進行掃描，核對芯片代碼，檢驗芯片的有效性和動物的身體反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片植入與掃描

芯片定位對比：通過X光線片的定位和比對發(fā)現(xiàn)，100只食蟹猴植入芯片后第3個月，芯片與原植入位置基本保持一致(移位距離≤2 cm)的有94只(圖1)。與原植入部位對比，芯片發(fā)生游走(移位距離>2 cm)的個體有6只(圖2)。實驗結(jié)果顯示，芯片植入后的游走率為6.0%。芯片游走的6只食蟹猴個體，其芯片仍處于左大腿外側(cè)皮下，總體位置未改變。通過觸摸和觀察，確認芯片所處位置已相對穩(wěn)定。

圖1 食蟹猴芯片位置對比X光片(未游走)Fig.1 The X-rays comparson of microchip in the body of cynomolgus monkeys(No shift)

芯片閱讀對比：通過使用閱讀器(型號ETAG-R01，閱讀距離≤5 cm)，全部100只食蟹猴(含6只芯片移位的個體)的芯片代碼均可正常閱讀，說明其性能良好。

圖2 食蟹猴芯片位置對比X光片(游走)Fig.2 The X-rays comparson of microchip in the body of cynomolgus monkeys(Shift)

2.2 標記部位檢查

對最近植入芯片的100只活體食蟹猴，跟蹤觀察其芯片植入部位的反應(yīng)情況并做記錄，1次/d，連續(xù)10 d，確認芯片植入部位(左大腿外側(cè))注射針口的愈合完好，未發(fā)現(xiàn)植入?yún)^(qū)域紅腫、感染或者個體表現(xiàn)異常。自植入3個月后再觀察，亦未發(fā)現(xiàn)植入?yún)^(qū)域或個體任何異常。

選取因其他原因死亡的已植入芯片并能準確掃描讀取芯片代碼的食蟹猴50只，對其芯片植入部位解剖檢查。檢查結(jié)果顯示，芯片保持原有的形態(tài)和色澤，植入?yún)^(qū)域及周圍肌肉等組織正常，未發(fā)現(xiàn)炎癥、腫物等異常情況(圖3)。

對已植入芯片(植入時間大于6個月)的1 173只食蟹猴進行芯片掃描，核對芯片代碼，掃描結(jié)果為：代碼可識讀的個體1 057只，占90.11%；掃描不出代碼但能觸摸到芯片的(芯片斷裂或損壞)的個體60只，占5.12%；掃描不出代碼也觸摸不到芯片(芯片可能不存在)的個體56只，占4.77%。通過肉眼觀察，1 173只食蟹猴的左大腿外側(cè)均未發(fā)現(xiàn)植入針口痕跡或其他損傷印記。

圖3 死體食蟹猴解剖后的芯片及組織Fig.3 The microchip in the body of die cynomolgus monkeys

3 討論

上述實驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，芯片植入后的性能穩(wěn)定，除物理性損壞或丟失外均可正常識讀；芯片植入后的位置總體上相對穩(wěn)定，即使游走也不影響后期識讀。因此，可以認為芯片植入對于食蟹猴標記具備較高的有效性。并且，規(guī)范化的芯片標記未對食蟹猴個體造成炎癥等健康損害，對其正常生長、繁育和活動無不良影響，是安全、適用的活體標記方式。芯片植入后可以正常閱讀，取決于3個因素：其一，芯片功能正常；其二，閱讀器功能正常；其三，芯片處于閱讀器的有效掃描范圍。新植入芯片的100只食蟹猴，其芯片均可正常閱讀，說明其同時滿足上述3個要求。即使6枚芯片發(fā)生游走，但移位距離尚在可閱讀范圍。

食蟹猴芯片標記現(xiàn)存的主要問題：一是芯片植入后因植入部位皮膚較薄，芯片易遭食蟹猴物理性破壞，導(dǎo)致?lián)p壞或丟失。對此，可以考慮在食蟹猴成年(大于18個月齡)后再行芯片標記，同時提高芯片玻璃管的耐損性和強度，或是改變植入式芯片的規(guī)格，嘗試使用市場已有的8 mm×2.12 mm、8 mm×1.4 mm、7 mm×1.25 mm等規(guī)格更小的芯片。二是芯片植入體內(nèi)后存在一定比例(6.0%)的游走現(xiàn)象，對后續(xù)掃描效率可能造成影響。不過，隨著閱讀器技術(shù)的改進，芯片閱讀距離和效率顯著提高，該問題可以通過使用功率更大的閱讀器得以最大程度避免，因而可以忽略。

芯片植入后是否游走，主要取決于3個因素：其一是植入部位選擇是否科學；其二是植入操作是否規(guī)范；其三是動物的體型及自身活動。對于花鼠，其耳后皮膚松弛，皮下對標簽的容留性好且注射不易出血，比其他部位更適合進行注射[17]。對于樹鼩，頸背部皮下植入標簽則較適宜[18]。植入部位的選擇要考慮盡量避免動物正?；顒訝恳酒莆?。食蟹猴體型小，喜攀爬和跳躍，其左大腿外側(cè)中央皮下是芯片植入的較好部位。芯片植入環(huán)節(jié)應(yīng)當嚴格按照技術(shù)規(guī)范的要求執(zhí)行，確保芯片以恰當角度植入到皮下而非肌肉，且在注射拔針環(huán)節(jié)不被拖帶而出。

掃描不出芯片代碼但可觸摸到芯片的60只個體，芯片已斷裂破損。破損原因主要是食蟹猴啃咬、前肢反復(fù)抓撓。由于食蟹猴特別是幼體的皮膚較薄，芯片植入之后在皮膚表面會有相應(yīng)凸痕，芯片作為外來異物具有較明顯的存在感，且食蟹猴對身體各個部位掌握靈活，芯片植入之后難以避免被抓撓或啃咬。掃描不出芯片代碼也觸摸不到芯片的56只個體，可能的原因包括：其一，芯片確已丟失，可能在植入拔針環(huán)節(jié)被拖帶而出，或者在針口閉合前被植入個體反復(fù)抓撓而丟失。其二，芯片掃描不成功，與掃描方法和閱讀器的功率相關(guān)，ETAG-R01閱讀器也稱為口袋型閱讀器，功率小，掃描距離最遠僅為5 cm，如手持閱讀器的角度偏離，或者芯片移位較大，很難在原有部位有效掃描；現(xiàn)有大功率閱讀器的掃描距離可達35 cm左右，但本次實驗因開展較早而均未采用。如采用，在芯片功能正常的情況下，即使嚴重游走，對于體型較小的食蟹猴而言完全可以掃描出芯片代碼。其三，芯片已斷裂壞損且未觸摸到，如芯片破碎嚴重且被皮下脂肪包裹，不但無法掃描，而且確實難以觸及。

總的來說，食蟹猴個體嬌小、皮膚較薄，懸掛、攀爬、跳躍活動較多，且作為具備較高智商的靈長類動物，對于異物的識別和排斥能力強，因此需要針對性地制定一個“食蟹猴活體芯片標記技術(shù)規(guī)范”，使其芯片標記的操作規(guī)范化，以提高芯片植入的成功率和體內(nèi)留存的有效性。該規(guī)范至少應(yīng)包含以下內(nèi)容。

(1)標記位置：左大腿外側(cè)中央皮下。

(2)剃毛消毒：將食蟹猴左大腿外側(cè)的被毛剔除(約為1 cm×3 cm)，以暴露其皮膚并有效消毒。

(3)植入芯片：左手食指和拇指捏住植入部位皮膚后適當提起，右手持芯片注射器，針頭與皮膚約呈5°角(盡量平行于皮膚)進針，待針頭斜面完全進入皮下1 cm后，推壓注射器柄將芯片植入皮下。進針過短芯片易掉落，過長則可能造成動物傷害。

(4)壓迫止血：芯片植入完畢，用干棉簽輕壓進針口再拔出針頭，持續(xù)壓迫2～3 min止血。

(5)掃描核對：植入后用閱讀器掃描芯片，確定已成功植入動物體內(nèi)并核對芯片代碼。

(6)記錄檔案：填寫《實驗靈長類動物活體標記個體信息表》，并由專人做好檔案的保存和管理。

[1] Sussman R W，Tattersall I.Distribution，abundance，and putative ecological strategy ofMacacafascicularison the island of Mauritius，southwestern Indian Ocean[J].Folia Primatologica，1986，46(1)：28-43.

[2] Patton D L，Sweeney Y C，Tsai C C，et al.Macacafascicularisvs.Macacanemestrinaas a model for topical microbicide safety studies[J].Journal of Medical Primatology，2004，33(2)：105-108.

[3] 石巧娟，李巍，薩曉嬰.食蟹猴在醫(yī)學研究中的應(yīng)用進展[J].實驗動物與比較醫(yī)學，2012，32(4)：358-365.

[4] 曾峰波，宋慧剛.中國實驗猴養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對策初探[J].野生動物，2007，28(3)：58-59.

[5] Hellebuyck T，Pasmans F，Van Caelenberg A，et al.Assessing the use of microchip transponders as a marking method in juvenile Hermann’s tortoises(Testudohermanni)[J].Journal of Herpetological Medicine and Surgery，2013，23(1)：32-36.

[6] Connette G M，Semlitsch R D.Successful use of a passive integrated transponder(PIT)system for below-ground detection of plethodontid salamanders[J].Wildlife Research，2012，39(1)：1-6.

[7] Suselbeek L，Jansen P A，Prins H H T，et al.Tracking rodent‐dispersed large seeds with passive integrated transponder(PIT)tags[J].Methods in Ecology and Evolution，2013，4(6)：513-519.

[8] Cousin X，Daouk T，Péan S，et al.Electronic individual identification of zebrafish using radio frequency identification(RFID)microtags[J].Journal of Experimental Biology，2012，215(16)：2729-2734.

[9] Bridge E S，Bonter D N.A low‐cost radio frequency identification device for ornithological research[J].Journal of Field Ornithology，2011，82(1)：52-59.

[10] Floyd R E.RFID in animal-tracking applications[J].IEEE Potentials，2015，34(5)：32-33.

[11] 孫艷霞，錢恒.渝滬等地為野生動物植入RFID芯片[J].中國自動識別技術(shù)，2008(2)：39.

[12] 洪云平，曾三杰.生物芯片技術(shù)在動物檢疫中的應(yīng)用研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2010，37(12)：140-142.

[13] Kretser H E，Wong R，Roberton S，et al.Mobile decision-tree tool technology as a means to detect wildlife crimes and build enforcement networks[J].Biological Conservation，2015，189：33-38.

[14] 章雪明.植入式電子標識在動物信息管理中的應(yīng)用實例[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2012，28(7)：75.

[15] Guimaraes M，Corrêa D T，Sérgio Filho S，et al.One step forward：contrasting the effects of toe clipping and PIT tagging on frog survival and recapture probability[J].Ecology and Evolution，2014，4(8)：1480-1490.

[16] Soanes K，Vesk P A，van der Ree R.Monitoring the use of road-crossing structures by arboreal marsupials：insights gained from motion-triggered cameras and passive integrated transponder(PIT)tags[J].Wildlife Research，2015，42(3)：241-256.

[17] 楊慧，馬建章，戎可.被動式電子標簽用于花鼠種群動態(tài)研究的可行性[J].生態(tài)學報，2013，33(20)：6634-6642.

[18] 江勤芳，匡德宣，孫曉梅，等.電子芯片在樹鼩管理中的應(yīng)用[J].實驗動物科學，2013，29(6)：39-41.

Cynomolgus monkey；Microchip mark；Mffect evaluation

Effect Evaluation of Microchip Mark on Cynomolgus Monkey

Huang Songlin1,2Hu Defu1*Chen Li2Huang Junhua3Chen Jiandong3

(1. College of Natural Conservation，Beijing Forestry University，Beijing，100083，China；2. Institute of Forest Ecology Environment and Protection，Chinese Academy of Forestry，Beijing，100091，China；3. Guangxi Weimei Biotechnology Co.Ltd，Nanning，530105，China)

Implantable passive microchips are widely used to mark and identify animals，and have great potential in the management of live animal species whose trade is restricted by CITES.Passive chips were implanted subcutaneously into cynomolgus monkeys(Macacafascicularis)for individual identification.We scaned and monitored the function and effect of chip implantation.We recorded the status and performance of the chips，and found the proportion of chips that migrated was 6%.After implantation for longer than six months，the code of 1 057 chips implanted in cynomolgus monkeys could be read，accounting for 90% of total implants.Chip codes of 60 monkeys could not be scanned or read，but the presence of the chips could be sensed by palpation.This was attributed to chip fracture or damage，which accounted for 5% of total implants.The code of 56 chips could not be scanned and the presence of the chips could not be sensed by palpation，accounting for 5% of total implants.We evaluated the results and applicability of chip implants and the main problems.The reasons for chip marking of cynomolgus monkeys are summarized and compared，chip operating standards for experimental monkeys are proposed.

稿件運行過程

2016-02-19

修回日期：2016-04-07

發(fā)表日期：2016-08-10

S865

A

2310-1490(2016)03-195-05

黃松林，男，39歲，助理研究員；主要從事野生動植物標識標記技術(shù)服務(wù)與管理。

*通訊作者：胡德夫，E-mail：hudf@bjfu.edu.cn