李自青，邢雁霞，劉 宏?

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009)

IDO介導(dǎo)肺癌細(xì)胞免疫逃逸的實(shí)驗(yàn)研究

李自青1,2，邢雁霞1,2，劉 宏1,2?

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009)

目的探討吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）介導(dǎo)肺癌的免疫逃逸機(jī)制。方法通過混合培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549和T淋巴細(xì)胞，RT-PCR檢測IDOmRNA在細(xì)胞中的表達(dá)；以IL-2為細(xì)胞刺激因子，有或無1-甲基色氨酸(1-MT)條件下，建立單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)體系（MLR），MTT法檢測T細(xì)胞活力，并采用ELISA試劑盒檢測IDO活性。結(jié)果IDOmRNA在單獨(dú)培養(yǎng)A549細(xì)胞中不表達(dá)，在T淋巴細(xì)胞中微量表達(dá)，而在A549細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的混合體系中高表達(dá)；而且混合單向淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中，IDO的表達(dá)能夠使T淋巴細(xì)胞增殖受到抑制。結(jié)論A549細(xì)胞在混合培養(yǎng)體系中表達(dá)的IDO能有效抑制外周血T細(xì)胞增殖，可能參與肺癌免疫逃逸。

吲哚胺2，3雙加氧酶；肺癌細(xì)胞；免疫逃逸

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，可誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫耐受，而免疫調(diào)節(jié)酶吲哚胺2，3雙加氧酶（Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）可能參與了這種免疫耐受。IDO是催化色氨酸在肝臟外沿犬尿酸分解代謝途徑的限速酶，參與多種病理生理過程，如自身免疫、感染以及抗腫瘤反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)IDO在人類多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸，是一種免疫抑制分子[1]。有研究將人白血病細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在IL-2的刺激下T淋巴細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，而IDO的特異性抑制劑1-甲基色氨酸(1 methyl Tryptophan，1-MT)能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞對T細(xì)胞刺激的敏感性，從而增強(qiáng)外周血T淋巴細(xì)胞增殖[2]。本研究在以上研究的基礎(chǔ)上，將肺癌細(xì)胞A549與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察混合體系中T淋巴細(xì)胞在抗肺癌的免疫應(yīng)答中IDO的作用，來探討IDO參與的肺癌免疫逃逸機(jī)制，從而為臨床上治療肺癌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

A549細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，EasySep/人全血CD3＋細(xì)胞分選試劑盒購自加拿大StemCell公司，人IDO酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，健康人外周血10mL購自大同市血液中心，PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將新鮮的健康人外周血用等量生理鹽水稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，1.077 g/mL）離心（400 r/min，20 min）分離淋巴細(xì)胞，用10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/L。取分離的淋巴細(xì)胞，采用EasySep/人全血CD3＋細(xì)胞分選試劑盒，免疫磁珠分選的方法，分離出T淋巴細(xì)胞，重懸于10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

1.3 細(xì)胞的混合培養(yǎng)

含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)A549細(xì)胞，增殖狀態(tài)良好的細(xì)胞A549加胰酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，然后取1×104細(xì)胞A549接種6孔板，12 h后在每孔中分別加1×107T細(xì)胞。反應(yīng)24 h后，每組收集貼壁細(xì)胞（A549細(xì)胞），洗滌離心后備用。

1.4 IDO的表達(dá)

1.4.1 總RNA提取

TRIZOL一步法提細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測A 260/A 280值，鑒定RNA的純度。

1.4.2 cDNA第一鏈的合成

5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，核糖核酸酶抑制劑1 μL，總RNA 5 μg，寡聚T引物0.5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL(200 U)，總體積20 μL。反應(yīng)條件：42℃水浴90 min，然后70℃水浴10 min。

1.4.3 RT-PCR

根據(jù)GenBank中的IDO cDNA序列設(shè)計(jì)引物[3]。IDO上游引物：5’-GCGCTGTTGGAAATAGCTTC-3’；下游5’-CAGGACGTCAAAGCACTGAA-3’；擴(kuò)增的片段為234 bp。β-actin為內(nèi)參，上游引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’；下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’;擴(kuò) 增 產(chǎn)物268 bp。反應(yīng)體系：10× PCR buffer 5μL,2 mmol/L dNTP 5 μL，cDNA 2 μL，0.2 μmol/L 上游及下游引物各1 μL,Taq DNA 聚合酶1μl(5 U),25 μmol/L MgCl 2 4 μL，0.2 μmol/L 內(nèi)參上下游引物各 1 μL，總體積為50 μL；退火溫度為60℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 T細(xì)胞活力檢測

分別取2×104A549細(xì)胞和2×105T淋巴細(xì)胞，接種96孔板進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），并加入200 U/mL的IL-2，同時(shí)實(shí)驗(yàn)1組加1 mmol/L的1-MT，實(shí)驗(yàn)2組不加1-MT。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，以1640完全培養(yǎng)液、T淋巴細(xì)胞和A549細(xì)胞培養(yǎng)作對照。在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，加MTT液（5 mg/mL）20 μL，再培養(yǎng)6 h，離心棄上清，加100 μL DMSO震蕩5 min，在490 nm處測定吸光度(A)值。T細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值-1)×100%。

1.6 IDO活性檢測

從MLR混合體系中收集A549細(xì)胞，用PBS（pH 7.2～ 7.4）稀釋至1× 106，3 000 r/min，離心20 min，收集上清。用ELISA試劑盒檢測IDO活性，操作按說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示每組數(shù)據(jù)，組間比較用LSD檢驗(yàn)，P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 IDOmRNA表達(dá)

經(jīng)RT-PCR檢測，結(jié)果表明IDOmRNA在單獨(dú)培養(yǎng)的A549細(xì)胞中不表達(dá)，在T淋巴細(xì)胞中少量表達(dá)，而在混合體系中A549細(xì)胞高表達(dá)IDOm-RNA（見圖1）。

圖1 細(xì)胞中IDO mRNA的表達(dá)

2.2 T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活力檢測

單向MLR培養(yǎng)觀察T細(xì)胞的增殖結(jié)果表明，在生長因子IL-2刺激下，單獨(dú)培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞增殖率為(62.4±3.2)%。無1-MT時(shí)，混合培養(yǎng)MLR體系中T淋巴細(xì)胞增殖率為(20.1±3.4)%；有1-MT時(shí)，共培養(yǎng)MLR體系中T淋巴細(xì)胞增殖率為(58.3±2.4)%，二者比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 IDO活性檢測

IDO活性檢測結(jié)果顯示，無1-MT的MLR體系中IDO活性為(60.2±8.2)%；加入1-MT后，IDO活性為(15.1±3.2)%，二者比較差異顯著(P＜0.05)。單獨(dú)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測不到IDO活性。

3 討論

目前，肺癌的治療主要采用手術(shù)、放療及化療，研究顯示IDO能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對抗γ輻射、順鉑和奧拉帕尼，而IDO在肺癌組織以及非惡性增殖的肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在肺癌細(xì)胞系中表現(xiàn)為低表達(dá)，導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良[4]。有研究發(fā)現(xiàn)部分腫瘤細(xì)胞能夠高表達(dá)IDO，從而抑制了局部T淋巴細(xì)胞的增殖，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)攻擊[5]。康璇等研究IDO介導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的免疫逃逸，發(fā)現(xiàn)HepG2表達(dá)的IDO能抑制外周T淋巴細(xì)胞的增殖從而發(fā)揮其抗腫瘤免疫的作用[6]。唐曉瓊等探討了IDO在白血病細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示白血病細(xì)胞表達(dá)的IDO活性能抑制外周T淋巴細(xì)胞增殖[7]。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了在肺癌細(xì)胞A549和T淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中，肺癌細(xì)胞高表達(dá)的IDO活性能夠抑制外周T淋巴細(xì)胞增殖，可能參與了肺癌免疫耐受；而IDO特異性抑制劑1-MT能降低IDO活性，從而促進(jìn)外周血T細(xì)胞增殖。這一研究可能為肺癌的臨床免疫治療提供新的思路。

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[3]Que Z,Zou F,Zhang A,et al.Ganoderic acid Me induces the apoptosis of competent T cells and increases the proportion of Treg cells through enhancing the expression and activation of indoleamine 2,3-dioxygenase in mouse lewis lung cancer cells[J].Int Immunopharm-acol,2014,23(1)：192-204.

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〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity in lung cancer Cells Contributing to Tumor Immune Escape

LI Zi-qing1,2,XIN Yan-xia1,2,LIU Hong1,2?
(1.Medical School,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009；2.Respiratory and Occupational Disease Research Institute,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

Objective Investigating the immune escape mechanism of 2-and 3-(IDO)-mediated lung cancer.Methods Lung cancer A549 cells and T lymphocytes were mixed culture and IDOmRNA expression was detected by RT-PCR;Then one-way lymphocytes mixed reaction(MLR)was carried out,cytokines IL-2 was used as stimulation in culture without or with 1-MT.MTT assay was used to detect the viability of T cells and IDO activity in ELISA kit.Results IDO expression was not found in A549 cells cultured alone,was expression of trace in T-lymphocyte,but IDO expression in mixed system of A549 cell A,and expression levels were separately cultured T lymphocytes.In mixed lymphocyte reaction of one-way,the expression of IDO can inhibit the proliferation of T lymphocytes.Conclusions The expression of IDO in mixed culture of A549 cells can inhibit the proliferation of T cells in peripheral blood,which may lead to immune escape of lung cancer.

Indoleamine 2,3-dioxygenase;lung cancer;immune escape

R734.2

A

1674-0874(2016)03-0048-03

2016-03-28

大同市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目[201361]

李自青(1980-)，女，碩士，講師，研究方向：分子生物學(xué)與腫瘤免疫學(xué)。*劉宏，男，博士，教授，通信作者。