楊凡慧，曹齡之，黃曉紅，張春銀，楊朝鮮

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川南充637000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川瀘州646000；西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究室，四川瀘州646000）

姜黃素治療大鼠腦出血后血清IL-6、IL-1β、TNF-α變化的實(shí)驗(yàn)研究

楊凡慧1，曹齡之1，黃曉紅1，張春銀2，楊朝鮮3

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川南充637000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川瀘州646000；西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究室，四川瀘州646000）

目的 本研究旨在探索大鼠腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）用姜黃素治療后血清IL-6、IL-1β、TNF-α變化情況，評(píng)價(jià)姜黃素在治療腦出血中的抗炎價(jià)值，從而為臨床應(yīng)用姜黃素治療腦出血提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法 24只健康雄性成年SD大鼠，單純隨機(jī)分為術(shù)前正常對(duì)照組（A組），腦出血姜黃素治療組（B組），腦出血空白對(duì)照組（C組），假手術(shù)組（D組），每組6只大鼠。立體定位下右側(cè)基底節(jié)注射膠原酶法制備大鼠腦出血模型。于建模成功后6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d，給各組大鼠尾靜脈取血測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α。將B組與C組、D組的IL-6、IL-1β、TNF-α值行兩樣本t檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 B組的神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分較相應(yīng)時(shí)期的C組低，較相應(yīng)時(shí)期的D組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平在術(shù)后6h即升高，3d達(dá)最高水平，隨后開(kāi)始逐漸恢復(fù)，且各個(gè)時(shí)期的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較同時(shí)期C組低，較同時(shí)期的D組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 姜黃素能加快大鼠腦出血后血清炎癥因子的吸收，對(duì)大鼠腦出血有抗炎作用。

腦出血； 姜黃素； IL-6； IL-1β； TNF-α

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中最具破壞性的一種類型，在30天內(nèi)的病死率高達(dá)30% ～40%，一年內(nèi)的病死率達(dá)47%［1-2］。迄今為止尚未見(jiàn)有明確療效的方法治療該疾病，從而造成很大的社會(huì)問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜科植物姜黃（curcuma longa L.）中提取出來(lái)的一種酚類化合物，最新研究表明它有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用［3］。本研究旨在觀察大鼠腦出血用姜黃素治療后血清炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）變化情況，評(píng)價(jià)姜黃素在治療腦出血中的抗炎價(jià)值，從而為臨床應(yīng)用姜黃素有效治療腦出血提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材料與方法

1 動(dòng)物

選取24只健康雄性成年SD大鼠（西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)Ⅱ級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2013-17），2～3月齡，體重250～350g。自由進(jìn)食、進(jìn)水，12h明暗交替光照。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均按西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求進(jìn)行，盡可能的減少動(dòng)物的使用數(shù)量，最大程度的較少動(dòng)物遭受的痛苦。

2 試劑

2.1姜黃素 購(gòu)于成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司。產(chǎn)品規(guī)格AR。分子式：C21H20O6。分子量：368.37?；瘜W(xué)性質(zhì)：橙黃色結(jié)晶粉末，溶于冰醋酸、乙醇，淺黃色沉淀和姜黃素在堿沉淀，在濃硫酸中有紅色和黃色的可溶性，不溶于水。貯存條件-20℃。溶解度（ethanol）：10 mg/mL。色指數(shù)：75300。熔點(diǎn)：183℃。密度：0.93。折射率：1.4155-1.4175。

2.2膠原酶Ⅳ 購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司提供。產(chǎn)品規(guī)格 BR。CAS號(hào)：9001-12-1。儲(chǔ)存條件-20℃。產(chǎn)品編號(hào)：C8160（分裝于C5138）。

3 儀器

3.1電動(dòng)吸引器 類型：YB·DX30/0.09，由天津市醫(yī)療器械生產(chǎn)二廠生產(chǎn)。

3.2湘儀離心機(jī) 型號(hào)：DL-6M，尺寸：730cm ×840cm×1200cm，最大容量：6×1000mL，最大轉(zhuǎn)速6000r/min，儀器種類：大容量/低速冷凍，由湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)。

3.3γ放射免疫計(jì)數(shù)器 型號(hào)：SN-695，由上海核所日環(huán)光電儀器有限公司提供。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1大鼠腦出血模型制備 大鼠腦出血模型采用膠原酶Ⅳ緩慢注射右側(cè)基底節(jié)區(qū)出血模型。按照Takamatsu Y等［4］的方法進(jìn)行改進(jìn)，常溫下給予大鼠1%的戊巴比妥鈉（60mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，待呼吸平穩(wěn)后，俯臥位固定腦于立體定位儀上，保持前囟和后囟在同一水平，頭頂部剪毛、消毒，頭皮正中切口10mm，5μL微量進(jìn)樣器固定在定位儀上，以前囟為原點(diǎn)，定位進(jìn)針（前囟前0.2mm，頭尾正中線右側(cè)旁開(kāi)3mm），并做一記號(hào)。取下微量進(jìn)樣器，用顱鉆在記號(hào)處鉆孔達(dá)硬腦膜表面。5μL微量進(jìn)樣器抽取Ⅳ型膠原酶2μL（0.125 U/μL），重新固定在腦立體定位儀上，沿著鉆孔進(jìn)針，并以顱骨外板為零點(diǎn)垂直進(jìn)針6mm。手動(dòng)緩慢（0.5μL/min）將Ⅳ膠原酶溶液推注入基底節(jié)區(qū)，留針10min，緩慢退針（0.5μL/ min）。骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮，待大鼠蘇醒后放回籠子。術(shù)中無(wú)菌操作。

4.2實(shí)驗(yàn)分組 建模成功后（神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分在～3分），采用單純隨機(jī)抽樣法分組，將大鼠分為3組，即姜黃素治療組（B組），腦出血空白對(duì)照組（C組），假手術(shù)組（D組），每組6只大鼠。同時(shí)隨機(jī)選用6只同級(jí)別同月齡的正常大鼠作為正常對(duì)照組（A組）。①姜黃素治療組（B組）在腦出血模型成功后立即腹腔注射姜黃素（150mg/kg，2mL，姜黃素溶于玉米油）。②空白對(duì)照組（C組）腦出血建模后，以同等體積（2 mL）的玉米油給予腹腔注射，余操作同姜黃素治療組（B組）。③假手術(shù)組（D組）用0.9%的生理鹽水代替膠原酶Ⅳ，不予治療處理，余操作同腦出血姜黃素治療組（B組）。④正常對(duì)照組（A組）不予處理。

4.3神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分 術(shù)后6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d對(duì)各組大鼠行神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分。采用神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評(píng)分（neurological severity scores，NSS）［7］：0分：神經(jīng)功能正常；1分：輕度神經(jīng)功能缺損（提尾時(shí)左前肢屈曲）；2分：中度神經(jīng)功能缺損（行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)）；3分：重度神經(jīng)功能缺損（行走時(shí)向左側(cè)傾斜）；4分：無(wú)自發(fā)行走，意識(shí)減退；5分：與出血有關(guān)的死亡

4.4炎癥因子的測(cè)定 于建模成功后6h、24h、48h、3天、5天、7天、14天，分別給A組、B組、C組、D組尾靜脈取血約1mL，離心（3500轉(zhuǎn)/分鐘）留血清，儲(chǔ)存在-20℃，用放射免疫法測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α（碘［125I］物理半衰期：60天）。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

大鼠腦出血模型建成后大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡不振，食欲欠佳，運(yùn)動(dòng)緩慢，左側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向左側(cè)內(nèi)旋轉(zhuǎn)甚至伴有全身震顫等。神經(jīng)功能損害評(píng)分：?jiǎn)我蛩胤讲罘治觯現(xiàn)= 15.253，P＜0.05，說(shuō)明四組大鼠神經(jīng)功能損害程度不全相同；姜黃素治療組（B組）在24h最嚴(yán)重，以后隨著時(shí)間的推移開(kāi)始逐漸恢復(fù)，5d以后基本恢復(fù)正常，LSD法組間比較可知，姜黃素治療組（B組）比空白對(duì)照組（C組）各時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分均低（P=0.002），比假手術(shù)組（D組）相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均高（P= 0.042），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1、圖1）。

表1　神經(jīng)功能損害評(píng)分（±s）

表1　神經(jīng)功能損害評(píng)分（±s）

注：A組為正常對(duì)照組，B組為姜黃素治療組，C組為腦出血空白對(duì)照組，D組為假手術(shù)組；每組大鼠6只

組別6h24h48h3d5d7d14d A 0000000 B1.25±0.411.92±0.311.17±0.050.75±0.280.33±0.0900 C2.17±0.323.25±0.642.67±0.232.25±0.471.50±0.361.08±0.210.50±0.09 D0.42±0.030.17±0.0400000

2 炎癥因子結(jié)果

單因素方差分析，四組大鼠血清的IL-6、IL-1β、TNF-α水平分別不全相同，其F值依次為：11.380、24.078、15.067，均P＜0.05。姜黃素治療組（B組）的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平在術(shù)后6h升高，3d達(dá)最高水平，隨后開(kāi)始恢復(fù)，LSD法組間比較可知，姜黃素治療組（B組）各個(gè)時(shí)期的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較同時(shí)期空白對(duì)照組（C組）低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表2、表3、表4和圖2、圖3、圖4）。

表2　I４L-6水平變化（±s）

表2　I４L-6水平變化（±s）

注：姜黃素治療組（B組）血清IL-6水平均較同時(shí)期空白對(duì)照組（C組）低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0220）

組別6h24h48h3d5d7d14d A125.48±5.12122.01±8.49134.28±14.93124.86±11.56122.30±11.91127.39±9.89125.97±9.52 B138.82±10.24158.17±11.33182.91±13.40208.24±18.12173.62±20.56127.80±9.4097.95±9.49 C181.77±16.64228.42±27.04245.89±28.41301.49±29.10225.31±20.15175.74±14.20151.34±6.32 D153.14±6.840137.17±11.00124.87±5.11131.43±12.59134.46±14.90125.31±15.03131.28±7.48

表3　IL-1β水平變化（±s）

表3　IL-1β水平變化（±s）

注：姜黃素治療組（B組）血清IL-1β水平均較同時(shí)期空白對(duì)照組（C組）低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.136）

組別6h24h48h3d5d7d14d A0.22±0.020.14±0.050.09±0.030.13±0.010.21±0.020.13±0.040.17±0.03 B0.42±0.070.31±0.080.22±0.100.56±0.130.32±0.060.23±0.040.16±0.05 C0.53±0.060.56±0.080.62±0.111.05±0.120.85±0.050.73±0.090.49±0.07 D0.36±0.050.25±0.040.14±0.060.22±0.030.19±0.030.16±0.020.15±0.06

表4　TNF-α水平變化（±s，fmol/mL）

表4　TNF-α水平變化（±s，fmol/mL）

注：姜黃素治療組（B組）血清TNF-α水平均較同時(shí)期空白對(duì)照組（C組）低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.218）

6h24h48h3d5d7d14d A23.39±2.0213.7±1.5617.65±1.4825.91±1.5220.40±0.9715.63±1.2218.74±1.34 B37.38±1.3628.02±1.2730.87±1.6734.23±2.0325.03±1.9720.11±1.4719.38±1.54 C43.78±2.1246.21±1.9650.59±2.2056.38±1.6749.37±1.8734.52±1.8626.62±2.05 D37.78±1.9925.52±1.5718.76±1.1322.23±2.0519.43±1.4817.82±1.9318.43±1.84

討論

腦出血后導(dǎo)致大腦的損傷有初次損傷和二次損傷，其中炎癥反應(yīng)在二次損傷中起重要作用。腦出血后炎癥細(xì)胞被激活聚集，血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等直接滲透到大腦損傷部位，通過(guò)炎癥介質(zhì)的釋放、蛋白酶激活、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活促發(fā)一系列炎癥反應(yīng)［5］。有研究表明，大鼠腦出血后可引起血腫周圍腦組織繼發(fā)性炎癥損傷與激活的NF-kB息息相關(guān)［6］，因?yàn)門(mén)oll樣受體（tolllike receptor 4，TLR4）可通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)把信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，引起一系列級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，啟動(dòng)TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［7］，而核因子-kB（nuclear factor-kappaB，NF-kB）位于TLR4下游信號(hào)通路的樞紐位置，其活化水平直接反映了TLR4的配體識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)能力［8］。促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等還可導(dǎo)致腦出血后血腦屏障的通透性的增高并加重血管源性腦水腫的發(fā)生［9］。且已有一些關(guān)于腦出血后血清中促炎細(xì)胞因子的臨床研究［10］，均表明急性期腦出血患者血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子有不同程度的升高，其升高水平與腦出血疾病的嚴(yán)重程度及患者預(yù)后情況關(guān)系密切，但其作用機(jī)理尚不是很清楚。我們觀察到用姜黃素治療腦出血后6h到14d內(nèi)血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均得到明顯改善，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)姜黃素治療前后大鼠腦出血模型中血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的變化規(guī)律，與相關(guān)的臨床研究結(jié)果聯(lián)系分析，可為T(mén)NF-α、IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子作為腦出血患者病情及預(yù)后狀況的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)入臨床做前期準(zhǔn)備。

目前已有大量關(guān)于姜黃素治療腦出血的臨床研究和基礎(chǔ)研究，如陳秀［11］等研究表明姜黃素具有抗炎作用，對(duì)急性、亞急性和慢性炎癥都具有抗炎作用，可減輕炎性組織中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制炎性細(xì)胞前炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生。King MD［12］等研究表明姜黃素通過(guò)減少促炎癥介質(zhì)、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，減輕血腦屏障的破壞及血管源性水腫，從而改善了腦出血治療情況。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的炎癥細(xì)胞，過(guò)度激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致各種促炎細(xì)胞因子的釋放，如TNF-α、IL-6、IL-1β等［13］。有研究表明姜黃素通過(guò)抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和NF-kB的激活從而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子的釋放，達(dá)到抗炎的作用［14］。

綜上，姜黃素作為一中古老的藥材，對(duì)腦出血后的抗炎作用是肯定的，隨著其治療機(jī)制的日趨完善，可向臨床治療轉(zhuǎn)化。姜黃素能加快腦出血后炎癥因子的吸收，對(duì)大鼠腦出血抗炎作用明確。

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（李 凌編輯）

The Effect of Curcumin on Inflammatory Factors in a Rat Model of Intracerebral Hemorrhage

YANG Fan-hui，CAO Ling-zhi，HUANG Xiao-hong，ZHANG Chun-yin，YANG Chao-xian
（Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China）

Objective To investigate the changes of interleukin-6（IL-6，interleukin-1β（IL-1β）and tumor necrosis factor alpha（TNF-α）expressions in rats with intracerebral hemorrhage（ICH）after curcumin treatment. Toevaluate the therapeutic effect of curcumin and to provide scientificdatafor the clinical application of curcumin on ICH.Methods A total of 24 healthy adult male rats were randomly divided into 4 groups：normal group（group A），ICH+curcumin group（group B），ICH+vehicle group（group C），and sham operated group（group D），6 rats in each group.Animal ICH model was made by injecting collagenase 2μl（0.125 u/ul）into the right caudate nucleus of rats.Every rat was withdrew blood serum from the tail vien for IL-6、IL-1β、TNF-αat 6h，24h，48h，3d，5d，7dand14d after the model was built successfully following anesthesia.The data were analyzed by Student's t test to identify the changes of levels of IL-6，IL-1β and TNF-α between group B and group C，group B and the contralateral side，group B and group D.Results At the acute stage of ICH，the neurological severity scoresin group B was significantly lower than that in group C，and but it was higher than group D.In group B：After 6 h，the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α increased and peaked at 3 d，and decreased at the next time points.Each time point of the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α in group B was lower significantly than group C，and but it was higher than group D.Conclusion Curcuminshowedeffect of anti-inflammation on ICH.It might be related to the reduced the levels of IL-6，IL-1β and TNF-α after treatment.

Intracerebral hemorrhage； Curcumin； IL-6； IL-1β； TNF-α

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.018

2016-03-18；

2016-04-23

四川省科學(xué)技術(shù)廳與瀘州市人民政府、瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合科研專項(xiàng)資金計(jì)劃項(xiàng)目（14JC0131）

張春銀，Email：zhangchunyin345@sina.com