廖春燕，許海潤，黃瑤

（1．廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2．廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西科技大學(xué)），廣西柳州545006）

貓須草多糖脫蛋白脫色工藝

廖春燕1，2，許海潤1，黃瑤1，2

（1．廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2．廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西科技大學(xué)），廣西柳州545006）

以脫蛋白率和多糖保留率為指標(biāo)，對Sevag法、三氯乙酸（TCA）法和三氯乙酸－正丁醇（TCA－NBA）法脫蛋白效果進(jìn)行比較研究；采用活性炭脫色工藝，以脫色率和多糖保留率為指標(biāo),通過單因素和正交試驗(yàn)對影響脫色的因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)．結(jié)果表明：Sevag法為3種方法中最好的脫蛋白方法，活性炭脫色的最佳條件是脫色溫度50℃，pH值等于6，活性炭用量1．5％，脫色時間20min．優(yōu)化后的貓須草多糖脫蛋白脫色工藝穩(wěn)定可靠，可為貓須草多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)．

貓須草；多糖；脫蛋白；脫色

0　引言

貓須草為唇形科（Labiatae）腎茶屬植物，學(xué)名為腎茶（Clerodendranthus spicatus）．其性涼，可煎煮入藥，服用具有排石利尿，清熱利濕的功效，多用于治療前列腺炎、乳腺癌、急慢性腎炎和腎衰竭等疾?。?－3］．主要化學(xué)成分有糖苷類化合物、黃酮類化合物、多酚類化合物等［4－6］．貓須草多糖具有多種藥理活性，在抗腫瘤、降血糖和增強(qiáng)免疫機(jī)能方面具有獨(dú)特的功效．

目前從中藥提取多糖時多采用水作為提取劑［7－9］．貓須草經(jīng)熱水浸提后得到的粗多糖常常混雜有色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，影響其進(jìn)一步的開發(fā)和利用．

本試驗(yàn)采用sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸－正丁醇法對貓須草粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理［10－14］，選擇活性炭脫色法對多糖溶液進(jìn)行脫色［15－18］，確定最優(yōu)工藝，為貓須草多糖的開發(fā)利用提供參考依據(jù)．

1　材料與方法

1．1材料與試劑

貓須草：購于柳州市中藥店，產(chǎn)地廣西；考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；活性炭：廣東省臺山市化工廠；苯酚、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷等試劑均為分析純．

1．2儀器與設(shè)備

SHZ－CD循環(huán)水式多用真空泵：上海普渡生化科技有限公司；UV－1100紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海普渡生化科技有限公司；800電動離心機(jī)：金壇市醫(yī)療儀器廠；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司．

1．3試驗(yàn)方法

1．3．1貓須草多糖提取工藝

貓須草→烘干→粉碎→按料液比1∶25（g／mL）加入溶劑→60℃回流提取3 h→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→濃縮液加入95％乙醇溶液在4℃下沉淀→無水乙醇、乙醚和丙酮洗滌沉淀后真空干燥→取適量沉淀用熱水溶解，得粗多糖溶液．

1．3．2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

多糖含量測定采用硫酸苯酚法［19］．以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝2．412 1x－0．018 6，r＝0．999 6．式中：x——葡萄糖質(zhì)量濃度（mg／mL），y——吸光度．

1．3．3多糖保留率的測定

按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定樣液的吸光度，計(jì)算樣品中多糖含量，按下式計(jì)算多糖保留率．

1．3．4蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法［20］．以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0．328 0x＋0．004 3，r＝0．999 5．式中：x——蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g／L），y——吸光度．

1．3．5脫蛋白率的計(jì)算

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定樣液的吸光度，計(jì)算樣品中多糖含量，按下式計(jì)算脫蛋白率．

1．3．6脫蛋白工藝的研究

sevag法：將氯仿與正丁醇以5∶1混合制得Sevag試劑．取20mL多糖質(zhì)量濃度為1mg／mL的粗多糖溶液，按多糖溶液∶Sevag試劑＝5∶1比例混合，劇烈振蕩，待氯仿－正丁醇試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)完全后，4 000 r／min離心分離20min，棄去沉淀收集上清液，分別測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和脫蛋白率．

三氯乙酸法（TCA法）：取質(zhì)量濃度為1mg／mL粗多糖樣品液20mL，加入0．2倍體積4％三氯乙酸溶液使之沉淀，20℃下混合25min，然后于4 000 r／min離心20min，棄去沉淀收集上清液，分別測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和脫蛋白率．

三氯乙酸－正丁醇法（TCA－NBA法）：將三氯乙酸－正丁醇按體積比1∶5混合，然后取質(zhì)量濃度為1mg／mL粗多糖溶液20mL加入等體積的三氯乙酸－正丁醇試劑，將混合物劇烈振搖30min，再靜止1 h．分去水層與溶劑層（上層）交界處的變性蛋白，重復(fù)至水相與溶劑相的交界面無膠狀變性蛋白質(zhì)．澄清液分別測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和脫蛋白率．

1．3．7脫色率的測定

將貓須草多糖樣液置于300 nm～700 nm波長下進(jìn)行可見－紫外光全波長掃描．經(jīng)掃描，貓須草多糖溶液在486 nm處有最大吸收峰；因此，選用486 nm作為貓須草多糖色素的測定波長．按下式計(jì)算脫色率：

1．3．8活性炭脫色單因素試驗(yàn)

脫色溫度對脫色效果的影響：分別取pH值為6，質(zhì)量濃度為1mg／mL的貓須草多糖溶液20mL，各加入1．5％活性炭，分別在30℃，40℃，50℃，60℃，70℃下脫色60min，抽濾，測定多糖含量和色素含量，計(jì)算多糖保留率和脫色率．

pH值對脫色效果的影響：分別取質(zhì)量濃度為1mg／mL貓須草多糖溶液20mL，依次調(diào)節(jié)pH值為2，4，6，8，10，然后分別加入1．5％活性炭，于50℃恒溫脫色60min，抽濾，測定多糖含量和色素含量，計(jì)算多糖保留率和脫色率．

活性炭用量對脫色效果的影響：分別取質(zhì)量濃度為1mg／mL貓須草多糖溶液20mL，各加入0．5％，1％，1．5％，2％，2．5％活性炭，于50℃恒溫脫色60min，抽濾，測定多糖含量和色素含量，計(jì)算多糖保留率和脫色率．

脫色時間對脫色效果的影響：分別取質(zhì)量濃度為1mg／mL貓須草多糖溶液20mL，加入1．5％活性炭，分別于50℃恒溫脫色20min，40min，60min，80min，100min，抽濾，測定多糖含量和色素含量，計(jì)算多糖保留率和脫色率．

1．3．9活性炭脫色正交試驗(yàn)［21－22］

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取脫色溫度（A），pH值（B），活性炭用量（C）和脫色時間（D）4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平表見表1．試驗(yàn)結(jié)果分析采用加權(quán)評分法；脫色率和多糖保留率的權(quán)重各為0．5，綜合評分的計(jì)算方法為：

綜合評分＝（脫色率指標(biāo)值／脫色率最大值）×0．5×100＋（多糖保留率指標(biāo)值／多糖保留率最大值）×0．5×100.

表1　因素水平表Tab．1 Factors and levels of theorthogonal test

2　結(jié)果與分析

2．1脫蛋白方法的比較

表2　不同方法脫蛋白效果比較Tab．2 Comparison of different techniquesfordeproteinization ％

貓須草多糖溶液通過3種脫蛋白方法處理后，結(jié)果如表2所示．從表2可知，多糖保留率和脫蛋白率最高的是Sevag法，其次是三氯乙酸－正丁醇法和三氯乙酸法；因此，Sevag法對貓須草多糖脫蛋白效果最好．

2．2活性炭脫色工藝

2．2．1脫色溫度對脫色效果的影響

由圖1所示，隨著溫度升高，多糖保留率和脫色率先增大后減小，當(dāng)溫度為40℃時多糖保留率和脫色率均最大．溫度較低時，分子擴(kuò)散運(yùn)動不明顯，色素成分不能很好地與活性炭接觸吸附；當(dāng)溫度過高時，多糖喪失活性，多糖損失量較大．綜合考慮，溫度選擇在40℃左右．

2．2．2 pH值對脫色效果的影響

如圖2所示，pH值增加，多糖保留率隨之增加．pH值在2～4范圍內(nèi)多糖保留率較低．當(dāng)pH＞4時，多糖保留率增加．增大pH值，脫色率隨之下降，表明酸性條件對脫色有利．綜合考慮多糖保留率和脫色率，選擇pH值為6左右．

2．2．3活性炭用量對脫色效果的影響

如圖3所示，隨著活性炭用量增加，脫色率增加．當(dāng)活性炭用量大于2％時脫色效果增加緩慢．多糖保留量先增加后減小，當(dāng)活性炭用量為1．5％時，保留率最高，隨后隨著活性炭用量增加，多糖損失量增大．原因是活性炭會吸附部分多糖．綜合考慮，選擇1．5％左右的活性炭用量．

圖1　脫色溫度對脫色效果的影響Fig．1 Effect of decoloring temperature on decolorization

圖2　pH值對脫色效果的影響Fig．2 Effect of pH on decolorization

圖3　活性炭用量對脫色效果的影響Fig．3 Effect of activated carbon dosage on decolorization

2．2．4脫色時間對脫色效果的影響

如圖4所示，多糖保留率受時間影響不大，在40min時多糖保留率最高．脫色效果呈先増后減的趨勢，40min時脫色效果最好，說明在一定時間內(nèi)延長脫色時間有利于吸附脫色，當(dāng)時間過長時可能使色素又溶于溶液中．綜合考慮，選擇脫色時間在40min左右．

2．2．5活性炭脫色正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以脫色率和多糖保留率為考察指標(biāo)，確定最佳工藝條件．正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，方差分析如表4所示．

圖4　脫色時間對脫色效果的影響Fig．4 Effect of decoloring time on decolorization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．3 Results of orthogonal tests

表4　方差分析表Tab．4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3分析可知，因素主次為脫色溫度＞活性炭用量＞pH值＞脫色時間；從方差分析表可知，A,C因素對結(jié)果有顯著影響，由于D因素對結(jié)果影響不顯著，從提高效率的原則選取脫色時間為20min；因此，確定活性炭脫色最優(yōu)工藝條件為A2B3C3D3，即脫色溫度50℃，pH值為6，活性炭最佳用量1．5％，脫色時間20min．在最佳條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得脫色率為72．37％，多糖保留率為85．57％，綜合評分94．09，表明試驗(yàn)所確定的工藝條件為最優(yōu)工藝條件．

3　結(jié)論

經(jīng)比較，用Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法、三氯乙酸法對貓須草多糖溶液進(jìn)行脫蛋白實(shí)驗(yàn)，Sevag法脫蛋白效果最好．多糖損失的原因是Sevag試劑在去除蛋白變性膠狀物時溶有一部分多糖．活性炭脫色最優(yōu)工藝為反應(yīng)溫度50℃，pH值為6，活性炭用量1．5％，反應(yīng)時間20min．該方法具有操作簡便，原料易得，經(jīng)濟(jì)成本低，脫色效果明顯等優(yōu)點(diǎn)．樣液經(jīng)脫色后，由原來的渾濁黑褐色變成橙色透亮溶液，脫色效果明顯．活性炭具有無臭、無味、無毒的優(yōu)點(diǎn)可反復(fù)使用，成本低，適合產(chǎn)品在工業(yè)上大規(guī)模使用，但活性炭會吸附部分多糖，造成多糖損失；因此，在下一步的研究中可以考慮使用層析法進(jìn)行脫色及分離其他雜質(zhì)成分．

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（學(xué)科編輯：黎婭）

Decoloration and deproteinization of Clerodendranthus spicatus polysaccharide

LIAO Chun－yan1，2，XU Hai－run1，HUANG Yao1，2
（1．School of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2．Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources（Guangxi University of Science and Technology），Liuzhou 545006，China）

To optimize the method for decoloration and deproteinization of Clerodendranthus spicatus polysaccharides,this paper compared the Sevag method,TCA method and TCA-NBA method to screen the better deproteinization method.And the optimal method of deproteinization was evaluated by the protein removal rate and polysaccharides retention rate.The process of decoloration using acticarbon was evaluated by the single-factor and orthogonal test in terms of the decolorization rate and polysaccharide retention rate.The results showed that the deproteinization effect was optimal with sevag method.The best decoloration conditions was50℃,pH6.0,quantity of active carbon was1.5％and 20min.So this optimal technology is stable and efficient.It provides the theoretical basis for the production and use of Clerode ndranthus spicatus polysaccharide.

Clerode ndranthus spicatus;polysaccharide;deproteinization;decoloration

R284．2

A

2095-7335（2016）04-0111-05

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.04.020

2016－04－27

廣西高校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510594094）資助．

廖春燕，碩士，講師，研究方向：生物分離，E－mail：5560043＠qq．com．