陳曉麗，林煒明

（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364000）

疾病防控

3種染色法檢測奶山羊乳房炎陽性乳汁中體細(xì)胞比較研究

陳曉麗，林煒明

（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364000）

試驗(yàn)探討3種方法在奶山羊隱性乳房炎乳汁體細(xì)胞染色過程中的優(yōu)缺點(diǎn)，為奶山羊乳房炎體細(xì)胞檢測提供最合適的染色方法。從某羊場無菌采集100份羊乳，用加利福尼亞乳房炎檢測法（CMT）篩選出20份患乳房炎并且未經(jīng)抗生素治療的奶山羊乳樣，分別采用Diff-Quik染色法、亞甲基藍(lán)染色法和姬姆薩染色法3種方法進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果表明：亞甲基藍(lán)染色法操作簡單，對細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色效果好，但染色時間較長，顏色單一，不利于對粒細(xì)胞進(jìn)行辨別分類；姬姆薩染色法操作簡單、易控制，對細(xì)胞核染色效果好，易區(qū)分各類體細(xì)胞，但染色時間長，乳膜易隨染液脫落；Diff-Quik染色法操作步驟簡單，染色時間短，體細(xì)胞對染液的著色親和，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限分明，嗜酸堿性粒細(xì)胞易于區(qū)分。說明Diff-Quik染色法優(yōu)于其他兩種染色法，更適合用于奶山羊隱性乳房炎的臨床檢驗(yàn)。

隱性乳房炎；體細(xì)胞檢測；Diff-Quik染色法；亞甲基藍(lán)染色法；姬姆薩染色法

在乳制品中，羊奶是最接近母乳、營養(yǎng)成分最全、最易被人體吸收的奶品［1］，與牛乳相比，羊乳含有豐富的免疫球蛋白和維生素A等，可有效提高免疫力，有利于保護(hù)視力及預(yù)防近視。但羊乳產(chǎn)出量較低，在養(yǎng)殖過程中常受到外傷、廄舍衛(wèi)生不良、擠奶不規(guī)范、奶羊內(nèi)激素分泌不協(xié)調(diào)及產(chǎn)后其他疾病誘發(fā)等因素而導(dǎo)致乳房炎，造成重大經(jīng)濟(jì)損失［2］。體細(xì)胞檢測對乳腺炎的監(jiān)控和原料奶的質(zhì)量控制有重要意義。

羊乳房炎是羊的乳腺、乳池、乳頭的局部炎癥，多見于綿羊、山羊的泌乳期。當(dāng)羊患乳房炎時，其乳房發(fā)生紅、腫、熱、痛及泌乳障礙等炎性反應(yīng)，是動物自衛(wèi)的一種重要手段。這個過程會升高血液中免疫蛋白質(zhì)的濃度以及乳腺組織和乳中的白細(xì)胞數(shù)量［3］。當(dāng)奶山羊管理得當(dāng)、營養(yǎng)充足時，機(jī)體可以通過提高自身免疫力和排出乳汁來凈化乳房內(nèi)的病原微生物［4］，從而消除乳房中的炎癥反應(yīng)。但若發(fā)生護(hù)理不當(dāng)、營養(yǎng)不足等情況時，可能使奶山羊免疫力下降，潛在隱性乳房炎轉(zhuǎn)變成臨床型乳房炎［5-6］，不僅乳汁中白細(xì)胞會增加，血液中白細(xì)胞也會大量增加。

本實(shí)驗(yàn)采用Diff-Quik染色法、亞甲基藍(lán)染色法和姬姆薩染色法對奶山羊隱性乳房炎乳汁進(jìn)行涂片染色觀察，根據(jù)體細(xì)胞染色后界限清晰度及不同細(xì)胞在不同染液中的形態(tài)結(jié)構(gòu)易分辨程度，探討羊乳房炎乳汁中體細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)的研究方法，為羊乳房炎體細(xì)胞檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 乳樣采集 從福建龍巖某羊場中采集100只奶山羊乳樣，每只各采集1份乳樣，每份4 mL，采樣前先用溫水清洗乳房，后用0.1%新潔爾滅對乳頭消毒，棄去前3把奶。采集的乳樣放入5 mL滅菌EP管中，封口，立即送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測并于當(dāng)天檢驗(yàn)完畢。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 加利福尼亞乳房炎檢測試劑（CMT），購自福州佳宸生物科技有限公司；Diff-Quik染液，購于南京建成科技有限公司；亞甲基藍(lán)染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；姬姆薩染液，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 加利福尼亞乳房炎檢測法（CMT） 先將待檢乳樣2 mL放于塑料乳房炎檢驗(yàn)盤中，再加入檢測試劑2 mL，緩慢做同心圓狀攪拌10 s，觀察判定。篩選出20份陽性奶山羊乳樣，進(jìn)行上述乳涂片制作。判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.2 奶山羊乳汁涂片的制備 用加利福尼亞乳房炎檢測試劑對100份奶山羊乳樣進(jìn)行檢測，篩選出20份患乳房炎（陽性）并且未經(jīng)抗生素治療的奶山羊乳樣，按常規(guī)方法制成乳涂片并做好標(biāo)記，分為A、B、C三組，每組各有20份相同乳涂片，如：乳樣1，制作A1、B1、C1乳涂片；乳樣2，制作A2、B2、C2乳涂片；乳樣3，制作A3、B3、C3乳涂片，以此類推，最后，A1、A2、A3到A20為A組，B1、B2、B3到B20為B組，C1、C2、C3到C20為C組。載玻片用2%鹽酸浸泡6 h，流水沖洗后，蒸餾水沖洗4～5次，晾干備用。將裝在試管中的待測樣品搖勻，取2 mL裝入刻度離心管中，以2 000 r/min離心，仔細(xì)吸除上清液及管壁上的脂肪，將剩余的液體與沉淀混合，然后用微量移液器吸取一定體積的待測鮮乳（標(biāo)準(zhǔn)是0.01 mL），涂抹在載玻片一定面積上（1 cm2）形成均勻樣膜，水平放置于37℃烘干箱中干燥5 min，備用。

表1 加利福尼亞乳房炎檢測法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 亞甲基藍(lán)染色法 將A組烘干的乳涂片置于二甲苯中脫脂2 min后，用吸水紙吸除多余液體，加入美藍(lán)染液染色15～20min，用自來水緩慢流洗染色液，吸取多余的染液后自然晾干，在顯微鏡下對染色細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.2.4 Diff-Quik染色法 Diff-Quik染液由3個試劑組成，分別為試劑1、試劑2、試劑3。將B組乳涂片完全干燥后依次放入試劑1中固定5～10s立即取出，甩掉多余液體，直接放入試劑2中，為了使染液均勻分布，在染色中應(yīng)上下提動玻片2～3次。染色5～10s后，立即取出，用吸水紙吸除多余液體，直接放入試劑3中染色5～10 s，上下提動玻片2～3次使染液均勻分布，取出涂片放入清水中洗去多余的染液，無水乙醇脫水2次，待干后透明、封片、鏡檢。

1.2.5 姬姆薩染色法 染色前按姆薩濃縮液1 mL配姬姆薩稀釋液9 mL的比例充分混勻后備用，將C組乳涂片完全干燥后，用甲醇固定2～3 min。將乳涂片放置染色架上，滴加稀釋好的染色液使其覆蓋全部乳膜，室溫染色15～30 min，用自來水緩慢從玻片一端沖洗（注意勿先倒去染液或直接對乳膜沖洗），晾干后鏡檢。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

將3種特殊染色法染色后的乳涂片置于顯微鏡下，觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞甲基藍(lán)染色法

亞甲基藍(lán)染色后乳涂片中體細(xì)胞的細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈半透明樣，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的界面清晰，易于區(qū)分。染色后切片細(xì)胞著色單一，雖可看到形狀各異的細(xì)胞核，但無法精確區(qū)分出細(xì)胞種類，只能通過觀察細(xì)胞核的大小、數(shù)量進(jìn)行初步推測。通過顯微觀察可以看出，巨噬細(xì)胞體積較大，有一被染成深藍(lán)色的腎形細(xì)胞核，由于胞漿略嗜堿性，細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)灰色；淋巴細(xì)胞細(xì)胞核相對較大，細(xì)胞質(zhì)極少，核深染，核周圍淺染，胞質(zhì)淺藍(lán)色；嗜性粒細(xì)胞只能通過其顯微形態(tài)、大小進(jìn)行初步判斷，無法精確判斷具體為何種嗜性粒細(xì)胞。詳見圖1 A。

2.2 Diff-Quik染色法

Diff-Quik染色后乳涂片中著色的體細(xì)胞色彩深淺適度，紅藍(lán)對比鮮明，各種細(xì)胞著色清晰，在顯微鏡下可清晰看到被染成紫紅色的嗜酸性粒細(xì)胞、深藍(lán)色的嗜堿性粒細(xì)胞、淡紫色的嗜中性粒細(xì)胞及單核肥大的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)極少的淋巴細(xì)胞?？赏ㄟ^被染色后細(xì)胞含顆粒物質(zhì)的酸堿性及染色后細(xì)胞核的形態(tài)、大小以及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)所呈現(xiàn)的不同顏色和形狀加以判斷，從而得以區(qū)分多種細(xì)胞的種類。詳見圖1 B。

2.3 姬姆薩染色法

姬姆薩染色后乳涂片中細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的著色界限明顯，可在顯微鏡中清晰看到被染成深色的細(xì)胞核和透明的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞輕度偏向深藍(lán)色，紅藍(lán)對比模棱兩可，導(dǎo)致很難區(qū)分嗜酸性和嗜堿性細(xì)胞，但仍可從其不同的著色情況及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的形狀、大小中辨別出深紫色的嗜酸性粒細(xì)胞、深藍(lán)色的嗜堿性粒細(xì)胞、淡紫色的嗜中性粒細(xì)胞及核大深染的淋巴細(xì)胞和體積較大的多核巨噬細(xì)胞。詳見圖1 C。

圖1 奶山羊乳房炎乳汁體細(xì)胞3種染色法形態(tài)觀察（100×）

3 討論

亞甲基藍(lán)染色法是一種色素還原試驗(yàn)，體細(xì)胞的細(xì)胞核可被亞甲基藍(lán)清晰染色［7］。該法是牛奶中體細(xì)胞數(shù)檢測的基準(zhǔn)方法，所需儀器設(shè)備少，但所用的試劑（四氯乙烷）具有強(qiáng)毒性。伍偉平等［8］實(shí)驗(yàn)證明，四氯乙烷在氯代烴類化合物中毒性較大，可通過吸入、食入或經(jīng)皮膚吸收3種途徑導(dǎo)致人體中毒，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及肝、腎和心肌造成損害。考慮到本試驗(yàn)耗時較長及其毒性作用，現(xiàn)在乳品生產(chǎn)企業(yè)普遍不采用該方法。

Diff-Quik染色法也稱為改良Wright染色法，可用于動物血涂片、精子涂片、宮頸刮片、胸腹水細(xì)胞涂片等染色［9-11］。將該法運(yùn)用于乳房炎乳汁體細(xì)胞涂片染色的檢測，目前尚未見報道，故筆者對Diff-Quik染色法在羊乳房炎體細(xì)胞染色中的運(yùn)用效果進(jìn)行具體分析，為日后研究者對乳房炎體細(xì)胞染色檢測提供了更多合理診斷方法及治療依據(jù)。

姬姆薩染液是由天青與伊紅組成。各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不同。嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，被染為紫紅色；嗜堿性顆粒如細(xì)胞核蛋白或淋巴細(xì)胞漿為酸性物質(zhì)，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，被染成深藍(lán)色；中性顆粒呈等電狀態(tài)，與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，呈淡紫色。各類成分由于自身特性與姬姆薩染液中不同物質(zhì)結(jié)合，呈現(xiàn)不同顏色，從而得以區(qū)分。

從試驗(yàn)結(jié)果可看出，Diff-Quik染色法比姬姆薩染色法和亞甲基藍(lán)染色法更適合用于羊乳房炎乳汁體細(xì)胞的檢測，其染色后可以在柔和的背景下清晰地觀察到不同種類細(xì)胞的著色情況，也可以清晰看到被染色后細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。此外，Diff-Quik染色可在短時間內(nèi)完成，染色后涂片上的乳汁膜不易脫落，不易受到外界干擾。姬姆薩染色法對體細(xì)胞染色后，可清晰觀察到細(xì)胞整體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，鑒別出多種不同種類的細(xì)胞，但本方法染色用時較長，染色后涂片上的乳汁膜易隨染色液脫落，增加了涂片制作的難度。亞甲基藍(lán)染色法對體細(xì)胞染色后，可清晰看到深藍(lán)色的細(xì)胞核與半透明的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯易于觀察，染色后涂片上的乳汁膜不易隨染色液脫落，但其染色所需時間長，著色單一，無法對粒細(xì)胞的嗜酸堿性進(jìn)行判斷，只能通過對其形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察大體鑒別出粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。

隨著動物福利的發(fā)展和動物醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，對奶山羊乳房炎的預(yù)防和治療方法也越來越多樣化，及早發(fā)現(xiàn)疾病并進(jìn)行預(yù)防診治至關(guān)重要。通過檢測奶山羊乳汁對奶山羊的健康狀況進(jìn)行分析，從而制定合理的治療方案，做到檢測與防治相結(jié)合，才能更好地控制該病，消除食品安全隱患，提高羊場經(jīng)濟(jì)效益。通過本次對3種染色法的研究對比，羊乳房炎乳汁中體細(xì)胞檢測采用Diff-Quik染色法染色更清晰便捷，乳汁中體細(xì)胞的種類和形態(tài)結(jié)構(gòu)都更為明顯，可快速進(jìn)行觀察鑒別。姬姆薩染色法最大的優(yōu)勢在于染色過程易控，不易被污染［12］，對細(xì)胞核的染色效果好，染色時間持久。建議在臨床制作奶山羊乳房炎乳涂片時，首選Diff-Quik染色法，其次為姬姆薩染色法。

4 結(jié)論

通過對比3種染色法，表明奶山羊隱性乳房炎乳汁中體細(xì)胞檢測采用Diff-Quik染色法染色更清晰便捷，乳汁中體細(xì)胞的種類和形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果都更為明顯，可快速的進(jìn)行觀察鑒別。姬姆薩染色法最大的優(yōu)勢在于染色過程易控，染色保持時間久。建議在臨床檢驗(yàn)?zāi)躺窖蛉榉垦兹橥科瑫r，首選Diff-Quik染色法，其次為姬姆薩染色法。通過對乳汁中體細(xì)胞的分類觀察與各細(xì)胞的不同作用功能相結(jié)合，可以了解到羊乳房炎的發(fā)展程度，為羊乳房炎的診斷和治療提供依據(jù)。

［1］ 田歌，梁茂文，楊繼業(yè)，等.牛奶中體細(xì)胞數(shù)快速檢測方法探討［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（7）：686-687，690.

［2］ 吳寶文，蒲志峰.奶羊乳房炎的治療［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30（8）：54-56.

［3］ 史慧茹，姜瞻梅，田波.牛乳體細(xì)胞數(shù)的檢測方法［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2008（2）：86-88.

［4］ 張珠明，汪仁莉.奶牛臨床型乳房炎病理組織學(xué)觀察［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（11-12）：83-84.

［5］ 胡雪靜，李宗波.奶牛乳房炎發(fā)病原因探討［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2008，56（11）：47-49.

［6］ 喬新安，王月影.奶牛乳腺先天防御機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（5）：1380-1381，1383.

［7］ 丘通強(qiáng)，林少寶，吳煥貞.鮮牛乳中體細(xì)胞數(shù)檢測方法探討［J］.現(xiàn)代食品科技，2005，2（2）：158-160.

［8］ 伍偉平，徐成潤，張惠勇，等.四氯乙烷中毒性肝損害18例臨床分析［J］.肝臟，2009，32（2）：174.

［9］ 王津津，趙海泉，林鋒，等.Diff-Quik染色法在中華鱉血細(xì)胞染色中的應(yīng)用［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2011，32（7）：8-12.

［10］王彥芳，張洲，寇卉.Diff-Quik與改良巴氏染色法對精子形態(tài)染色效果比較［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2012，33（24）：5155-5156.

［11］Ilaria Natali，Monica Muratori，Valentina Sarli，et al.Scoring human sperm morphology using Testsimplets and Diff-Quik slides［J］. Fertility and Sterility，2013，99（5）：1227-1232.

［12］張立群，張賽霞，吳紹峰.幾種血涂片染色方法的比較［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，6（7）：124.

Comparison on Three Staining Methods for Detection of Somatic Cell in the Milk of Dairy Goats with Positive Mastitis

Chen Xiaoli，Lin Weiming
（College ofLife Sciences ofLongyan University，F(xiàn)ujian Provincial KeyLaboratoryfor the Prevention and Control ofAnimal Infectious Diseases and Biotechnology，Longyan 364000，China）

This experiment aimed tocompare the advantages and disadvantages of three kinds of staining methods in the detection of somatic cell in the milk of dairy goats with subclinical mastitis.20 milk samples with subclinical mastitis determined by California mastitis detection（CMT）were selected and stained with three methods（Diff-Quik，methylene blue and Giemsa staining method）respectively，and then observed with light microscopy.The results showed that the methylene blue staining method was simple and had good staining effect on the cytoplasm and nucleus，but a long staining time and not conducive to the granulocytes classification because ofa single color；Giemsa stainingmethod was simple and easytocontrol，good stainingeffect on the nucleus，easy to distinguish various types of cells，but a long staining time；Diff-Quik staining procedure was simple，time-short，easy to color the somatic cell and distinguish the nucleus and cytoplasm，neutrophils.Therefore，the Diff-Quik staining method was better than the other twomethods and more suitable for the clinical detection ofsubclinical mastitis ofdairygoats.

subclinical mastitis；somatic cell；Diff-Quik staining；methylene blue staining；Giemsa staining

S858.27

A

2095-3887（2016）05-0051-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.014

2016-07-01

龍巖學(xué)院博士基金項(xiàng)目（LB2013010）

陳曉麗（1992-），大學(xué)本科。

林煒明，副教授，博士。研究方向：動物醫(yī)學(xué)。