張晶晶, 黃亞麗, 馬 宏, 賈振華, 劉昆昂, 史延茂

(1. 河北省科學院生物研究所, 河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心,石家莊 050081; 2. 河北工業(yè)大學化工學院, 天津 300130)

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木霉厚垣孢子可濕性粉劑的研制

張晶晶1,2, 黃亞麗1*, 馬 宏1, 賈振華1, 劉昆昂1, 史延茂1

(1. 河北省科學院生物研究所, 河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心,石家莊 050081; 2. 河北工業(yè)大學化工學院, 天津 300130)

通過測定不同載體、潤濕劑、分散劑、紫外保護劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)率和菌絲生長以及不同含量助劑對可濕性粉劑性能的影響,確定了木霉厚垣孢子可濕性粉劑的組成成分和比例,其中厚垣孢子粉為25%(厚垣孢子粉由硅藻土吸附木霉發(fā)酵液制備而成),潤濕劑十二烷基硫酸鈉為4%,分散劑CMC為5%,紫外保護劑糊精為1%,以硅藻土補齊100%。該厚垣孢子可濕性粉劑的活孢子數(shù)為2.5×109cfu/g,潤濕時間為58 s,總懸浮率為78%,孢子懸浮率為85.27%,pH為6.92,含水量為2.16%,98%通過200目標準篩,該制劑的各項指標均符合可濕性粉劑及微生物制劑的相關標準。該研究的進行為農業(yè)生產提供一種新型的木霉制劑,對穩(wěn)定木霉制劑的田間防效具有重要的意義。

木霉; 厚垣孢子; 可濕性粉劑; 生物相容性

過量施用化學農藥所造成的環(huán)境污染及人類健康問題日趨嚴重,采用低污染、低殘留的方式進行植物病害防治已經成為農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇[1]。生物防治作為一種環(huán)境友好型的病蟲害防治技術是目前化學農藥減量和替代的主要方式之一[2],而研制出防治效果良好的生防菌劑則是加快化學農藥替代化進程的前提。

木霉是目前應用最為廣泛的生防真菌之一,對腐霉菌、立枯絲核菌、鐮刀菌、灰霉病菌、白絹病菌等引起的植物病害具有良好的防治作用[3-5]。目前,木霉應用所面臨的最大問題是如何保持木霉制劑的活性并使其在田間發(fā)揮高的活力,研制出貨架期長、田間防效穩(wěn)定的木霉制劑對發(fā)揮其生防能力具有非常重要的作用,也是木霉生物防治的主要研究方向。通過多年的研究,研究者已經開發(fā)出多種類型的木霉制劑,包括木霉分生孢子的腐植酸吸附制劑、可濕性粉劑、硅藻酸鈉制劑[6]等。然而,以分生孢子為主效成分的木霉制劑,由于分生孢子的活力受環(huán)境因素影響較大,造成木霉制劑貨架期短、田間防效不穩(wěn)[7]。

厚垣孢子是木霉在逆境下產生的一種繁殖體,該類孢子在儲存、萌發(fā)及在逆境下的存活能力均遠遠優(yōu)于分生孢子,在田間使用時抗逆性強。初步研究表明相同濃度的木霉厚垣孢子懸浮液對辣椒疫病的預防及治療效果均好于分生孢子懸浮液[8]。因此,研制以厚垣孢子為有效成分的木霉制劑有望解決木霉分生孢子制劑貨架期短、田間防效不穩(wěn)定的問題。

然而,因木霉厚垣孢子發(fā)酵技術難度較大,目前還沒有木霉厚垣孢子制劑的相關研究。本項目組前期以分離的拮抗木霉Tr-92為試驗材料[9],初步建立了木霉厚垣孢子液體發(fā)酵工藝[10]。并以此為基礎,進行以厚垣孢子為有效成分的木霉可濕性粉劑的研制,通過各種助劑與厚垣孢子的生物相容性和可濕性粉劑質量指標的測定,確定了木霉厚垣孢子可濕性粉劑的組成,以期進一步穩(wěn)定和提高木霉制劑的田間防效,為更好地利用木霉這一微生物資源提供新的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)Tr-92菌株,為本實驗室篩選、鑒定。

供試載體為硅藻土、滑石粉、膨潤土;潤濕劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、吐溫-20;分散劑為木質素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉(CMC)、皂莢粉、2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽(NNO)、拉開粉;紫外保護劑為黃原膠、腐植酸、糊精、熒光素鈉、甲基纖維素。所有試劑均為市售產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉厚垣孢子的發(fā)酵及厚垣孢子漿和孢子液的制備

[10]的方法,進行木霉Tr-92的培養(yǎng),將木霉Tr-92發(fā)酵液進行紗布過濾,收集過濾液后經3 000 r/min離心10 min,收集沉淀獲得厚垣孢子漿。根據(jù)試驗需要,通過血球計數(shù)板計數(shù)法將厚垣孢子漿用滅菌水稀釋成不同濃度的厚垣孢子液使用。

1.2.2 載體的篩選

載體對厚垣孢子萌發(fā)的影響:將各載體配制成100、500和1 000 μg/mL 3個濃度,并在3種濃度中分別加入等量的厚垣孢子液(濃度為1×108個/mL),混合均勻后28℃搖床培養(yǎng)12 h,之后采用顯微觀察法測定孢子的萌發(fā)數(shù)量,并計算萌發(fā)率。

載體對木霉菌落生長的影響:將各載體按濃度50 mg/mL加入PDA培養(yǎng)基中,滅菌后倒平板,待凝固后接入直徑5 mm的活化3 d的木霉菌餅,28℃培養(yǎng),每隔24 h測量菌落直徑,計算菌落的生長速率[11]。

載體對厚垣孢子漿吸附率:準確稱取載體硅藻土、滑石粉、膨潤土各5 g分別放于50 mL燒杯中,滴加木霉厚垣孢子漿,用玻璃棒攪拌至載體開始聚成一團,稱量吸附懸液后載體質量,并計算載體對厚垣孢子漿的吸附率,每個載體3次重復。

其中q為載體吸附率(g/g),mf為吸附厚垣孢子漿后載體的質量(g),mo為吸附載體前吸附材料的質量(g)。

厚垣孢子粉的制備方法:將載體與厚垣孢子漿按1∶7比例進行混合,在50℃烘箱烘干3 h,烘干后采用粉碎機進行粉碎,得到厚垣孢子粉。

1.2.3 潤濕劑的篩選

潤濕劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響:按照載體篩選方法進行。

潤濕劑流點的測定:準確稱取厚垣孢子粉1 g并放置于50 mL燒杯中,用移液器將濃度為5%的潤濕劑水溶液慢慢滴加到厚垣孢子粉上,同時不斷用玻璃棒攪拌使其成糊狀,當糊狀物剛形成滴滴下時,記下所用的潤濕劑體積,并計算單位重量有效成分所需溶液的體積,即為流點。

潤濕劑含量測定:按厚垣孢子粉20%,潤濕劑分別為1%、2%、3%、4%、5%,并以硅藻土補足100%,采用參考文獻[12]的方法測定其潤濕時間。

1.2.4 分散劑的篩選

分散劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響:按照載體篩選方法進行。

分散劑種類的選擇:按厚垣孢子粉20%、分散劑10%、以硅藻土補足100%的配比制成可濕性粉劑,根據(jù)文獻[12]的方法測定由不同分散劑組成的可濕性粉劑的潤濕時間,計算樣品的懸浮率。

分散劑含量的確定:按厚垣孢子粉為20%,潤濕劑10%,分散劑為1%、3%、5%、7%、9%比例混合,其余硅藻土補足,測定其懸浮率[13],確定分散劑最佳用量。

1.2.5 紫外保護劑的篩選

紫外保護劑對木霉厚垣孢子的萌發(fā)及菌落生長的影響:按照載體篩選方法進行。

紫外線照射的情況下,保護劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)的保護作用:將木霉厚垣孢子用無菌水稀釋到1×108個/mL,將濃度為1×108個/mL厚垣孢子懸液與同體積的紫外保護劑液(濃度為1%)混合均勻,以厚垣孢子懸液與無菌水等體積混合液為對照1。吸取5 mL不同處理的木霉厚垣孢子放于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中,打開培養(yǎng)皿蓋在紫外燈(30 W,光強120 lx)下30 cm處照射3 min后,以厚垣孢子懸液與無菌水等體積混合液未進行紫外照射的處理設為對照2。將不同處理的厚垣孢子液稀釋后,吸取0.1 mL涂布于PDA平板上,蓋上培養(yǎng)皿蓋培養(yǎng)48 h,記錄菌落數(shù)。

1.2.6 木霉Tr-92菌株可濕性粉劑質量檢測

根據(jù)GB/T5451-2001[12]、GB/T14825-2006[13]、GB/T25864-2010[14]、GB/T16150-1995[15]要求對木霉Tr-92菌株厚垣孢子的懸浮率、潤濕時間、樣品細度、pH[16]等進行檢測。采用稀釋涂平板方法進行可濕性粉劑中活孢子數(shù)的測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用Excel 2007中AVERAGE和STDEVP函數(shù)計算樣本的均值和標準差,采用SPSS 17.0軟件中LSD進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 載體的選擇及含量的確定

2.1.1 載體對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌落生長的影響

由表1可知不同濃度的3種載體對木霉厚垣孢子萌發(fā)均有一定的影響,且隨著載體濃度的增加,孢子萌發(fā)率降低,其中硅藻土對厚垣孢子萌發(fā)率的影響最小,濃度為100 μg/mL時與對照不存在顯著差異。3種載體對木霉菌落生長速度的影響與對孢子萌發(fā)的影響基本一致,其中以硅藻土對菌絲生長的抑制作用最小,其次為膨潤土,以滑石粉對菌絲生長的影響最大。

表1 載體對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌落生長的影響1)Table 1 Effects of carrier on the germination of Trichoderma chlamydospore and growth of colony

1) 同列中不同小寫字母表示不同處理間顯著差異(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at the levelP<0.05.The same below.

2.1.2 載體對厚垣孢子漿吸附率的測定

載體對厚垣孢子漿的吸附率表示載體吸附有效成分的能力,吸附率越大則表明制劑性能越好。由圖1可以看出,硅藻土對厚垣孢子漿的吸附能力最強,其次為膨潤土,滑石粉對厚垣孢子漿的吸附率最低。綜合考慮載體對木霉厚垣孢子萌發(fā)率、菌落生長的影響及載體對厚垣孢子漿的吸附率,初步確定硅藻土為木霉厚垣孢子可濕性粉劑的載體。

2.2 潤濕劑的篩選

2.2.1 潤濕劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌落生長的影響

由表2可知,不同潤濕劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)率及菌落生長的影響不同。與對照相比,各種潤濕劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)都存在抑制作用,且隨濃度的升高,孢子的萌發(fā)率降低,其中十二烷基苯磺酸鈉對孢子萌發(fā)的抑制作用最小。從菌落生長速率來看,十二烷基硫酸鈉和十二烷基苯磺酸鈉對菌落生長的抑制作用較小,與對照不存在顯著差異。

圖1 不同載體對厚垣孢子漿的吸附率Fig.1 The absorption rates of different carriers to Trichoderma chlamydospore suspension

潤濕劑Wettingagent孢子萌發(fā)率/% Germinationrateofchlamydospore100μg/mL500μg/mL1000μg/mL菌絲生長速率/cm·d-1Myceliumgrowthrate十二烷基硫酸鈉 Laurylsodiumsulfate(79.2±1.18)b(50.1±2.49)b(30.2±1.58)b(3.79±0.18)a十二烷基苯磺酸鈉 Sodiumdodecylbenzenesulfonate(80.3±0.65)b(50.1±1.78)b(31.5±0.56)b(3.58±0.01)a吐溫-20 Tween-20(69.0±1.48)c(50.7±0.36)b(30.2±3.27)b(2.90±0.13)bCK(93.2±0.46)a(93.2±0.46)a(93.2±0.46)a(3.97±0.13)a

2.2.2 潤濕劑性質的測定

潤濕劑流點的高低直接影響可濕性粉劑的質量,3種潤濕劑的流點測定結果表明,十二烷基硫酸鈉的流點最低,為1.8 g/mL,與十二烷基苯磺酸鈉和吐溫-20存在顯著差異。綜合考慮潤濕劑的生物相容性和流點的高低,選擇十二烷基硫酸鈉作為潤濕劑。

圖2 不同潤濕劑的流點Fig.2 The flow points of different wetting agents

2.2.3 潤濕劑十二烷基硫酸鈉含量對潤濕時間的影響

潤濕劑含量影響可濕性粉劑的潤濕時間,潤濕時間越短,可濕性粉劑的潤濕效果越好。圖3為可濕性粉劑中十二烷基硫酸鈉含量對潤濕時間的影響,

可以看出,十二烷基硫酸鈉含量為4%時其潤濕時間最短。

圖3 潤濕劑十二烷基硫酸鈉含量對潤濕時間影響Fig.3 Effects of lauryl sodium sulfate content on wetting time

2.3 分散劑的篩選

2.3.1 分散劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌落生長的影響

不同分散劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌落生長的影響見表3,木霉厚垣孢子萌發(fā)指標顯示,分散劑濃度為100 μg/mL時,拉開粉對孢子的萌發(fā)抑制率最大,其他分散劑與對照的差異不顯著。隨著濃度增大,各分散劑對孢子的萌發(fā)抑制作用增強。從菌落生長速率看,皂莢粉和拉開粉抑制菌落生長,NNO、CMC、木質素磺酸鈉能夠促進菌絲生長,綜合考慮木霉厚垣孢子萌發(fā)率及菌落生長速率,初選NNO、CMC、木質素磺酸鈉進行分散劑下一步篩選。

表3 分散劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌落生長的影響Table 3 Effects of dispersion agents on the germination of Trichoderma chlamydospores and growth of colony

2.3.2 分散劑種類的選擇

潤濕效果和懸浮率是評價分散劑好壞的重要標準。以十二烷基硫酸鈉作為潤濕劑,比較不同分散劑處理下樣品的潤濕時間和懸浮率。結果(表4)表明,以羧甲基纖維素鈉(CMC)為分散劑時,厚垣孢子可濕性粉劑的潤濕時間較短、懸浮率最高,因此確定CMC作為該可濕性粉劑的分散劑。

表4 木霉厚垣孢子可濕性粉劑的潤濕時間和懸浮率Table 4 Wetting time and suspension rate ofTrichoderma chlamydospore wettable powder

2.3.3 分散劑CMC含量對木霉厚垣孢子可濕性粉劑懸浮率的影響

測定分散劑CMC含量為1%、3%、5%、7%、9%時,木霉厚垣孢子可濕性粉劑的懸浮率,結果(圖4)表明,CMC含量為5%時懸浮率最高,為78.15%。因此,初步確定可濕性粉劑的組成中分散劑CMC的含量為5%。

2.4 紫外保護劑的篩選

2.4.1 紫外保護劑對木霉厚垣孢子的萌發(fā)及菌落生長速率的影響

不同紫外保護劑對木霉厚垣孢子的萌發(fā)及菌落生長速率的影響見表5,其中腐植酸、糊精對厚垣孢子的萌發(fā)抑制率相對較小,甲基纖維素和熒光素鈉對厚垣孢子萌發(fā)抑制率較大;另外,糊精、腐植酸和甲

基纖維素對菌落生長的影響較小,而熒光素鈉對菌落生長速度的抑制作用則非常明顯。綜合考慮木霉厚垣孢子萌發(fā)率及菌落生長速度,初選糊精和腐植酸作為紫外保護劑進行下一步的篩選。

圖4 CMC含量對可濕性粉劑懸浮率的影響Fig.4 Effects of CMC content on suspension rate

2.4.2 紫外保護劑對木霉厚垣孢子的保護作用

表6列出了不同紫外保護劑存在的情況下,經紫外照射后厚垣孢子的萌發(fā)數(shù)目。結果表明,與未加紫外保護劑的對照相比,各紫外保護劑都具有保護厚垣孢子的作用,降低了紫外線對厚垣孢子的傷害,其中以糊精對厚垣孢子的保護作用最為明顯,其次為腐植酸。綜合考慮紫外保護劑與木霉Tr-92的生物相容性以及其對厚垣孢子的保護作用,在該可濕性粉劑中選用糊精作為紫外保護劑。

表5 紫外保護劑對木霉厚垣孢子的萌發(fā)及菌落生長的影響Table 5 Effects of UV protective agents on Trichoderma chlamydospore germination and colony growth

2.5 木霉厚垣孢子可濕性粉劑質量檢測

通過載體、潤濕劑、分散劑、紫外保護劑等因素的篩選,最終確定木霉厚垣孢子可濕性粉劑的組成為:25%厚垣孢子粉、4%十二烷基硫酸鈉、5%CMC和1%糊精。在該組成下,木霉厚垣孢子可濕性粉劑的潤濕時間為(58±0.82)s、總懸浮率為(78±1.2)%、孢子懸浮率為(85.27±1.32)%、pH為6.92±0.21、含水量為(2.16±0.12)%、(98±0.72)%通過200目標準篩、活孢子數(shù)為2.5×109cfu/g,符合國家可濕性粉劑及生物制劑的相關標準。

3 討論

可濕性粉劑是由不溶于水的原藥和載體、表面活性劑、輔助劑形成的易被水潤濕并能在水中分散懸浮的粉狀農藥制劑,具有與環(huán)境相容性好、生產成本低、效果好的優(yōu)點。與化學農藥的可濕性粉劑相比,微生物可濕性粉劑加工更為復雜,因為活孢子與助劑的相容性較差,某些助劑可能完全不能使用,所以需要嚴格測定助劑對孢子萌發(fā)及菌落生長的影響[17]。木霉是目前應用最為廣泛的生防真菌之一,已經在世界范圍內廣泛使用,然而目前應用最為廣泛的木霉制劑是防治土傳病害的木霉吸附劑,對可濕性粉劑的研究相對較少,進行木霉可濕性粉劑研究對擴大木霉的施用范圍具有重要的意義。

表6 紫外保護劑對木霉厚垣孢子的保護作用1)Table 6 Protective effects of UV protective agents on the activity of Trichoderma chlamydospores

1) 對照1為厚垣孢子懸浮液與無菌水等體積混合液進行紫外照射;對照2為厚垣孢子懸浮液與無菌水等體積混合液不進行紫外照射。

Control 1 is the mixture of chlamydospore suspension and sterile water with ultraviolet irradiation;Control 2 is the mixture of chlamydospore suspension and sterile water without ultraviolet irradiation.

本試驗比較了備選助劑對木霉厚垣孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響,初步篩選出對木霉厚垣孢子萌發(fā)及菌絲生長影響較小的助劑。研究發(fā)現(xiàn),不同種類的載體對厚垣孢子萌發(fā)和生長的影響不同,相對而言硅藻土對厚垣孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用要小于滑石粉和膨潤土。真菌孢子的疏水性常常使其無法正常噴霧,為降低其表面張力，增加其在水中的分散性,在制劑中必須加入表面活性劑(潤濕劑、分散劑等),在待選的3種潤濕劑中,十二烷基硫酸鈉與木霉厚垣孢子的相容性較好,且流點最低。紫外線對孢子的殺傷是影響真菌制劑田間穩(wěn)定性的重要因素,因此在可濕性粉劑中加入與孢子相容好的紫外線防護劑能夠有效提高生防制劑的田間防效,楊合同等[18]的研究表明,腐植酸和糊精用于木霉分生孢子可濕性粉劑,能夠有效降低紫外線對木霉分生孢子的傷害。本研究采用木霉厚垣孢子也取得了與該研究相一致的結果。另外,本研究結果顯示盡管糊精有良好的降低紫外線對厚垣孢子傷害的效果,但和未進行紫外照射的對照相比,活孢子數(shù)顯著降低,該結果與張擁華等的研究結果一致[17]。

本研究以生物相容性和可濕性粉劑的性質為指標,確定了木霉厚垣孢子可濕性粉劑的組成和比例,其中25%為厚垣孢子粉、4%為十二烷基硫酸鈉、5%為CMC、1%為糊精,其余部分以硅藻土補足。該制劑在潤濕時間、總懸浮率、孢子懸浮率、pH、含水量、活菌數(shù)等方面均符合可濕性粉劑及微生物制劑的相關標準。該制劑組成與李舒雯等研制的內生短短芽胞桿菌可濕性粉劑的助劑組成及含量存在很大的差異[19],與楊春平等[20]的木霉分生孢子可濕性粉劑的助劑則基本相同。這表明不同類型的微生物與助劑的生物相容性存在差異。對于木霉分生孢子和厚垣孢子,兩者雖然孢子類型不同,但由于是同一種真菌,所以與助劑的生物相容性基本一致。因此,在進行微生物可濕性粉劑研制過程中,可以借鑒其他相同屬種微生物可濕性粉劑的組成及制備過程。

成熟的農藥制劑需要綜合多種因素,對微生物農藥來說,這個過程要考慮的更多[15]。本研究初步確定了木霉厚垣孢子可濕性粉劑的各項組分,為制劑的田間應用奠定了基礎,對進一步提高木霉制劑的田間防效具有重要的意義。

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(責任編輯：田 喆)

Preparation of wettable powder formulation ofTrichodermachlamydospores

Zhang Jingjing1,2, Huang Yali1, Ma Hong1, Jia Zhenhua1, Liu Kunang1, Shi Yanmao1

(1. Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Disease, Shijiazhuang 050081, China; 2. School of Chemical Engineering and Technology, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China)

By measuring the biological compatibility between chlamydospore and adjuvants, the adjuvants ofTrichodermachlamydospore wettable powder were determined. The results indicated that diatomite as carrier, calcium lignin sulfonate as wetting dispersant, CMC-Na as stabilizer, dextrin as UV protectant showed favorable biological compatibility to the spore germination and colony growth. The contents of different adjuvants were determined by measuring the performance of wettable powder according to the formulation acquirements. The best formulation was chlamydospore powder 25%, sodium dodecyl sulfate 4%, CMC 5%, and UV protector dextrin 1%. Chlamydospore wettable powder on quality inspection were up to national standard: the number of the live spores was 2.5×109cfu/g，the wetting time was 58 s, the total suspension rate was 78%, spore suspension rate was 85.27%, pH was 6.92, water content was 2.16%. Fineness was 98% over 200 mesh sieve, which came up to the formulation standards. The study provide a new type of Trichoderma preparations for agricultural production.

Trichoderma; chlamydospore; wettable power formulation; biological compatibility

2015-09-18

2015-11-17

河北省自然科學基金項目(C2010001565)；河北省省級科技計劃專項工作類項目(13256504D)

TQ 450.6

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.017

* 通信作者 E-mail:huangyali2291@163.com