滿益龍, 譚新球, 司乃國(guó), 陳 岳,張 卓, 劉 勇, 張德詠*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128; 2. 園藝作物病蟲(chóng)害治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 長(zhǎng)沙 410125; 3. 沈陽(yáng)化工研究院, 沈陽(yáng) 110021)

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不同辣椒炭疽病菌對(duì)唑菌酯的敏感性差異

滿益龍1,2, 譚新球2*, 司乃國(guó)3, 陳 岳2,張 卓2, 劉 勇1,2, 張德詠1,2*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128; 2. 園藝作物病蟲(chóng)害治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 長(zhǎng)沙 410125; 3. 沈陽(yáng)化工研究院, 沈陽(yáng) 110021)

辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)上的重要病害,嚴(yán)重制約辣椒生產(chǎn),唑菌酯防治辣椒炭疽病的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了4種不同炭疽病菌對(duì)唑菌酯的敏感性,并對(duì)其作用靶標(biāo)基因細(xì)胞色素b基因(Cytb)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明:唑菌酯對(duì)ColletotrichumbrevisporumYYGXZ07,C.truncatumCZHP03,C.acutatumHHBY48和C.gloeosporioidesCSLL11的EC50分別為0.098、3.363、10.156和31.982 μg/mL,而且供試菌株在含藥培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率排序?yàn)镃.truncatumCZHP03

辣椒炭疽病菌; 唑菌酯; 生物測(cè)定; 敏感性

唑菌酯是沈陽(yáng)化工研究院自主創(chuàng)制的甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑,具有殺菌活性高、抗病譜廣、環(huán)境相容性好和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)。其作用機(jī)理主要是抑制線粒體復(fù)合物Ⅲ中電子的傳遞。目前相關(guān)研究證明可有效防治黃瓜霜霉病、小麥白粉病,對(duì)水稻紋枯病菌、黃瓜炭疽病菌、油菜菌核病菌、葡萄白腐病菌、蘋(píng)果輪紋病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌等也具有良好的抑菌活性。

炭疽病是危害辣椒生產(chǎn)的主要真菌病害,其病原菌種類(lèi)較為復(fù)雜[1-3],目前我國(guó)已經(jīng)報(bào)道的辣椒炭疽病菌有C.gloeosporioides[1],C.acutatum[16],C.truncatum[3],C.coccodes[14],C.boninense[2], 加上最近分離的新種C.brevisporum(本研究室分離保存,數(shù)據(jù)正在投稿中)共6個(gè)種。不同地區(qū)炭疽病菌常常混合發(fā)生,其優(yōu)勢(shì)種群存在明顯差異。炭疽病菌主要危害辣椒莖稈、葉片和果實(shí),危害嚴(yán)重時(shí)病果率達(dá)40%～60%[10],影響辣椒生產(chǎn)和商品價(jià)值。目前炭疽病的防治主要依賴苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮劑、肟菌酯·戊唑醇水分散粒劑、吡唑醚菌酯乳油等化學(xué)藥劑,但是未見(jiàn)利用唑菌酯防治辣椒炭疽病的報(bào)道。為此本研究采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了不同辣椒炭疽病菌對(duì)唑菌酯的敏感性,在該殺菌劑應(yīng)用早期建立靈敏的敏感性檢測(cè)方法及敏感性基線,對(duì)于正確評(píng)價(jià)唑菌酯對(duì)辣椒炭疽病菌的生物學(xué)活性,開(kāi)展抗藥性早期監(jiān)測(cè), 及早提出藥劑的科學(xué)使用方法和抗藥性治理策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌的培養(yǎng)

供試?yán)苯诽烤也【?C.gloeosporioidesCSLL11,C.acutatumHHBY48,C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07共4個(gè)種,其中設(shè)定C.gloeosporioidesCSLL11為敏感對(duì)照菌株,所有供試菌株由湖南省植物保護(hù)研究所真菌研究室提供,供試菌株保存于4℃冰箱。使用時(shí)先活化菌株, 采用PDA培養(yǎng)基25℃暗培養(yǎng)7 d,采用單孢純化備用。

1.2 供試化學(xué)藥劑

研究使用的唑菌酯原藥由沈陽(yáng)化工研究院司乃國(guó)老師提供,試驗(yàn)時(shí)先用丙酮將原藥溶解,然后通過(guò)滅菌水稀釋,配制成濃度為200 mg/L的母液,并利用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾,用滅菌水對(duì)濾液進(jìn)行定容,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

根據(jù)黃瓜炭疽病菌研究的相關(guān)報(bào)道[17],供試藥劑終濃度設(shè)置為0、2.5、5、10、20 、和40 mg/L 6個(gè)濃度,并分別以清水作對(duì)照,共設(shè)6個(gè)處理。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.4 含藥培養(yǎng)基制備及生長(zhǎng)速率測(cè)定

將配制好的PDA培養(yǎng)基高溫滅菌,待培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí),將濃度為200 mg/L唑菌酯母液稀釋后加到不同體積的培養(yǎng)基中至設(shè)定濃度,并輕輕搖勻。然后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,每皿15 mL。

待培養(yǎng)基表面水汽蒸發(fā)后,將直徑為7 mm的病原菌菌餅置于培養(yǎng)基中央,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),從接種后第2天開(kāi)始,每天采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,共培養(yǎng)8 d,直至清水對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基為止。測(cè)量數(shù)據(jù)利用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 辣椒炭疽菌菌株總RNA的提取

供試菌株的總RNA提取參照Tiangen RNA simple Total RNA Kit的方法進(jìn)行,并稍作修改。抽提的總RNA用新的無(wú)RNase的離心管分裝并保存在-80℃超低溫冰箱備用。

1.6 唑菌酯作用靶標(biāo)基因Cytb的克隆

cDNA的合成參照Vazyme HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行,-20℃保存?zhèn)溆?。通過(guò)已報(bào)道的植物炭疽病菌基因組(C.graminicolaM1.001 登錄號(hào):XM_008101415.1、C.fioriniaePJ7 登錄號(hào):XM_007601458.1)的Cytb基因序列分析比較,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CYB-F1:5′-ATGATTGCGCAGCGGGTGG-3′和CYB-R1:5′-CTACCACGCAAAGGCCARDCCRA-3′(其中R為A或G;D為G或A或T),目的片段大小約為567 bp。

以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系(25 μL)為:10×EasyTaq buffer 2.5 μL、High Pure dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μL、EasyTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.0 μL、引物CYB-F1/ CYB-R1(10 μmol/L)各1.0 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 5 min；94℃ 30 s,58℃或60℃退火30 s(具體根據(jù)菌株確定),72℃45 s,共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min,4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后采用TaKaRa割膠回收試劑盒回收。將獲得的目的回收產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化,具體參考pEASY?-T1 Cloning Kit進(jìn)行。以通用引物M13F、M13R進(jìn)行菌落PCR篩選,將篩選到的陽(yáng)性克隆加入含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,置于200 r/min 37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。

1.7 序列分析及數(shù)據(jù)處理

序列測(cè)定由北京奧科生物公司完成。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析,以已報(bào)道的植物炭疽病菌基因組(C.graminicolaM1.001 登錄號(hào):XM_008101415.1、C.fioriniaePJ7 登錄號(hào):XM_007601458.1)的Cytb基因序列為參考,確定克隆序列為辣椒炭疽菌的Cytb基因序列后,利用DNAMAN version 8.0將基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列,利用ClustalW (http:∥www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)和BioEdit比對(duì)分析不同辣椒炭疽菌的Cytb基因差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同辣椒炭疽病菌在含唑菌酯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率

所有供試菌株經(jīng)單孢分離純化后,采用通用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增ITS序列并測(cè)序驗(yàn)證,確認(rèn)正確后進(jìn)行試驗(yàn)。由于所有供試菌株在含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度比較緩慢，數(shù)據(jù)分析均從接種后第3天開(kāi)始。不同菌株在含藥系列濃度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率存在一定差異。C.truncatumCZHP03對(duì)唑菌酯最為敏感,藥劑處理后菌絲生長(zhǎng)速率明顯低于其他菌株,而且接種后第3天到第8天菌絲生長(zhǎng)速率的波動(dòng)較小;C.gloeosporioidesCSLL11的菌絲生長(zhǎng)速率明顯高于其他菌株,接種后第4天到第8天,生長(zhǎng)速率逐漸下降;C.brevisporumYYGXZ07和C.acutatumHHBY48 菌絲生長(zhǎng)相對(duì)比較穩(wěn)定(圖1a～d)。其生長(zhǎng)速率順序?yàn)镃.truncatumCZHP03

圖1 不同辣椒炭疽病菌在含唑菌酯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率Fig.1 The mycelial growth rate of different Colletotrichum strains causing anthracnose of Capsicum annuum plants on the medium with different concentrations of pyraoxystrobin

2.2 不同辣椒炭疽病菌對(duì)唑菌酯的敏感性

根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑制率,利用SPSS 16.0進(jìn)行線性回歸分析,唑菌酯對(duì)C.brevisporumYYGXZ07的抑制作用最強(qiáng),其EC50為0.098 μg/mL。而對(duì)C.gloeosporioidesCSLL11的EC50為31.982 μg/mL,是C.brevisporumYYGXZ07的327倍。供試菌株EC50的順序?yàn)镃.brevisporumYYGXZ07

表1 不同辣椒炭疽病菌菌株對(duì)唑菌酯的敏感性Table 1 Sensitivity of different Colletotrichum strains to pyraoxystrobin

2.3 辣椒炭疽病菌唑菌酯靶標(biāo)基因Cytb的比較與分析

從表1可以看出,唑菌酯對(duì)不同菌株的EC50存在明顯差異,而且相關(guān)研究表明炭疽病菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑(嘧菌酯)極易產(chǎn)生抗藥性[13]。為進(jìn)一步弄清不同菌株對(duì)唑菌酯的敏感性差異,對(duì)唑菌酯靶標(biāo)基因Cytb進(jìn)行了克隆(圖2a),并進(jìn)行了序列分析。結(jié)果表明:供試菌株C.acutatumHHBY48、C.truncatumCZHP03、C.brevisporumYYGXZ07和C.gloeosporioidesCSLL11與C.fioriniaePJ7 (GenBank 登錄號(hào):XM_007601458.1)的Cytb基因氨基酸序列的同源性分別為100%、83.51%、85.64%和82.98%,而與C.graminicolaM1.001 (GenBank 登錄號(hào):XM_008101415.1)的同源性分別為87.23%、83.51%、86.17%和82.45%。C.acutatumHHBY48、C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07與C.gloeosporioidesCSLL11的Cytb氨基酸序列同源性分別為82.98%、88.30%和87.77%(圖2b)。通過(guò)BioEidt比對(duì)分析,結(jié)合不同辣椒炭疽病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性反應(yīng)[11],發(fā)現(xiàn)氨基酸29～31位、63位、93位、124～126位、130位和180位C.gloeosporioidesCSLL11分別為AVV、H、P、AAA、L和P;其中氨基酸29～31位和180位C.acutatumHHBY48分別為IVA和A,而C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07均分別為VVA和S,124～126位C.acutatumHHBY48、C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07均為GAL。推測(cè)以上位點(diǎn)氨基酸可能與菌株對(duì)唑菌酯的敏感性差異存在一定關(guān)聯(lián)(圖3)。

圖2 4種辣椒炭疽病菌Cytb基因的克隆(a)和系統(tǒng)進(jìn)化分析(b)Fig.2 PCR products of Cytb genes from Colletotrichum truncatum CZHP03, C.gloeosporioides CSLL11, C.acutatum HHBY48 and C.brevisporum YYGXZ07 (a) and their phylogenetic tree based on Cytb amino acids sequence(b) by ClustalW methods

圖3 4種辣椒炭疽病菌Cytb基因氨基酸序列比對(duì)分析Fig.3 Analysis of Cytb amino acids sequence from Colletotrichum acutatum HHBY48, C.brevisporum YYGXZ07, C.truncatum CZHP03 and C.gloeosporioides CSLL11 by BioEidt methods

3 討論

在我國(guó),辣椒年種植面積超過(guò)130萬(wàn)hm2,但是炭疽病菌等病蟲(chóng)害的脅迫[1,3]給辣椒生產(chǎn)帶來(lái)巨大壓力。除了報(bào)道的C.gloeosporioides,近年來(lái)國(guó)際學(xué)者根據(jù)C.truncatum和C.capsici的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定方法,將二者合并為C.truncatum,另外一些危害辣椒的炭疽病菌新種也相繼發(fā)現(xiàn),如四川德陽(yáng)的C.boninense[2]和湖南岳陽(yáng)的C.brevisporum(投稿中),表明我國(guó)辣椒炭疽病菌種群田間存在復(fù)雜多樣性。另外, Diao Yongzhao等利用衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析我國(guó)13個(gè)辣椒種植區(qū)C.truncatum的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)C.truncatum存在有性重組和地域分布[3],我們針對(duì)湖南湘中、湘東、湘南和湘西等地區(qū)C.gloeosporioides進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果(未發(fā)表)。表明辣椒炭疽病田間管理有必要制定分區(qū)管理策略。

辣椒炭疽病防治主要有抗病品種、生物防治和化學(xué)防治[5-9]。目前化學(xué)防治仍然是主要的防治方法,而且主要依靠以甲氧基丙烯酸酯類(lèi)為主的化學(xué)農(nóng)藥[10],但是田間防治效果存在較大波動(dòng),除了環(huán)境因素不同外,很大程度上歸結(jié)于田間炭疽病種類(lèi)復(fù)雜,如湖南長(zhǎng)沙主要以C.gloeosporioides為優(yōu)勢(shì)種群、而湖南岳陽(yáng)主要以C.brevisporum為優(yōu)勢(shì)種群、湖南湘西地區(qū)則以C.acutatum為優(yōu)勢(shì)種群、湘南地區(qū)則以C.truncatum為優(yōu)勢(shì)種群(數(shù)據(jù)未發(fā)表),本研究證實(shí)了不同炭疽病菌對(duì)農(nóng)藥的敏感性存在顯著差異,這與不同辣椒炭疽病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性差異一致[11];而且通過(guò)唑菌酯對(duì)炭疽病菌的作用靶標(biāo)基因Cytb進(jìn)行克隆和分析,推測(cè)其中一些位點(diǎn)的變異與菌株對(duì)唑菌酯的敏感性存在一定的關(guān)聯(lián),相關(guān)位點(diǎn)的確認(rèn)工作正在進(jìn)行中。為此要合理高效使用化學(xué)農(nóng)藥,需要根據(jù)當(dāng)?shù)乩苯诽烤也【N類(lèi)和優(yōu)勢(shì)種群組成,建立分區(qū)指導(dǎo)用藥防治對(duì)策,減少化學(xué)農(nóng)藥的投入,保障辣椒安全生產(chǎn)。

辣椒炭疽病菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類(lèi)(嘧菌酯)敏感性研究表明,其具有獨(dú)特的作用機(jī)制,與已有的所有殺菌劑無(wú)交互抗藥性。但已有研究表明多種植物病原真菌對(duì)該類(lèi)藥劑產(chǎn)生抗藥性自發(fā)突變頻率較高,在高選擇壓下自然界易形成抗藥性病原真菌群體[11-13]。甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑因?yàn)樽饔梦稽c(diǎn)單一,長(zhǎng)期頻繁使用極易產(chǎn)生抗藥性,而且相關(guān)研究報(bào)道證明在包括蘋(píng)果、黃瓜等許多作物上檢測(cè)到甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的抗性病原菌,導(dǎo)致對(duì)甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的直接原因是病原菌細(xì)胞色素b上的氨基酸殘基被取代,以致影響藥劑與靶點(diǎn)的結(jié)合[13],主要是127～147 位和256～296 位氨基酸系列區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基發(fā)生了單點(diǎn)取代突變,其中,在127～147位區(qū)域的取代大多表現(xiàn)較高的抗性水平,最強(qiáng)而且頻次最高的突變發(fā)生在143 位點(diǎn),該位點(diǎn)的氨基酸由甘氨酸變成了丙氨酸，形成G143A 突變體[4]。而我們的研究中4個(gè)供試菌株中C.gloeosporioides的靶標(biāo)基因Cytb的124～126位為AAA,其他3菌株該位點(diǎn)為GAL,與上述報(bào)道結(jié)果一致。而且在我們的室內(nèi)加壓選擇中,發(fā)現(xiàn)C.gloeosporioides和C.acutatum在加壓選擇6代后,菌株產(chǎn)生了明顯的抗藥性,EC50值是出發(fā)菌株的5～10倍(未發(fā)表)。唑菌酯是近年沈陽(yáng)化工研究院自主創(chuàng)新開(kāi)發(fā)的用于防治炭疽病及其他病害的新型殺菌劑,目前在辣椒炭疽病防治方面未見(jiàn)報(bào)道,為此在該殺菌劑應(yīng)用早期建立靈敏的敏感性檢測(cè)方法及敏感性基線,對(duì)于正確評(píng)價(jià)唑菌酯對(duì)辣椒炭疽病菌的生物學(xué)活性,開(kāi)展抗藥性早期監(jiān)測(cè),及早提出藥劑的科學(xué)使用方法和抗藥性治理策略具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Sensitivity differentiation of differentColletotrichumspp. strains causing anthracnose ofCapsicumannuumL.plants to pyraoxystrobin

Man Yilong1,2, Tan Xinqiu2, Si Naiguo3, Chen Yue2, Zhang Zhuo2, Liu Yong1,2, Zhang Deyong1,2

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Province Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops,Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China;3. Shenyang Research Institute of Chemical Industry, Shenyang 110021, China)

The anthracnose disease caused byColletotrichumspp. is an important limited factor in pepper production in the world. Many chemicals have been used to control this disease in the fields. However, so far, pyraoxystrobin, a new strobilurin fungicide, hasn’t been reported in the disease control. Therefore, sensitivities of four differentColletotrichumstrains to pyraoxystrobin were determined through bioassay of mycelial growth rate, and target gene of pyraoxystrobin, cytochrome b (Cytb) of differentColletotrichumspecies was cloned and analyzed in this study. The results showed that the EC50value of pyraoxystrobin toC.brevisporumYYGXZ07,C.truncatumCZHP03,C.acutatumHHBY48 andC.gloeosporioidesCSLL11 was 0.098,3.363,10.156 and 31.982 μg/mL,respectively. The mycelial growth rate was ranked asC.truncatumCZHP03

Colletotrichumspp.; pyraoxystrobin; bioassay; sensitivity

2016-03-06

2016-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(31471831); “十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2014BAD05B04-4)

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.030

* 通信作者 E-mail：tanxinqiu2008@163.com；dyzhang78@163.com