張 淦，程迅生，陳聰聰，陳肖松，馬武秀，王 崎，符來想

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兩種支架材料搭載骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合高壓氧修復海水浸泡兔橈骨骨缺損

張 淦1，程迅生1，陳聰聰1，陳肖松1，馬武秀1，王 崎2，符來想2

目的 探討n-HA/明膠、β-TCP/明膠搭載骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)聯(lián)合高壓氧修復海水浸泡兔橈骨開放性骨缺損的效果。方法 45只新西蘭大耳兔，在兔雙側(cè)橈骨中段制作15 mm的骨缺損區(qū)，雙前肢人工海水浸泡3 h，制作成海水浸泡開放性骨缺損模型。將實驗兔隨機分成3組即對照組、n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組，每組15只。傷口浸泡于人工海水3 h，徹底清創(chuàng)后，對照組在骨缺損區(qū)單純植入BMSCs，n-HA/明膠組植入n-HA/明膠/BMSCs，β-TCP/明膠組植入β-TCP/明膠/BMSCs。手術(shù)后立即進行高壓氧療，每天1次，連續(xù)14 d。于手術(shù)后第4、8、12周攝片后分批處死后取材,行組織學和生物力學檢測。比較各組缺損修復的效果。結(jié)果 ① X線片檢查：術(shù)后4周對照組、n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組骨缺損區(qū)有薄云狀骨痂陰影，陰影區(qū)域n-HA/明膠組>β-TCP/明膠組>對照組。術(shù)后8周，對照組少量骨痂形成；n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組新生骨痂大量形成。術(shù)后12周，對照組骨缺損未完成修復；n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組皮質(zhì)連續(xù)性好，髓腔再通,基本完成修復；② 骨痂灰度值測量：相同時間觀察點，骨痂灰度值n-HA/明膠組>β-TCP/明膠組>對照組。術(shù)后第 12 周時，對照組、n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組骨痂灰度值差異有統(tǒng)計學意義

海水浸泡；骨缺損；高壓氧；骨髓間充質(zhì)干細胞；n-HA/明膠；β-TCP/明膠

海水浸泡開放性骨缺損是一個新的研究領(lǐng)域。由于海水浸泡后骨膜成骨能力下降[1]，相關(guān)生長因子表達延遲并減弱[2]，導致海水浸泡骨缺損比單純的骨缺損的治療更復雜和困難，納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite，n-HA)/明膠和β-三磷酸鈣(β-tricalciumphosphate,β-TCP) /明膠在治療單純的骨缺損中取得良好的效果。將n-HA/明膠支架移植入SD大鼠的顱骨缺損處，8周后成功修復顱骨缺損[3]。研究[4]表明β-TCP/明膠作為支架搭載自體干細胞和BMP-2能成功地修復單純的骨缺損。高壓氧在單純骨缺損治療取得良好的效果。該實驗探索n-HA/明膠和β-TCP/明膠在修復海水浸泡骨缺損中的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 n-HA/明膠、β-TCP/明膠(山東省醫(yī)用高分子材料重點實驗室)；Olympus光學顯微鏡、OLYMPUS-IX71倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)；生物安全柜(濟南鑫貝生物科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；臺式離心機(湖南湘儀儀器有限公司)；動物實驗高壓氧艙 (上海楊園醫(yī)用氧艙廠)；骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)完全培養(yǎng)基、BMSCs(廣東賽業(yè)生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(美國Sigma公司)；EDTA脫鈣液、4%多聚甲醛(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的培養(yǎng) BMSCs在 MSCs生長培養(yǎng)基中復蘇和培養(yǎng)。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境中孵育，2～3 d半量換液，當80%融合，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化3 min，1 ∶2傳代。每天觀察細胞形態(tài)和生長情況。傳至3代的細胞用于實驗。

1.2.2 BMSCs與支架復合 將已經(jīng)消毒的支架n-HA/明膠和β-TCP/明膠分別置于24孔板中，生長培養(yǎng)基預濕。收集傳至3代的BMSCs制成密度2×107個/ml的細胞懸液。吸取200 μl的細胞懸液滴加在支架的頂部，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件的孵箱2 h。隨后追加2 ml MSCs生長培養(yǎng)基，再次置于孵箱備用。

1.2.3 動物實驗 45只新西蘭大耳兔(2.5～3.0 kg)由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供,隨機分成3組即對照組、n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組，每組15只。實驗動物模型制作參考文獻[5]報道的方法，采用3%戊巴比妥(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，雙側(cè)前肢剃毛。在橈骨前外側(cè)制作約3 cm的皮膚切口，分離組織充分暴露橈骨，在橈骨中段制作15 mm的骨缺損。實驗兔前肢放入制備好的人工海水中浸泡3 h后，制作成海水浸泡開放性骨缺損模型。徹底清創(chuàng)后，n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組分別移植預先制備好的n-HA/明膠/BMSCs和β-TCP/明膠/BMSCs，對照組注射BMSCs，逐層縫合傷口。術(shù)后立即行高壓氧治療，每天1次，連續(xù)14 d[6]。每天給予青霉素40萬單位肌肉注射。

1.2.4 觀察指標 ① X線片檢查：術(shù)后4、8、12周分別拍攝橈骨X線片，觀察橈骨缺損修復情況；② 骨痂灰質(zhì)度測定：X線片中隨機選取骨缺損區(qū)5個點，用photoshop 7.0軟件分析各觀察點的灰度值，并計算平均值；③ 骨組織染色：在術(shù)后4、8、12周攝片后，各組隨機處死4只，收集橈骨缺損標本，固定、脫鈣；④ 生物力學檢測：術(shù)后12周后，各組剩余3只兔處死后取出橈骨，行三點應力實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，多組均數(shù)組間比較采用方差分析及兩兩比較Bonferroni檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況 有2只實驗兔在麻醉后死亡，立即補齊。術(shù)后1 d，實驗兔開始活動和進食，HA/明膠組有1只兔傷口出現(xiàn)感染，青霉素80萬單位肌注，2 d后死亡，事后補做1只實驗兔。其余實驗兔傷口未出現(xiàn)感染，一期愈合。

2.2 細胞形態(tài)學觀察 BMSCs復蘇后3～4 h觀察可見細胞開始貼壁，細胞呈圓形。24 h后細胞幾乎全部貼壁，形態(tài)呈扁圓形或梭形；3～4 d細胞增殖迅速，第7天鋪滿培養(yǎng)皿80%面積，呈旋渦狀緊密排列。傳代培養(yǎng)后BMSCs生長迅速，6～7 d傳代1次，傳代培養(yǎng)后BMSCs呈長梭形(圖1)。

圖1 BMSCs P3傳代3 d ×10

2.3 影像學觀察 術(shù)后 4周，對照組、n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組均有模糊新生骨痂形成，HA/明膠組最多，對照組最少。術(shù)后8周后，對照組骨痂少量增加，n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組都用大量骨痂生成，新生骨痂灰質(zhì)度也增加，n-HA/明膠組骨痂形成最多，術(shù)后12周，對照組留有大塊缺損，未完成修復。n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組骨缺損基本修復，皮質(zhì)連續(xù)性好、塑形好、髓腔再通。各個時間觀察點骨痂灰質(zhì)度n-HA/明膠組>β-TCP/明膠組>對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組骨痂灰度值比較見表1。

表1 各組不同時間點骨痂灰質(zhì)度±s)

與對照組比較：*P<0.05；與n-HA/明膠組比較：#P<0.05

2.4 組織學觀察 術(shù)后4周對照組有少量骨小梁形成；n-HA/明膠組和β-TCP/明膠組有較多新生骨小梁形成，骨小梁排列紊亂，支架材料開始降解，n-HA/明膠組骨小梁較對照組多。術(shù)后8周，對照組有新生骨小梁形成，未見板層骨形成；n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組支架已經(jīng)完全降解，形成少量的板層骨，骨小梁排列較為整齊，主要是纖維骨樣組織。n-HA/明膠組板層骨比β-TCP/明膠組多。術(shù)后12周，對照組形成少量板層骨，缺損區(qū)主要被纖維組織填充； n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組大量的板層骨形成，骨小梁排列規(guī)則，髓腔再通,哈弗式系統(tǒng)形成，骨缺損完全修復(圖3)。

圖2 各組影像學檢查

A：對照組；B：n-HA/明膠組；C：β-TCP/明膠組；1：術(shù)后4周；2：術(shù)后8周；3：術(shù)后12周

圖3 組織學觀察 HE×200

A：對照組；B：n-HA/明膠組；C：β-TCP/明膠組；1：術(shù)后4周；2：術(shù)后8周；3： 術(shù)后12周

2.5 生物力學觀察 對照組抗折力為(86.6±4.8)；n-HA/明膠組抗折力為(116.6±4.7)；β-TCP/明膠組為(106.9±4.8)；標準骨組為(122.4±3.4)。標準骨組>n-HA/明膠組>β-TCP/明膠組>對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

種子細胞是骨組織工程的重要組成部分。BMSCs有自我更新和多向分化的潛能，是應用最廣泛的種子細胞。BMSCs種子細胞濃度也是影響成骨的一個重要因素，田志逢 等[7]分別將濃度1×108/L、5×108/L、1×109/L、5×109/L的BMSCs接種于骨基質(zhì)明膠，移植入SD大鼠橈骨缺損，4組成骨效果隨著初始細胞濃度增加，成骨效果增強，但是到達一定濃度，成骨能力不增加。田志逢 等[7]認為接植于支架上細胞濃度不小于5×108/L。本實驗的BMSCs濃度為2×109/L，符合上述要求。BMSCs在移植入骨缺損處能轉(zhuǎn)化成成骨細胞原因：① 骨缺損處形成的成骨微環(huán)境。將經(jīng)過成骨誘導后的脂肪基質(zhì)細胞植入肌肉區(qū)不能成骨,植入骨缺損區(qū)成骨明顯[8]。證明了成骨微環(huán)境對干細胞成骨分化的重要影響；② 高壓氧。高壓氧具有促進MSCs向成骨方向分化的作用[9]；③ 磷酸鈣陶瓷。磷酸鈣陶瓷具有骨誘導活性，在國際上逐漸得到公認[10]。

天然骨是由無機質(zhì)和有機質(zhì)組成，無機質(zhì)主要包含n-HA，有機質(zhì)主要包含膠原。n-HA/明膠和β-TCP/明膠與天然骨相似的組成。明膠是膠原的代謝物，具有可降解性、無免疫原性、良好的生物相容性，廣泛應用于組織工程支架。用明膠作為支架搭載干細胞移植入兔骨缺損處，術(shù)后12周成功修復了兔橈骨缺損[11]。明膠的缺點是降解速度快、沒有足夠的力學強度，當明膠與n-HA或者β-TCP混合，可以提高支架的力學強度和降低支架的降解速度。Azami et al[3]制作的n-HA/明膠與成骨細胞培養(yǎng)通過細胞增殖實驗和堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅(ARS)染色顯示n-HA/明膠不抑制成骨的增殖，并且能促進成骨細胞分化和基質(zhì)的礦化，有良好的生物相容性。移植入SD大鼠的顱骨缺損模型，8周后修復骨缺損。在本實驗中n-HA/明膠組X線片檢測術(shù)后12周可見骨缺損完全修復，髓腔再通。HE染色術(shù)后12周新生骨趨于成熟和自然骨的構(gòu)成一致。β-TCP/明膠作為MSCs或者BMP-2的載體，成功修復了骨缺損[4,12]。在本實驗也得到證實，X線片和HE染色結(jié)果都表明兔橈骨骨缺損基本修復，但是在成熟度上欠缺。在n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組HE染色中未發(fā)現(xiàn)免疫細胞，提示n-HA/明膠和β-TCP/明膠兩種支架具有良好的生物相容性，不會引起免疫反應。

雖然兩種材料都能修復骨缺損，但是n-HA/明膠還是優(yōu)于β-TCP/明膠。n-HA/明膠組X線片顯示8周骨痂灰質(zhì)度強于β-TCP/明膠，提示n-HA/明膠組骨缺損修復的進程提前。力學實驗顯示HA/明膠組的力學強度強于β-TCP/明膠組?？赡茉? ① 納米級HA修復骨缺損能力明顯優(yōu)于微米級HA[13]，HA比β-TCP具有更好的生物相容性[14]；② n-HA/明膠組的n-HA是納米結(jié)構(gòu),自然骨的HA也主要是納米結(jié)構(gòu)，而β-TCP/明膠組的β-TCP是微米結(jié)構(gòu)，n-HA在自然骨，更有利于n-HA的吸收和利用。

高壓氧也是促進骨缺損修復的一個重要因素。骨缺損區(qū)血運遭到嚴重破壞導致無法獲取充分的氧氣和營養(yǎng)，海水浸泡的骨缺損加重了缺血低氧的情況。血管化與成骨密切相關(guān)，血管網(wǎng)形成和充足的血流量是組織工程骨修復骨缺損成功的關(guān)鍵。高壓氧具有促進新生血管形成的作用[15]，新生的血管為新生骨組織再生提供充足的原料和營養(yǎng)，從而加速骨再生。同時高壓氧的促進干細胞成骨分化[9]，在骨再生方面起到重要作用。研究[4]表明高壓氧有促進海水浸泡骨缺損修復的作用。

綜上所述，n-HA/明膠和β-TCP/明膠復合BMSCs聯(lián)合高壓氧能修復海水浸泡開放性骨缺損。n-HA/明膠支架在治療海水浸泡開放性骨缺損治療中優(yōu)于β-TCP/明膠。

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BMSCs seeding in two scaffold incorporation with hyperbaric oxygen treat seawater immersed bony defect

Zhang Gan, Cheng Xunsheng, Chen Congcong, et al

(DeptofOrthopedics, 105HospitalofPLA,Hefei230031)

Objective To investigate the efficiency of n-HA/gelatin and β-TCP/gelatin scaffold incorporation with HBO to enhance seawater immersed open bone defect. Methods A 15 mm radius defect was made in 45 rabbits, and then wound limbs were immersed in seawater for 3 h. The rabbit model of bone defect immersed by seawater was established. All rabbits were randomly divided into 3 groups. BMSCs were implanted in control group，n-HA/gelatin/BMSCs were implanted into n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin/BMSCs were implanted in β-TCP/gelatin group. Each rabbit received HBO for 14 days after surgery. X-ray, hostologic and mechanical analysis were used to evaluate the repair in each group. Results ① X-ray showed that 4 weeks after surgery, bone defect area in control group, n-HA/gelatin group, β-TCP/gelatin group had thin cloudy callus shadow, the area of callus shadow in n-HA/gelatin group>that in β-TCP/gelatin group> that in control group. After 8 weeks,a small amount of callus formed in control group, a large amount of new bone callus formed in n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group. After 12 weeks, in control group the repairment of bone defect unfinished; bone defect was basically completed to repair in n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group with good cortical continuity, recanalizated marrow cavity. ② Bone callus grey value demonstrated 12 weeks after surgery, bone callus grey value had statistical significance in control groups, n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group(P<0.05). ③ HE staining indicated the formation of bone trabecula in both n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group was more than that in control group, and residual material could be found in n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group 4 weeks after surgery. After 8 weeks, no lamellar bone formed in control group, a large number of lamellar bone formed in group n-HA/gelatin and β-TCP/gelatin. After 12 weeks, a small amount of lamellar bone formed in control group; a large number of lamellar bone formed in n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group, residual materials in two groups were completely degraded. ④ Biomechanical testing showed that 12 weeks after surgery , the maximum bending force in n-HA/gelatin group>that in β-TCP/gelatin group>that in control group, the bending force in n-HA/gelatin group and β-TCP/gelatin group were close to normal bone. Conclusion Scaffold of n-HA/gelatin/BMSCs and β-TCP/gelatin/BMSCs incorporation with HBO are effective to treat seawater immersed bone defect, and that n-HA/gelatin scaffold is more excellent than that of β-TCP/gelatin scaffold.

eawater immersed; bone defect; bone marrow mesenchymal stem cells; hyperbaric oxgen; n-HA/gelatin; β-TCP/gelatin

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.007.html

2016-05-19接收

南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新重點課題(編號：11Z011)

安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院1骨一科、2骨三科，合肥 230031

張 淦，男，碩士研究生；

程迅生，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail:18909696280@163.com

(P<0.05)；③ 組織學觀察：術(shù)后第 4周，n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組有新生骨小梁生成，骨小梁形成量n-HA/明膠組>β-TCP/明膠組>對照組，可見部分移植的支架材料殘余；術(shù)后第8周，對照組未見板層骨形成，n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組有大量板層骨形成，術(shù)后第12周，對照組少量板層骨，n-HA/明膠組、β-TCP/明膠組大量板層骨形成，兩組移植的支架材料均消失；④ 生物力學檢測：術(shù)后12周各組最大抗折力n-HA/明膠組>β-TCP/明膠組>對照組，n-HA/明膠組和β-TCP/明膠組抗折力接近于正常骨。結(jié)論 n-HA/明膠/BMSCs 聯(lián)合高壓氧和β-TCP/明膠/BMSCs聯(lián)合高壓氧均能修復海水浸泡開放性骨缺損。n-HA/明膠/BMSCs效果優(yōu)于β-TCP/明膠/BMSCs。

R 683.41

A

1000-1492(2016)10-1425-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.007