李國威， 傅潤澤， 沈 建， 樊 文， 徐文其

(1廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東 湛江，524088；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海 200092；3上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

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微酸性電解水對活品蝦夷扇貝存活率的影響及殺菌效果

李國威1， 傅潤澤2,3， 沈 建2， 樊 文2,3， 徐文其2

(1廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東 湛江，524088；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海 200092；3上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

以活品蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)為實(shí)驗(yàn)對象，用不同理化性質(zhì)的微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water，SAEW)處理受試扇貝，并用副溶血性弧菌人工浸染經(jīng)微酸性電解水處理過的扇貝，檢測其存活率、微酸性電解水殺菌效果、副溶血性弧菌的變化規(guī)律，以及蝦夷扇貝在不同電解水處理階段的菌相。結(jié)果顯示，微酸性電解水處理1 min、2 min、4 min，扇貝存活率均為80%，處理8 min存活率為82%，均高于染菌組和對照組；電解水處理時間與細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與處理時采用的電解水有效氯濃度沒有顯著性關(guān)系(P>0.05)。采用電解水處理8 min后，活品蝦夷扇貝體內(nèi)染上的副溶血性弧菌數(shù)量從>1 100 MPN/g降至28 MPN/g。扇貝初期主要菌群為假單胞菌和弧菌，在經(jīng)過微酸性電解水處理后，其體內(nèi)的菌群趨于復(fù)雜化，優(yōu)勢菌群有所改變，細(xì)菌總數(shù)有所下降。24 h后經(jīng)電解水處理或者未處理的蝦夷扇貝體內(nèi)優(yōu)勢腐敗菌均為假單胞菌。研究表明，SAEW在蝦夷扇貝凈化中具有一定的應(yīng)用潛力。

活品蝦夷扇貝；微酸性電解水；存活率；殺菌效果；副溶血性弧菌；菌相

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是大型低溫海產(chǎn)雙殼貝類，于20世紀(jì)80年代初引入中國，現(xiàn)已在遼寧、山東等地進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖，是中國北方沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)型養(yǎng)殖貝類之一。作為非選擇濾食性生物，蝦夷扇貝在養(yǎng)殖過程中非常容易富集環(huán)境中的微生物[1]，在捕獲后的流通環(huán)節(jié)中也容易發(fā)生交叉污染。嚴(yán)重的微生物污染不僅使扇貝自身發(fā)生病害，造成運(yùn)輸過程中的死亡，不良的生理狀態(tài)同時也會影響到其風(fēng)味品質(zhì)。另外，迅速繁殖的病原微生物也會產(chǎn)生食品安全問題，如蝦夷扇貝極易受到副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的感染[2-3]。有報(bào)告表明，雙殼貝類中副溶血性弧菌檢出率接近30%[4]。

貝類前期的凈化殺菌手段主要有含氯消毒劑殺菌、紫外線殺菌及臭氧殺菌[5]。含氯消毒劑是最早應(yīng)用于貝類凈化的化學(xué)試劑，因其味道會影響品質(zhì)，故許多國家和地區(qū)現(xiàn)在已不再使用；紫外線處理方式受到當(dāng)?shù)睾Ｋ疁啙岫?、顏色和可溶性鐵鹽的影響，也具有相當(dāng)?shù)木窒扌?；目前適用的貝類凈化手段是臭氧殺菌。開發(fā)新型貝類凈化殺菌手段也是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

電解水又稱電解離子水或者氧化電位水[6]，其中微酸性電解水(Slightly Acidic Electrolyzed Water，SAEW)制取方便、廣譜高效、分解快且無氣味殘留，有研究表明，微酸性電解水對植物或者動物基本上沒有毒性[7-9]。目前尚未有將微酸性電解水應(yīng)用于活品貝類凈化的相關(guān)報(bào)道，本研究以活品蝦夷扇貝為實(shí)驗(yàn)對象，采用不同理化性質(zhì)的微酸性電解水處理受試扇貝，探討其對活品蝦夷扇貝的影響，為微酸性電解水在活品蝦夷扇貝凈化中的實(shí)際應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

底播蝦夷扇貝購自大連獐子島，平均殼寬(78±11.2)mm，重量(64.3±8.4)g。選取鮮活個體當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，放入事先搭建的低溫循環(huán)水(水溫10 ℃)?；钇脚_中，靜養(yǎng)24 h后，除去死亡個體，待其生理狀況穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

主要儀器：LRH-70生化培養(yǎng)箱，VS-1300型超凈工作臺，LS-B50L型蒸汽滅菌鍋，PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)，RC～3F型高質(zhì)量有效氯測定儀，顯微鏡，拍打式均質(zhì)器，低溫?；钇脚_(自制，主要包括凈化過濾裝置和循環(huán)降溫系統(tǒng))，電解水裝置(一室型，實(shí)驗(yàn)室自制)。

主要生化試劑：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，革蘭氏染色試劑(杭州微生物試劑有限公司)，O/F培養(yǎng)基，氧化酶試紙，3%NaCl堿性蛋白胨水，硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂，3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)，煌綠乳糖膽鹽(BGLB)，生化試劑鑒定盒(廣東環(huán)凱微生物試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 微酸性電解水的制備

微酸性電解水制取裝置主要由耐腐蝕塑料電解槽、鉑鈦合金電極片、電源系統(tǒng)及控制系統(tǒng)等構(gòu)成。使用濃度0.06%的氯化鈉(NaCl)溶液和不同體積(μL)的鹽酸(HCl)(質(zhì)量濃度36.5%)，電解后獲得微酸性電解水。電解條件：電流1.8 A，極板間距20 cm，時間10 min。表1為所得電解水的物理參數(shù)。氧化還原電位(ORP)采用pH計(jì)，在電極轉(zhuǎn)換后利用其電位測定功能進(jìn)行測定。有效氯質(zhì)量濃度(ACC)采用RC-3F型高質(zhì)量有效氯測定儀測得。所有電解水制備后立即使用。電解水物理參數(shù)測量平行次數(shù)為3次。

表1 不同電解水的物理參數(shù)

1.2.2 副溶血性弧菌菌液的擴(kuò)增及染菌處理

將斜面保存的副溶血性弧菌菌種(ATCC17802)擴(kuò)增活化。實(shí)驗(yàn)樣品分為6組，每組50只。其中，1組不做任何處理(對照組)，1組接種副溶血性弧菌后不作處理(染菌組)，其余4組(實(shí)驗(yàn)組)按照預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)[10]，確定處理時間分別為1 min、2 min、4 min和8 min。實(shí)驗(yàn)前在暫養(yǎng)箱里加入含有副溶血性弧菌的海水，每箱水約60 L，水溫10 ℃，海水中副溶血性弧菌濃度約為1×105cfu/100 mL。將對照組之外的5組放入染菌海水中，26 ℃室溫下放置1 h，使副溶血性弧菌均勻分布至扇貝體內(nèi)。

1.2.3 存活率測定

結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將染菌扇貝取出放入電解水(0.06% NaCl+650 μL HCL，理化參數(shù)見表1)中分別處理，與染菌組和對照組同時取樣檢測，每批取樣5個，剩余的扇貝每隔2 h觀察其存活率并統(tǒng)計(jì)。

S=(Ns/Nt)×100%

式中：S—存活率，%；Ns—觀察時扇貝存活數(shù)量，個；Nt—實(shí)驗(yàn)開始時扇貝總數(shù)，個。

1.2.4 殺菌效果測定

除閉殼肌外將扇貝全肉用無菌研缽搗碎，制成1∶10的樣品勻液，每組均按照國標(biāo)[11]中的操作梯度稀釋并測定菌落總數(shù)。設(shè)3個稀釋度，每個稀釋度做2次平行實(shí)驗(yàn)，以生理鹽水為空白作對照實(shí)驗(yàn)，用不同時間和不同ACC的電解水處理，處理結(jié)果以log10cfu/g表示。大腸菌群采用國標(biāo)[12]中的大腸菌群平板計(jì)數(shù)法，其結(jié)果以cfu/g表示。

1.2.5 副溶血性弧菌測定

將上述扇貝稀釋液按照國標(biāo)[13]處理，對所有生長的增菌液做生化鑒定篩選，將結(jié)果按照國標(biāo)[13]的方法記錄并報(bào)告。

1.2.6 菌相的生化檢測

菌相分析采用生化實(shí)驗(yàn)鑒定盒鑒定。根據(jù)伯杰氏細(xì)菌手冊(第八版)[14]及DORTHE等[15]提出的水產(chǎn)品細(xì)菌鑒定流程，取4個點(diǎn)做菌相分析，每個菌相點(diǎn)取30個進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，鑒定到屬，結(jié)果以每種細(xì)菌占挑取的總菌落數(shù)所占百分比表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品做3個平行，使用軟件SPSS19.0分析處理時間和鹽酸濃度對細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的相關(guān)性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性界值以P<0.05為顯著。同時采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖及分析。

2 結(jié)果

2.1 微酸性電解水處理對染菌后扇貝的存活率影響

由圖1可見，各組扇貝8 h前的存活率均超過90%，隨著時間的延長，其存活率逐漸下降。10 h后染菌組和對照組的存活率迅速下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)束(12 h)時對照組的存活率為72%，染菌組的存活率為70%。經(jīng)微酸性電解水處理的各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，1 min、2 min、4 min組存活率均為80%，8 min處理組達(dá)到82%。該實(shí)驗(yàn)以存活率為標(biāo)準(zhǔn)，初步發(fā)現(xiàn)微酸性電解水處理的脅迫作用對活品蝦夷扇貝并未造成致命性的影響。

圖1 電解水處理后蝦夷扇貝存活率Fig.1 Survival rate of the scallop after electrolyzed water treatment

2.2 處理時間對蝦夷扇貝體內(nèi)細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的影響

采用電解水處理蝦夷扇貝后，其體內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的數(shù)量隨著時間的延長而呈現(xiàn)降低的趨勢(圖2)。數(shù)據(jù)分析表明，細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的數(shù)量隨著處理時間具有顯著性差異，其相關(guān)性為負(fù)相關(guān)(P≤0.05)，在8 min時細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群分別降至4.8log10cfu/g和500 cfu/g，與初始相比，分別下降了65%和74%。

圖2 蝦夷扇貝體內(nèi)細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群隨電解水處理時間的變化Fig.2 Changes of bacteria and coliforms in the live scallop as different time of electrolyzed water treatment

2.3 電解水ACC對細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的影響

經(jīng)電解水處理后，細(xì)菌總數(shù)最高的是ACC為34 mg/L的微酸性電解水，ACC 41 mg/L的微酸性電解水對細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群均有最高的殺菌效率(圖3)。通過SPSS19.0分析，有效氯濃度和殺菌效率并無顯著相關(guān)性(P≤0.05)。

圖3 電解水對蝦夷扇貝細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)量的影響Fig.3 Changes of bacteria and coliforms in the live scallop after electrolyzed water treatment

2.4 對扇貝體內(nèi)染副溶血性弧菌的影響

由圖4可看出，與染菌組>1 100 MPN/g相比，處理時間1 min組扇貝體內(nèi)的副溶血性弧菌下降至150 MPN/g，而且處理時間越長其數(shù)量越少，最長的8 min組扇貝體內(nèi)副溶血性弧菌僅為28 MPN/g。

圖4 電解水處理染菌蝦夷扇貝體內(nèi)副溶血性弧菌的變化Fig.4 Changes of Vibrio parahaemolyticusin the contaminated scallop treated by electrolyzed water

2.5 蝦夷扇貝各階段菌相分析

蝦夷扇貝初始的優(yōu)勢菌包括：假單胞菌屬(31.25%)、弧菌屬(25%)、產(chǎn)堿桿菌(18.75%)、奈瑟氏菌(12.5%)、丹毒絲菌(6.25%)和色桿菌(6.25%)(表3)。經(jīng)電解水處理后，蝦夷扇貝的菌相有了很大的變化，總共檢出13種屬的細(xì)菌(表4)，其主要優(yōu)勢菌包括：由假單胞菌屬變?yōu)榛【鷮?25%)、克雷伯氏菌屬(16.67%)、棒狀桿菌屬(16.67%)、腸桿菌屬(16.67%)，這4個屬的細(xì)菌占了電解水處理后細(xì)菌種類的75%，其余9種屬的細(xì)菌占比25%。

表3 生鮮蝦夷扇貝菌相組成

表4 電解水處理后蝦夷扇貝菌相組成

未經(jīng)電解水處理，24 h后，蝦夷扇貝體內(nèi)的優(yōu)勢菌包括假單胞菌屬(35%)、弧菌屬(25%)、氣單胞菌屬(20%)；非優(yōu)勢菌包括發(fā)光桿菌屬(5%)、色桿菌屬(5%)、鄰單胞菌屬(5%)和莫拉斯菌屬(5%)，4種屬的細(xì)菌只占總體菌相的1/5(表5)。經(jīng)過電解水處理，24 h后，蝦夷扇貝體內(nèi)的優(yōu)勢菌包括假單胞菌屬(44.44%)、氣單胞菌屬(16.67%)、弧菌屬(16.67%)、鄰單胞菌屬(11.11%)；非優(yōu)勢菌有色桿菌屬(5.56)和莫拉氏菌屬(5.56)(表6)。

3 討論

3.1 扇貝存活率的變化

根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，凈化過程一般不會造成凈化對象的大量死亡[15]。本實(shí)驗(yàn)中的較高死亡率，推測是由于扇貝在運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室過程中因機(jī)械損傷引起應(yīng)激反應(yīng)，同時又受到染菌處理和環(huán)境變化等多種因素聯(lián)合作用而造成。

3.2 微酸性電解水處理后微生物總數(shù)的變化

實(shí)驗(yàn)中活品蝦夷扇貝自身具有免疫系統(tǒng)，與微酸性電解水同時發(fā)揮作用。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HAO等[16]研究電解水對芫荽葉的殺菌效率存在一定的數(shù)量差異。這可能是由于采用微酸性電解水處理扇貝時，扇貝生存環(huán)境相對自然環(huán)境變得惡劣，濾水能力受到抑制，降低了與外界的物質(zhì)交換能力，電解水無法進(jìn)入殼內(nèi)和體內(nèi)進(jìn)行完全消毒。

表5 生鮮蝦夷扇貝24 h后菌相組成

表6 電解水處理蝦夷扇貝24 h后菌相組成

3.3 微酸性電解水處理后大腸菌群的變化

可上市的養(yǎng)殖貝類中大腸桿菌的安全限量，與歐盟制定的《雙殼貝類和投放市場的衛(wèi)生條件規(guī)定》(93/51/EEC)[17]和中國的《貝類凈化技術(shù)規(guī)范》[18]是一致的，均為≤3 cfu/g。本研究中，蝦夷扇貝體內(nèi)的大腸菌群遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上述生食限量標(biāo)準(zhǔn)，但扇貝的食用方式主要是煮熟食用，國內(nèi)并無相關(guān)規(guī)定，還有待進(jìn)一步完善。

3.4 微酸性電解水處理后副溶血性弧菌數(shù)量的變化

副溶血性弧菌主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚蝦貝類等海產(chǎn)品體內(nèi)，是引起食源性疾病的主要病原之一[19]。相關(guān)文獻(xiàn)中，微酸性電解水的殺菌效果驗(yàn)證多數(shù)是對食物表面消毒[7, 20]、食品加工表面材料[21]，或者對純菌液的殺滅效果[22-23]，均可完全殺滅。本研究中，可能由于實(shí)驗(yàn)染副溶血性弧菌的濃度較高，與實(shí)際情況相比是一種非常極端的情況，在實(shí)驗(yàn)后期微酸性電解水有效殺菌成分已經(jīng)消耗完畢的情況下，無法完全殺滅已經(jīng)浸染入扇貝腸道內(nèi)的副溶血性弧菌，導(dǎo)致結(jié)果與上述研究結(jié)果有所差距。

3.5 扇貝菌相的變化

水產(chǎn)品在相同的地理?xiàng)l件下，同類型產(chǎn)品中只有一種或幾種微生物總是作為優(yōu)勢腐敗菌出現(xiàn)。水產(chǎn)品貝類的優(yōu)勢菌群為假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、弧菌、腸桿菌等[24]。本實(shí)驗(yàn)蝦夷扇貝24 h后的優(yōu)勢菌群為假單胞菌，假單胞菌為專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，是假單胞菌科的細(xì)菌模式屬，其廣泛存在于海水、淡水和土壤中，是一種條件致病菌。研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌是太平洋牡蠣在0 ℃、5 ℃和10 ℃條件下的優(yōu)勢腐敗菌[25]，同時也是多種水產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌[26-27]。本實(shí)驗(yàn)中，鮮活蝦夷扇貝凈化前后其體內(nèi)的優(yōu)勢菌群主要為假單胞菌，在后續(xù)的保活流通中需要特別注意。

4 結(jié)論

利用微酸性電解水處理活品蝦夷扇貝可以提高扇貝的存活率；微酸性電解水的處理時間與細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的數(shù)量有顯著正相關(guān)(P>0.05)，與有效氯質(zhì)量濃度(ACC)沒有相關(guān)性(P<0.05)；微酸性電解水在凈化后可以殺滅相當(dāng)一部分的副溶血性弧菌，但如果副溶血性弧菌濃度過高則需要考慮細(xì)菌殘留問題；蝦夷扇貝在電解水處理后，后期繁殖的優(yōu)勢菌是假單胞菌。

本研究的不足之處是：未檢測經(jīng)微酸性電解水處理后活品蝦夷扇貝的生理活性變化；微酸性電解水對蝦夷扇貝可能會造成扇貝的應(yīng)激反應(yīng)，沒有對這些反應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。微酸性電解水如果應(yīng)用于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，其成本和制作工藝是否需要改進(jìn)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

□

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The effects of slightly acidic electrolyzed water on the disinfection and survivial rate of live Japanese scallop (Patinopectenyessoensis)

LI Guowei1,2, FU Runze2,3, SHEN Jian2, FAN Wen2,3, XU Wenqi2

(1 College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution, National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang),Zhanjiang 524088, China; 2 Fishery Machinery and Instrument Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200092, China; 3 College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The aims of this study were to test the feasibility of slightly acidic electrolyzed water directly used for sterilization and purification of live Japanese scallop. The live Japanese scallop as test object were treated with different physicochemical properties of slightly acidic electrolyzed water (SAEW), and then artificially dipped withVibrioparahaemolyticus. The disinfection effect of slightly acidic electrolyzed water, the survival rate of the scallop, the variation ofV.parahaemolyticusand the microflora in different stages of water treatment were tested or determined by statistical method and biochemical experiments. The results showed that the survival rates after 1min group, 2 min group and 4min group treated with slightly acidic electrolyzed water were all 82%, 8min group was 80%, the survival rates of the scallop in slightly acidic electrolyzed water groups were higher than that of the control (infected) group. The time of electrolyzed water treatment was significantly positive correlated with the total number of bacteria and coliforms (p<0.05), and was no significantly related to the effective chlorine concentration of the electrolytic water used in the process of treatment (p>0.05). And the quantity ofV.parahaemolyticusin the live scallop fell from >1 100 MPN/g to 28 MPN/g along with time extending of treatment of the electrolyzed water. In this experiment, the main bacteria in the early stage of the scallop werePseudomonasandVibrio. After the treatment, bacteria in the scallop tended to be complex, the dominant bacteria changed and the total number of bacteria decreased. The specific spoilage organism (SSO) after 24 h wasPseudomonasin the treated scallop or not. In summary, SAEW has a potential application in the purification of live Japanese scallop.

live Japanese scallop (Patinopectenyessoensis); slightly acidic electrolyzed water; survival rate; disinfection effect;Vibrioparahaemolyticus; microflora

2015-09-25

2015-12-19

國家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAD17B01)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系—貝類體系“貝類?；盍魍ㄅc初加工(CARS4808B)”

李國威(1990—)，男，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用。E-mail：gdlgw123@foxmail.com

沈建(1971—)，男，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工技術(shù)裝備。E-mail：shenjian@fmiri.ac.cn

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.01.013

S983

A

1007-9580(2016)01-068-07