李威+惲燁+張銀龍
摘要:在前期獲得5氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻種子萌發(fā)的急性毒性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,研究5-氟尿嘧啶(2.5~100 mg/kg)對(duì)小麥、白菜和水稻幼苗葉片中葉綠素、可溶性蛋白和主要抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明,短時(shí)間暴露時(shí)(7 d),5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中葉綠素和可溶性蛋白含量表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性也受到不同程度的誘導(dǎo),對(duì)5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出一定的抗性;長(zhǎng)時(shí)間暴露時(shí)(21 d),3種作物幼苗葉片中葉綠素和可溶性蛋白含量下降,與5-氟尿嘧啶濃度表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,SOD、POD和CAT活性也不同程度地受到了抑制,抗氧化防御功能降低。本研究結(jié)果可為環(huán)境中5-氟尿嘧啶的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
關(guān)鍵詞:5-氟尿嘧啶;生理生化;葉綠素;可溶性蛋白;抗氧化酶
中圖分類號(hào): X820.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2016)09-0465-04
隨著現(xiàn)代環(huán)境分析技術(shù)水平的提高,藥品類污染物在環(huán)境中的頻繁檢出引起了科學(xué)工作者對(duì)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的廣泛關(guān)注[1-2]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)是一種常用的抗癌藥,主要用于乳腺癌和消化系統(tǒng)癌等癌癥的治療。5-氟尿嘧啶經(jīng)注射或口服進(jìn)入人體后,60%~90%可被人體代謝排出,剩余10%~40%則以母體化合物的形式進(jìn)入醫(yī)院廢水或市政廢水中[3]。根據(jù)資料預(yù)測(cè),污水處理廠出水中5-氟尿嘧啶的濃度可達(dá)到23 mg/L[4]。而且,隨著門診病人的增多,水環(huán)境中的抗癌藥濃度有升高的趨勢(shì)[5],因此5-氟尿嘧啶的生態(tài)毒性效應(yīng)逐漸受到重視。
已有不少學(xué)者研究了5-氟尿嘧啶對(duì)不同的生物的生態(tài)毒性效應(yīng)。如Zounkova等研究發(fā)現(xiàn),5-氟尿嘧啶對(duì)惡臭假單胞菌生長(zhǎng)(Pseudomonas putida)的EC50值為0.027 mg/L,對(duì)近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的EC50值為0.11 mg/L,對(duì)綠藻(Desmodesmus subspicatus)的EC50值為48 mg/L,對(duì)大型蚤的EC50值為36 mg/L[6-7]。Deyoung等發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶對(duì)黑頭呆魚(Pimephales promelas)生長(zhǎng)的EC50值為400 mg/L[8]。惲燁等研究發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶對(duì)小麥(Triticum aestivum)、白菜(Brassica pekinensis)和水稻(Oryza sativa)種子的根伸長(zhǎng)半數(shù)抑制濃度分別為212.80、102.53、13.30 mg/L[9]。
現(xiàn)有的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)表明,5-氟尿嘧啶不太可能引起急性毒性效應(yīng),但是生物長(zhǎng)期暴露于低濃度的抗癌藥脅迫中,是否會(huì)引起生理生化等方面的影響還未可知。因此,本試驗(yàn)以小麥、白菜和水稻為受試生物,通過研究低濃度5-氟尿嘧啶長(zhǎng)期脅迫對(duì)小麥、白菜、水稻的葉綠素和抗氧化酶系統(tǒng)的影響,為5-氟尿嘧啶的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)藥品5-氟尿嘧啶純度為99%,購于北京百靈威科技有限公司。
供試種子為小麥(Triticum aestivum),偃展4110;白菜(Brassica pekinensis),青雜改良三號(hào);水稻(Oryza. sativa),抗優(yōu)818。供試種子均購自南京金盛達(dá)種子公司。
供試土壤采自南京林業(yè)大學(xué)北大山0~20 cm表土(修休耕地,未受人為污染,屬于清潔土壤),pH值為7.23,有機(jī)質(zhì)含量為2.86%,總氮、總磷、總鉀的含量分別為1.36、0.02、3.20 mg/kg。
1.2 幼苗生理生態(tài)毒性試驗(yàn)
稱取200 g風(fēng)干土壤于95 mm×60 mm×70 mm(上口直徑×下底直徑×高)的塑料花盆中(盆底鋪1層濾紙),采用土壤染毒法將配制好的5-氟尿嘧啶溶液按水土比1 ∶5投加到土壤中,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中,(25±1) ℃下暗平衡48 h。選取飽滿、均勻的小麥、白菜和水稻種子,滅菌消毒后用鑷子播種于土壤中,每盆15粒種子,調(diào)節(jié)水土比1 ∶5,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光—暗周期為12 h—12 h,恒溫(25±1) ℃,早晚各澆水1次。5-氟尿嘧啶試驗(yàn)濃度為2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/kg,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,每個(gè)處理3組平行,在培養(yǎng)的7、14、21 d分別采樣進(jìn)行分析測(cè)定。
1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定方法
葉綠素(Chlorophyll,Chl)的測(cè)定采用95%乙醇浸提法[10]。稱取0.05 g作物幼苗葉片剪碎至刻度試管中,加入10 mL 95%乙醇,使葉片完全浸入,加蓋放在暗處浸提至葉片完全變白時(shí)用分光光度計(jì)分別在665、649 nm測(cè)定浸提液的吸光度,根據(jù)公式(1)和(2)分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度(mg/g)。
稱取0.1 g作物幼苗的葉片在預(yù)冷的磷酸緩沖溶液(50 mmol/L NaH2PO4·Na2HPO4,pH值7.8,加1%聚乙烯吡咯烷酮)中勻漿,4 ℃下13 000 r/min離心30 min,上清液即為提取液[11]??扇苄缘鞍祝⊿P)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[12];超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化學(xué)還原反應(yīng)法[10];過氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[10];過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[13]。
1.4 數(shù)據(jù)分析與處理
采用SPSS 16.0 和Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖,試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重比較,統(tǒng)計(jì)顯著性水平為P<0.05。
2 結(jié)果與分析
2.1 5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中葉綠素含量的影響
不同濃度5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻的葉綠素含量的影響見圖1。暴露7 d時(shí),3種作物葉片中葉綠素含量下降不明顯,與對(duì)照組百分比均大于90%,且在個(gè)別低濃度出現(xiàn)了一定的促進(jìn)作用,如5-氟尿嘧啶濃度為10 mg/kg時(shí),小麥和白菜葉綠素含量分別高出對(duì)照組3.5%、7.8%。小麥和白菜各5-氟尿嘧啶處理組間在7 d時(shí)無顯著性差異,但水稻組間有顯著性差異(P<0.05)。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),小麥、白菜和水稻葉片中葉綠素含量隨5-氟尿嘧啶濃度的升高而顯著下降。暴露14 d時(shí),高濃度處理組與低濃度處理組間有顯著性差異,當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為5 mg/kg和100 mg/kg時(shí),小麥葉片葉綠素含量抑制率分別為0.3%和21.9%,白菜葉片葉綠素含量抑制率分別為4.7%和16.7%,水稻葉片葉綠素含量的抑制率分別為6.7%和17.5%。暴露21 d后,5-氟尿嘧啶對(duì)葉綠素的抑制效應(yīng)更加顯著,小麥、白菜和水稻在100 mg/kg 處理下分別低于對(duì)照組25.0%、30.5%、32.0%,各處理組間均有顯著差異,5-氟尿嘧啶對(duì)作物葉片葉綠素含量表現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
2.2 5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中可溶性蛋白含量的影響
5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻葉片可溶性蛋白含量的影響見圖2。暴露7 d時(shí),不同濃度的5-氟尿嘧啶對(duì)小麥和白菜可溶性蛋白含量沒有明顯影響,各處理組間均無顯著性差異;低濃度的5-氟尿嘧啶促進(jìn)了水稻可溶性蛋白含量增加,高濃度的5-氟尿嘧啶則明顯抑制了可溶性蛋白含量增加,低濃度處理組與高濃度處理組有顯著性差異,5-氟尿嘧啶濃度為5 mg/kg 和100 mg/kg時(shí),水稻葉片中可溶性蛋白的含量分別為對(duì)照組的103.2%和91.1%。暴露時(shí)間延長(zhǎng)到14 d時(shí),5-氟尿嘧啶各處理組都促進(jìn)了小麥葉片中可溶性蛋白的含量,而對(duì)白菜葉片中的可溶性蛋白則表現(xiàn)為抑制作用,組間存在顯著性差異(P<0.05)。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)至21 d時(shí),5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗葉片中的可溶性蛋白合成均有抑制作用,處理組間有顯著性差異(P<0.05);當(dāng)5-氟尿嘧啶處理濃度為100 mg/kg時(shí),對(duì)小麥、白菜和水稻可溶性蛋白含量的抑制率分別為20.9%、20.8%、26.8%。
2.3 5-氟尿嘧啶對(duì)3種作物幼苗抗氧化酶活性的影響
5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻3種作物幼苗葉片中SOD活性的影響如圖3所示。在暴露時(shí)間7、14 d時(shí),小麥葉片中SOD的含量隨5-氟尿嘧啶濃度增加而有升高的趨勢(shì);暴露21 d時(shí),小麥葉片中SOD的含量則表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì),處理組間存在顯著性差異(P<0.05)。對(duì)于同一暴露濃度而言,小麥葉片中SOD含量隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,如在5-氟尿嘧啶濃度為50 mg/kg時(shí),暴露7、14、21 d后,小麥葉片中SOD活性與對(duì)照組的百分比分別為117.2%、98.6%、77.5%。白菜和水稻葉片中SOD活性表現(xiàn)出了與小麥不同的變化規(guī)律。暴露7 d時(shí),低濃度的5-氟尿嘧啶促進(jìn)了白菜和水稻葉片中的SOD活性,而高濃度的5-氟尿嘧啶則抑制了其活性,各處理組間具有顯著性差異(P<0.05)。暴露14、21 d 后,白菜和水稻葉片的SOD活性抑制率總體表現(xiàn)為隨5-氟尿嘧啶濃度增加而增加,如10、100 mg/kg 的5-氟尿嘧啶暴露21 d后,白菜葉片中SOD活性抑制率分別為24.4%、33.6%;水稻葉片中SOD活性抑制率分別為11.6%、34.9%。
5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻幼苗葉片中POD活性的影響見圖4。在不同暴露時(shí)間下,小麥葉片的POD活性均隨著5-氟尿嘧啶濃度的升高先上升后下降,變化接近于“鐘形”,且組間有顯著性差異(P<0.05)。白菜葉片中POD活性則隨著5-氟尿嘧啶的濃度升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,且組間具有顯著性差異(P<0.05),當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度從2.5 mg/kg 增加到100 mg/kg,白菜葉片中POD活性抑制率在暴露14 d時(shí)從5.7%增加到17.3%,暴露21 d時(shí)由29.5%增加到34.5%。水稻暴露7 d時(shí),POD的活性變化與小麥類似,即隨5-氟尿嘧啶濃度的升高先上升后下降,后隨時(shí)間延長(zhǎng),其POD活性與5-氟尿嘧啶濃度表現(xiàn)出負(fù)相關(guān),組間存在顯著性差異(P<0.05)。
5-氟尿嘧啶對(duì)小麥、白菜和水稻幼苗葉片中CAT活性的影響如圖5所示。小麥暴露7、14 d時(shí),除100 mg/kg 5-氟尿嘧啶處理組外,CAT活性與對(duì)照組相近,受5-氟尿嘧啶影響不大。但暴露21 d時(shí),小麥葉片中CAT活性則與5-氟尿嘧啶濃度之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,其抑制率由5-氟尿嘧啶處理濃度為2.5 mg/kg的1.5%增加至100 mg/kg時(shí)的32.4%,增加了30.9百分點(diǎn)。白菜暴露7 d時(shí),5-氟尿嘧啶對(duì)其葉片中CAT活性無顯著影響。當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)到14、21 d時(shí),白菜葉片中CAT活性的抑制率隨5-氟尿嘧啶濃度升高逐漸減低,且組間存在顯著性差異(P<0.05)。水稻葉片中CAT活性隨5-氟尿嘧啶濃度升高和暴露時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為降低的趨勢(shì),當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為5 mg/kg時(shí),暴露7、14、21 d后,水稻葉片中CAT活性的抑制率分別為8.7%、10.4%、24.5%;當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為100 mg/kg時(shí),水稻葉片中CAT活性的抑制率分別為25.9%、29.0%、38.7%。
3 討論與結(jié)論
葉綠素含量是反映光合強(qiáng)度的重要指標(biāo),可以作為判斷植物光合生理能力、反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)[14]。在本研究中,低濃度的5-氟尿嘧啶(<10 mg/kg)短時(shí)間暴露時(shí)對(duì)3種作物葉片的葉綠素含量有一定的激活作用,但高濃度的5-氟尿嘧啶和較長(zhǎng)的暴露時(shí)間都使得作物葉片中的葉綠素含量降低,說明5-氟尿嘧啶影響了小麥、白菜和水稻的光合作用過程。這可能是因?yàn)樵谖廴疚锏拿{迫下,捕光葉綠素a/葉綠素b結(jié)合蛋白(Chl a/b-Pro)合成的轉(zhuǎn)錄過程受到抑制,而且初期形成的葉綠素單體也被光氧化分解,導(dǎo)致光捕獲化合物的形成受到影響,從而影響葉綠素的積累[15-16]。
可溶性蛋白含量是植物體內(nèi)代謝過程中蛋白質(zhì)損傷的重要指標(biāo),其變化可以反映細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、變性及降解等多方面的信息[17]。當(dāng)植物適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)入旺盛的生長(zhǎng)期后,各種代謝活動(dòng)旺盛,可溶性蛋白的合成能力也有所增強(qiáng)。但是在有機(jī)物、重金屬以及寒旱等脅迫下,植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量可能會(huì)下降[13,18]。本研究中,短時(shí)間低濃度的5-氟尿嘧啶暴露可以誘導(dǎo)小麥、白菜和水稻幼苗中可溶性蛋白的合成,但是高濃度的5-氟尿嘧啶暴露則抑制了3種作物葉片中可溶性蛋白的合成,特別是高濃度5-氟尿嘧啶(≥20 mg/kg)處理21 d時(shí),3種作物幼苗葉片中可溶性蛋白含量顯著下降。
有機(jī)物、重金屬污染以及干旱等不利環(huán)境條件或?qū)е轮参矬w內(nèi)H2O2和O-2· 等活性氧物質(zhì)的增多,植物的抗氧化防御體系則能去除或降低活性氧物質(zhì)的含量[19]。SOD、POD和CAT是生物體抗氧化防御系統(tǒng)中典型的抗氧化酶,它們的活性變化間接指示了機(jī)體內(nèi)的氧化脅迫強(qiáng)度。SOD能將O-2· 轉(zhuǎn)化成O2和H2O2,抑制高活性·OH等自由基的形成,防止活性氧物質(zhì)積累對(duì)植物體的危害。在本研究中,低濃度的5-氟尿嘧啶短時(shí)間暴露時(shí),小麥、白菜和水稻葉片中SOD活性有升高現(xiàn)象,可能是由于植物體內(nèi)活性氧物質(zhì)積累,激活本身存在的SOD酶或者通過誘導(dǎo)酶蛋白編碼基因的表達(dá)而激活機(jī)體本身合成新的 SOD[20]。POD和CAT是消除H2O2的重要酶類,它們可以協(xié)同作用將SOD歧化自由基的產(chǎn)物H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2[17]。在暴露時(shí)間較短時(shí),作物葉片中的POD和CAT的活性也受到一定程度的誘導(dǎo),這與SOD誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2的量下降存在一定關(guān)系??寡趸富钚缘膯?dòng)說明3種作物都具有一定的抵抗氧化脅迫的能力。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng),小麥、白菜和水稻葉片中SOD、POD和CAT活性主要呈現(xiàn)下降趨勢(shì),說明5-氟尿嘧啶脅迫超過了植物細(xì)胞的耐受限度,抗氧化酶活性受到抑制,自身的抗氧化防御功能降低。
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