●尹軍力 陳 蓉 徐 飛(江蘇省南京市紅山森林動(dòng)物園 江蘇 南京 210028)

一例亞歷山大鸚鵡沙門氏菌快速診斷

●尹軍力 陳 蓉 徐 飛(江蘇省南京市紅山森林動(dòng)物園 江蘇 南京 210028)

沙門氏菌病是由沙門氏菌引起的以敗血癥、腸炎為主的疾病。由于可以感染人、多種家畜及野生動(dòng)物，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要的研究地位。2015年5月，一只剛引進(jìn)的亞歷山大鸚鵡突然血便死亡，筆者通過沙門氏菌PCR快速鑒定為沙門氏菌感染。

1 發(fā)病情況

2015年5月，一群引進(jìn)不久的亞歷山大鸚鵡中，有一只突然死亡，僅肛門處有大量血便。解剖觀察，肝臟質(zhì)地脆、有片狀黃色壞死灶；胰腺輕微出血；腎臟較脆；十二指腸后段及盲腸出血嚴(yán)重；其余臟器正常。寄生蟲檢查排除球蟲。

2 細(xì)菌分離

無菌采集病死鸚鵡的肝、脾等組織接種于血平皿，37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后觀察。從肝臟中分離出溶血小菌落，接種至麥康凱(MAC)平皿上長出無色透明菌落，接種至亞硫酸鉍(BS)平板上長出帶金屬光澤的黑色菌落。經(jīng)革蘭氏染色，該菌為陰性桿菌，初步判定為沙門氏菌。

3 PCR鑒定

3.1細(xì)菌DNA提取

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)菌DNA提取采用熱裂解法，即將各取150μL檢測(cè)菌液、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液和水(陰性對(duì)照)分別注入3根離心管中，100℃煮沸10分鐘后，12 000r/分鐘離心10分鐘，取上清液為DNA模板。

3.2 PCR反應(yīng)

檢測(cè)沙門菌的特異性PCR引物為P1：5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3′，P2：5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3′，2×TapMIX均有上海生工生物有限公司合成提供。

反應(yīng)總體積為25μL：2×TapMIX 12.5μL；引物P1、P2(5μmol/L)各1.25μL；雙蒸水5μL；DNA模板溶液5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，經(jīng)過32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。

3.3電泳分析

取5μL PCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)電泳，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照。檢測(cè)菌樣出現(xiàn)沙門菌特異性條帶為495bp，見圖1，表明該菌為沙門氏菌。

1.DNAMarkerDL2000；2.陰性對(duì)照；3.陽性對(duì)照；4.檢測(cè)菌落圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖

4 藥敏試驗(yàn)

以K-B法進(jìn)行藥物繁感試驗(yàn)。該菌米字接種于血平板，貼上藥敏紙片(購自杭州微生物有限公司)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。本菌對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考及諾氟沙星敏感。對(duì)先鋒霉素、青霉素G鈉、頭孢曲松、氟哌酸、痢特靈、阿莫西林等耐藥。

5 討論

國內(nèi)有報(bào)道沙門氏菌感染白鷺、鴕鳥、黑鸛、孔雀、鸚鵡等珍禽，并引起較大經(jīng)濟(jì)損失。本次鸚鵡死亡迅速，臨床僅為血便，而從肝臟分離出沙門氏菌，說明該菌已造成全身敗血癥、嚴(yán)重的腸炎，符合該病臨床特征。

在傳統(tǒng)的沙門氏菌方法中，常規(guī)鑒別培養(yǎng)基分離和生化鑒定程序復(fù)雜、時(shí)間較長；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定成本較高、操作復(fù)雜；沙門菌A～F多價(jià)O抗原檢測(cè)會(huì)因該菌發(fā)生S-T-R(光滑型-過渡型-粗糙型)變異喪失了正常的O抗原而不能被血清凝集或出現(xiàn)自凝現(xiàn)象造成假陰性。本文采用PCR方法對(duì)沙門菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，具有特異、快速(1～2小時(shí))、簡便、靈敏(DNA含量為14pg)等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)闄z測(cè)細(xì)菌的核酸，所以該方法準(zhǔn)確性較高。雖然該方法在家畜、家禽等臨床上已運(yùn)用較廣，但這是首次運(yùn)用在鸚鵡沙門氏菌病的檢測(cè)中。

目前，沙門氏菌的耐藥性引起了極大地關(guān)注。其產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制較多，如產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶、改變藥物作用靶位點(diǎn)、通過生物膜產(chǎn)生耐藥、外排泵產(chǎn)生耐藥、甲基錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)突變、可移動(dòng)基因元件介導(dǎo)耐藥及耐藥基因的散播等，因此，藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)該病的治療具有指導(dǎo)作用，避免盲目用藥、產(chǎn)生耐藥性。本菌的耐藥譜相對(duì)較窄，給用藥提供了較多的選擇性。

沙門氏菌廣泛存在于自然界中，尤其在污水、土壤、感染動(dòng)物的排泄物中。南京的5月正值梅雨季節(jié)，加之這批鸚鵡剛引進(jìn)不久，其免疫力有所下降，因此快速分離鑒定細(xì)菌，同時(shí)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，合理地預(yù)防性用藥，及時(shí)進(jìn)行籠舍消毒，避免全群鸚鵡爆發(fā)沙門氏菌病，以減少損失。