孔德夢，關(guān)冬梅，孔令達(dá)，3*

（1.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069；2.沈陽市于洪區(qū)動物疫病預(yù)防疾控中心，遼寧 沈陽 110141；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬流行性腹瀉病毒RT-PCR方法的建立

孔德夢1，關(guān)冬梅2，孔令達(dá)1，3*

（1.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069；2.沈陽市于洪區(qū)動物疫病預(yù)防疾控中心，遼寧 沈陽 110141；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001）

為了進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒的快速診斷，本研究根據(jù)GenBank中登錄PEDV E基因設(shè)計一對引物，建立了RT-PCR方法，敏感性結(jié)果顯示，可以檢測到8.50×104個拷貝。特異性試驗采用該方法對豬偽狂犬病病毒，豬圓環(huán)病毒2型，豬瘟病毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬輪狀病毒等進(jìn)行，結(jié)果表明只有PEDV能擴(kuò)增出目的條帶；利用本方法對現(xiàn)有PEDV陽性病料進(jìn)行了檢測，結(jié)果野毒株9份，占64.2%（9/14）。本方法的建立，為PEDV疫情診斷及防控提供了新的技術(shù)支撐。

豬流行性腹瀉；分子流行病學(xué)調(diào)查

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬冠狀病毒科、冠狀病毒屬的成員，是引起仔豬腹瀉的主要腸道病毒，感染豬以水樣腹瀉、嘔吐、脫水,主要危害仔豬為特征。PED于70年代初首先發(fā)現(xiàn)于英國，隨后許多國家均有該病的報道。

在我國，PEDV分布較廣，滅活苗及弱毒苗在一定程度上控制了該病的發(fā)生及流行，但自2010年以來，我國多地暴發(fā)流行PEDV，臨床上主要表現(xiàn)為哺乳仔豬的高發(fā)病率和高死亡率，由腹瀉病引起的仔豬死率達(dá)高達(dá)80%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。隨后開展的病原分離鑒定分析、流行病學(xué)調(diào)查等相關(guān)研究，認(rèn)定PEDV變異毒株是引起本次疾病流行的主要原因。

目前PEDV野毒株與弱毒疫苗株的區(qū)別檢測技術(shù)主要有病毒分離、反轉(zhuǎn)率聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等。本研究采用RT-PCR技術(shù)，建立一種快速診斷的方法。

1 材料

1.1 毒株與樣品來源豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒等均由本單位保存。

1.2 主要試劑Taq DNA聚合酶，DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取試劑盒RNeasy Plus Mini Kit購自QⅠAGEN公司；單鏈cDNA合成試劑EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自全式金生物技術(shù)有限公司。Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit購自O(shè)MEGA公司；RNAiso Regent、RT（反轉(zhuǎn)錄）、2×Taq PCR Master Mix、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物工程（大連）有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計與合成引物分別參文獻(xiàn)設(shè)計合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長度分別為234bp，由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物詳情見表1。

表1 引物序列

2.2 病毒基因組RNA的提取取PEDV弱毒株（ZJ08）及野毒株（HEBEⅠ08）處理過的樣品200μl，按照RNeasy Plus Mini Kit試劑盒說明書操作提取病毒RNA，取一定量提取的RNA產(chǎn)物依照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 RT-PCR反應(yīng)

2.3.1 反轉(zhuǎn)錄成cDNA按照RT（反轉(zhuǎn)錄）試劑盒說明，采用20 μL體系：RNA模板10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL，RT Prime Mix 1μL，RNase Free dH20 4μL，按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min，85℃5s，4℃保存。

2.3.2 PCR反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄完成后，取新的PCR反應(yīng)管，采用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增：加入10μL 2×Taq PCR Master Mix，6μL ddH20，3μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游引物各0.5μL。按照下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min，95℃循環(huán)變性30s，PEDV 46℃退火復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定取擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中電泳，并觀察結(jié)果。

2.3.4 體系及反應(yīng)條件優(yōu)化PCR反應(yīng)體系預(yù)設(shè)定為：2× PCR Buffer 10μL，上下游引物各1μL（引物濃度為10μM），cDNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（5U/μL），加雙蒸水至20μL。PCR反應(yīng)條件預(yù)設(shè)為：94℃5min；94℃30 s，50℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃7min。

固定反應(yīng)退火溫度為50℃，將上、下游引物劑量范圍設(shè)在0.2～1.6μL以每0.2μL遞增，進(jìn)行引物濃度加入條件的優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

確定上、下游引物最佳加入量后，在PCR體系中加入各種成分，設(shè)置退火溫度梯度48～56℃，反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.3.5 敏感性試驗以鑒定正確的含有PEDV序列的重組DNA為模板，核酸蛋白儀測定DNA濃度，雙蒸水進(jìn)行10倍梯度稀釋，取每個稀釋度的1μL作為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

2.3.6 特異性實驗豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型為模板進(jìn)行RT-PCR檢測，同時設(shè)強(qiáng)弱毒株為陽性對照，驗證RT-PCR的特異性。

2.4 臨床樣品的檢驗應(yīng)用建立的RT-PCR檢測方法，對現(xiàn)有的14份PEDV陽性樣品進(jìn)行檢測。臨床組織樣品按常規(guī)方法處理后，試劑盒提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)后得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR結(jié)果利用針對PEDV E基因設(shè)計的引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到與預(yù)期目的條帶大小相符的特異性片段，約234 bp，如圖1所示。對PCR產(chǎn)物克隆、測序分析表明，所得基因序列與GenBank中登錄的相應(yīng)目的基因核苷酸序列同源性均在95%以上，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。

圖1 部分PEDV的RT-PCR檢測結(jié)果

M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：部分樣品PCR產(chǎn)物；4：陽性對照；5：陰性對照

3.2 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果PEDV最終RT-PCR檢測體系為：PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.8μL（引物濃度為10μM），cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL（5U/μL），加雙蒸水至20μL。

反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃7min；4℃保存。

3.3 特異性及重復(fù)性試驗采用設(shè)計的擴(kuò)增PEDV的引物，分別對豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示特異性良好其它病毒均未有目的條帶出現(xiàn)，并重復(fù)2次實驗。結(jié)果證實RT-PCR方法具有良好的特異性。

3.4 敏感性試驗以初始濃度為8.50×1010拷貝/μL的PEDV重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)過雙蒸水10倍梯度稀釋后，取每個稀釋濃度的樣品進(jìn)行RT-PCR及普通PCR反應(yīng)檢測。敏感性實驗結(jié)果表明RT-PCR最低能檢出8.50×105拷貝/μL。本實驗建立的RT-PCR方法靈敏。

3.5 臨床樣品檢測結(jié)果對來自不同地區(qū)的14份PEDV陽性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，以野生強(qiáng)毒株感染為主，且發(fā)現(xiàn)了一例混合感染樣品。表明當(dāng)前可能存在免疫后感染的現(xiàn)象。

4 討論

PEDV是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要的傳染病之一，腹瀉二聯(lián)滅活及弱毒疫苗的使用，對控制該病起到了一定的作用。但從2006年以來，PEDV在免疫后豬群出現(xiàn)流行，2010年下半年開始，PEDV在我國暴發(fā)流行，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，PEDV的感染率明顯高于另外兩種豬腹瀉病豬傳染性胃腸炎（TGEV）及豬輪狀病毒（PRoV）。報道稱2010年開始在中國南方有多個省暴發(fā)PEDV且導(dǎo)致新生仔豬100%的死亡率，有超過100萬頭仔豬死亡。華中地區(qū)182家豬場表現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉的豬的糞便樣本陽性檢出率為60.44%，47個規(guī)模豬場共153份腹瀉病料樣品，陽性檢出率為55.32%，表明近幾年在我國PEDV是導(dǎo)致腹瀉的主要原因。

豬病毒性腹瀉疾病有爆發(fā)性流行、地方性流行兩種形式。一般第一次感染均呈暴發(fā)性流行，一些豬傳染性胃腸炎病毒污染比較嚴(yán)重的豬場，常呈地方性流行。冬春季節(jié)是病毒性腹瀉疾病的多發(fā)季節(jié)，豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎的發(fā)生和流行具有明顯的季節(jié)性，通常從11月到次年4月中旬，發(fā)病高峰為1～2月份，但現(xiàn)在夏季也可發(fā)病。病豬和帶毒豬群是主要傳染源，主要通過消化道和呼吸道傳染給易感豬群，但在實驗室平日檢測時發(fā)現(xiàn)母豬乳汁中也能檢測到PEDV和TGEV的存在，乳汁傳播是否是其傳播途徑還有待進(jìn)一步研究。2周齡以下仔豬發(fā)病率和死亡率較高，7日齡以內(nèi)的產(chǎn)房仔豬腹瀉最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為迅速出現(xiàn)水樣腹瀉，嚴(yán)重脫水和死亡。斷奶仔豬斷奶豬和育肥豬表現(xiàn)持續(xù)性的水瀉，大多數(shù)病豬康復(fù)，但生長發(fā)育受影響，成為僵豬。母豬表現(xiàn)精神萎頓，厭食，腹瀉持續(xù)約1周。在臨床上很難單憑腹瀉這一多因子致病癥狀進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，因此進(jìn)行相應(yīng)的分子流行病學(xué)調(diào)查顯得尤為重要。本方法的建立，為PEDV疫情診斷及防控提供了新的技術(shù)支撐。

［1］殷震，等.動物病毒學(xué)［M］.北京∶科學(xué)出版社.1997.

［2］Debouck P，Pensaert M.Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777［J］.American journal of veterinary research，1980，41（2）∶219-223.

［3］趙夢姣，等.山東省部分地區(qū)豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及其M基因遺傳變異分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報.2013，33（010）∶1504-1508.

［4］孫振釗，等.豬腹瀉病例中PEDV、TGEV及PRV的感染調(diào)查［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（5）：132-135.

［5］劉孝珍，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（3）∶180-183.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．04.016

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