祖玲玲，姚麗丹，依明·蘇萊曼，馬曉燕，決肯·阿尼瓦什

（新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊830052）

MSTN基因在1～6月齡哈薩克羔羊脂肪中相對表達量的研究

祖玲玲，姚麗丹，依明·蘇萊曼，馬曉燕，決肯·阿尼瓦什

（新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊830052）

探索MSTN（生長抑制素）基因在脂肪組織中不同生長階段的表達差異，為哈薩克羔羊的良種選育提供遺傳學資料。采用熒光定量1～6月齡哈薩克羔羊脂肪組織中MSTN基因的相對表達量，2-ΔΔCt處理不同月齡相對表達量數據，SPSS 17.0軟件分析表達量差異。結果表明：MSTN基因在1～6月齡哈薩克羔羊尾脂中的相對表達量6月齡最高，1、2、3、4各月齡之間無顯著性差異（P＞0.05），5月齡最低。說明MSTN基因在脂肪中的表達量在生長發(fā)育的前期差異不顯著（P＞0.05），在5月齡顯著降到最低點，隨后在6月齡達到最高。

MSTN基因；哈薩克羊羔羊；表達量

哈薩克羊是新疆古老的優(yōu)良地方肉脂兼用型綿羊品種，長期游牧于天山、阿勒泰山及準噶爾盆地邊緣，為中國三大粗毛羊品種之一［1］，曾是新疆數量最多、分布最廣的綿羊品種［2］。哈薩克羊耐寒、耐粗飼，抗病性強，對自然牧區(qū)生態(tài)條件有較強的適應性，現已成為適應牧區(qū)放牧的良好肉脂兼用型粗毛羊品種，具有很高的經濟價值。MSTN又稱生長分化因子GDF-8，是轉化生長因子（TGF-β）超家族中的一員，對肌肉的生長起著至關重要的負調控作用，1997年由Mcpherron科研小組首次發(fā)現，由于其對肌肉生長起負調控作用被命名為生長抑制素基因。近期研究發(fā)現，MSTN（生長抑制素）基因可加強脂前體細胞和脂源性干細胞生成的過程，也可對脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化起抑制作用［3］，MSTN基因分泌過多會導致脂分解加強，缺失會影響脂肪形成［4］。Artaza等對小鼠注射MSTN基因重組和抗MSTN抗體，研究胚胎成纖維細胞間充質干細胞系成脂成肌分化的作用，結果表明，MSTN基因可削弱成纖維細胞的成纖分化作用，加強成纖維細胞向脂肪分化的作用［5］。McPherron等［6］研究發(fā)現，在保持正常的采食量、體溫及略低代謝速率的條件下，MSTN基因缺失的小鼠隨著年齡的增加，脂肪積累量顯著降低。目前雖然對MSTN基因的研究有一定的進展，但MSTN基因在脂肪中的表達水平發(fā)育性變化的相關文獻甚少。本文以新疆地方良種綿羊品種哈薩克羔羊為研究對象，探索MSTN基因在其脂肪中的表達規(guī)律，不僅可為MSTN基因在脂肪中的表達規(guī)律提供科學的遺傳學資料，也可結合實際，對哈薩克羊的良種保留與繁育以及肉品質的改善提供很好的指導意義。

1 材料與方法

1.1 動物

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑（Trizol Reagent）、反轉錄試劑（Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-、Ribonuclease Inhibitor、10×mmol/L dNTP Mixture、5×RT buffer）、熒光定量試劑（Ribonuclease Inhibitor、SYBR PremixExTaqTM、 ROX）均購自TaKaRa公司，瓊脂糖、氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC（焦磷酸二乙酯）均購自新疆阜瑞科生物科技有限公司。TGL-16高速臺式冷凍低溫離心機：湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司，DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠，普通Biometerya PCR儀：北京艾思普科技有限公司，Gel Doc 2000型凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司，熒光定量Biometerya PCR儀：北京艾思普科技有限公司。

1.3 引物設計及合成

根據各基因在GenBank上的mRNA序列（MSTN為NM-001009428.1，β-Actin為 U39357），利用 Primer premier 5.0引物設計軟件設計引物，上海生工生物公司合成后使用滅菌超純水處理，溶解稀釋成10 μmol/L，-20℃保存。各基因的引物序列見表1。

表1 引物序列參數

1.4 基因組總RNA的提取與cDNA的合成

按照Trizol說明進行提取，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性，檢測合格的RNA保存于超低溫冰箱中（-80℃）中。反轉錄加樣體系（20 μL）：模板RNA 2.5 μg，OligodT（18）primer 1 μL，RNase Free ddH2O補至12 μL；在普通PCR儀上65℃保溫5 min；迅速急冷2 min以上，離心5 s；加5×Reaction Buffer 4 μL，10×dNTP 1 μL，Revert Aid M-MuLV RT（200 U/μL）1 μL，Ribo Lock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL；普通PCR儀上 42℃，60 min，70℃，5 min。

RNA反轉錄為cDNA后，加RNaseFreeddH2O80μL，得到濃度為25 ng/μL的cDNA模板，進行熒光定量PCR試驗。

1.5 PCR擴增

以反轉錄產物為模板進行普通PCR反應。PCR反應體系25 μL：PCR×2×Master 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL（10 μmol/L），RNase-free ddH2O 9.5 μL。反應條件：預變性94℃5 min，變性94℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)34個，延伸72℃5 min，永久4℃。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收。

1.6 定量

普通PCR擴增檢測引物特異性后，對cDNA進行熒光定量。20 μL熒光定量擴增（PCR）反應體系加樣：2×SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL（10 μmol/L），RNasefree ddH2O 7 μL，離心3 s，放入熒光定量PCR儀進行擴增（擴增程序：95℃變性30 s，61℃退火30 s，38個循環(huán)，熔解曲線：95～60℃0.5℃/min，降溫：50℃3 min），實時觀測擴增情況。

1.7 統計與分析

實時熒光定量PCR結果采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，SPSS統計軟件17.0單樣本方差分析相對表達量，數據結果以平均值±標準誤表示，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量檢測

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA，從圖1中可見較清晰的RNA條帶：28 S、18 S和5.8 S，其中5.8 S帶較淺，說明RNA質量好。D260/D280比值在1.8～2.0之間，表明RNA純度較好，可以繼續(xù)后續(xù)的試驗。

2.2 普通PCR擴增目的基因

采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測MSTN基因擴增產物的質量，結果見圖2。從圖2可以看出，目的基因PCR擴增片段為175 bp左右（參照Mark為1 000），由此可見引物可靠，可以做定量分析。

圖1 RNA的瓊脂糖電泳檢測結果

圖2 MSTN基因PCR擴增結果

2.3 熒光定量PCR結果與分析

2.3.1 熒光定量PCR熔解曲線 通過熔解曲線可以看出，使用引物PCR產物均呈單一峰（圖3），可以排除引物二聚體或其他因素的干擾，說明引物有較好的特異性。

2.3.2 MSTN基因在1～6月齡哈薩克羊尾脂中的相對表達量 從圖4可知，MSTN在6月齡羔羊尾脂中的相對表達量最高，顯著高于1、3、4、5月齡羔羊（P＜0.05）。而1、2、3、4月齡相對表達量間無顯著性差異（P＞0.05）。5月齡的相對表達量最低，且顯著低于2月齡和6月齡的相對表達量（P＜0.05），但與其他各月齡間差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 MSTN基因的熔解曲線

圖4 MSTN基因在1～6月齡羔羊尾脂中的相對表達量

3 討論

MSTN由于其對肌肉生長的負顯著調控作用，在肌肉組織中的定量研究較多［7-12］，而在脂肪中的研究較少。Hira等［13］利用MSTN處理牛前脂肪細胞發(fā)現，MSTN能抑制脂肪細胞的分化。吐來力江［14］研究發(fā)現，脂肪組織中MSTN基因mRNA表達量隨月齡增加逐漸上升。祖玲玲等［15］研究發(fā)現，MSTN在0～6月齡新疆也勒白羊脂肪中的表達量隨月齡增長而升高，在5月齡達到最高，而后降低。而在本研究中，MSTN在1～6月齡哈薩克羔羊尾脂中的表達量沒有隨月齡增長而有升高趨勢，1、2、3、4月齡之間的相對表達量無顯著性差異（P＞0.05），在5月齡降到最低，6月齡達到最高，分析原因可能存在品種差異、試驗偶然性等。MSTN基因在不同品種羊脂肪中是否存在一致的表達規(guī)律，還需加大樣本進一步研究。

4 結論

MSTN基因在哈薩克羔羊脂肪中的表達水平在生長發(fā)育的前期差異不顯著（P＞0.05），在5月齡時顯著降到最低，6月齡達到最高。

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Expression of MSTN Gene in Fat Tissues of Kazak Lambs during 1-6 Months

Zu Lingling，YaoLidan，Jueken·Aniwashi，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

To inverstigate the expression of MSTN gene in fat tissue of Kazak lambs during the age of 1-6 months，the fat tissues in the buttocks were sampled and analyzed by using quantitavive PCR.The results showed that the relative expression level of MSTN gene was the highest at the age of6 month，the lowest at the age of5 month and nosignificant differences amongthe ages of 1，2，3，4 month（P＞0.05）.

MSTN gene；Kazak lamb；expression

S826.2

A

2095-3887（2016）02-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.002

2015-12-18

國家自然科學基金（31260530）

祖玲玲（1988-），女，碩士研究生。

決肯·阿尼瓦什（1962-），男，教授，博士。研究方向：動物遺傳育種與繁殖。