劉嘉，董楠，葉發(fā)銀，趙國華 *

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(貴州省食品加工研究所，貴州 貴陽，550006) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

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辛烯基琥珀酸燕麥β-葡聚糖酯的合成

劉嘉1,2，董楠2，葉發(fā)銀1,3，趙國華1,3 *

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(貴州省食品加工研究所，貴州 貴陽，550006) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

近年來，多糖基表面活性劑的合成與功能性質(zhì)的研究成為食品化學領域比較活躍的研究方向。文中以具有生物活性的燕麥β-葡聚糖為底物，利用辛烯基琥珀酸酐(OSA)為酯化劑，通過優(yōu)化反應條件，合成辛烯基琥珀酸燕麥β-葡聚糖酯(OSG)。單因素試驗結(jié)果顯示，OSG的取代度隨反應時間和OSA添加量的增加而提升，而隨反應溫度和燕麥β-葡聚糖濃度的增加呈先提升后降低的趨勢。在此基礎上，響應曲面試驗表明，在OSA添加量一定的情況下(0.6 mL)，反應時間(X1)、燕麥β-葡聚糖濃度(X3)以及反應時間(X12)、反應溫度(X22)、燕麥β-葡聚糖濃度(X32)的二次項對OSG的取代度有顯著影響(P<0.05)。當反應時間為4.66 h，反應溫度為45.6 ℃，燕麥β-葡聚糖濃度為2.18 mg/mL時，可獲得最大取代度(0.038 2)的OSG。1H-NMR確認了OSG的成功合成。

燕麥β-葡聚糖；改性；取代度；響應曲面；核磁共振

通過酯化等反應可將長鏈烷基或脂肪酸?；湆胗H水性多糖鏈中對其進行疏水改性。疏水改性后的多糖分子同時具備了親水性和親油性，可作為半合成高分子表面活性劑使用，一般稱為多糖基表面活性劑[1]。與其他合成類表面活性劑相比，多糖基表面活性劑除具有優(yōu)良的表面活性外，還具有良好的生物相容性、生物可降解性和較高的安全性等[2]。文獻報道的通過疏水改性制備多糖基高分子表面活性劑的多糖主要包括淀粉[3]和糊精[4]。除此之外，一些其他天然來源多糖，如半乳甘露聚糖[5]、瓜爾豆膠[6]、阿拉伯膠[6]、透明質(zhì)酸[7]和魔芋葡甘露聚糖[8]等都可作為多糖基高分子表面活性劑半合成的起始原料。在食品領域，辛烯基琥珀酸淀粉酯的合成及應用受到最多關注，且已被食品監(jiān)管部門批準使用，并工業(yè)化生產(chǎn)。β-葡聚糖(β-Glucan)是廣泛存在于細菌、酵母、真菌和植物(燕麥、黑麥和大麥等)當中的大分子多糖?，F(xiàn)代醫(yī)學和營養(yǎng)學的研究表明，谷物β-葡聚糖具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤、抗癌、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂和血糖等多種生理功能，已成為當前醫(yī)藥和食品領域研究與開發(fā)的熱點[9]。理論上，可利用β-葡聚糖為底物通過半合成獲得一種新型的多糖基表面活性劑。β-葡聚糖基表面活性劑可能不僅具有表面活性，還可能兼具生理活性，可能成為一種雙功能高分子表面活性劑，但截至目前尚未見到有關這方面的文獻報道。本文擬以辛烯基琥珀酸酐(OSA)作為疏水改性劑，通過半合成制備OS-燕麥β-葡聚糖酯(OSG)。重點探討主要改性因素(燕麥β-葡聚糖濃度、反應溫度和反應時間)對產(chǎn)物取代度的影響，并利用響應面對其予以優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥β-葡聚糖(80%)，張家口一康生物科技有限公司；2-辛烯基琥珀酸酐(97%)，美國Sigma-Aldrich公司；異丙醇(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；NaOH(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；HCl(分析純)，重慶川東化工(集團)有限公司；三氟乙酸(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；乙腈(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；KBr(光譜純)，天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

HJ-4A磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；LGJ-10，真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；AV 600核磁共振儀，瑞士Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 OSG的制備

將1.25～10.00 g燕麥β-葡聚糖分散于純水中，置于磁力攪拌器上，在80 ℃下攪拌2 h。待充分溶解后冷卻至室溫，在3 000×g離心10 min。棄去沉淀，收集上清燕麥β-葡聚糖溶液備用。改性過程參考YUSOFF[10]等稍作修改。按照試驗設計，將一定量(0.1～1.0 mL)2-辛烯基琥珀酸酐滴(OSA)加至100 mL燕麥β-葡聚糖溶液中，在一定溫度(25～60 ℃)下反應一定時間(0.5～6 h)。反應過程中用30 g/L NaOH控制體系pH值在8～10。達到預定時間后，停止加熱并自然冷卻至室溫后繼續(xù)攪拌12 h。用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)體系pH值至6.5左右，加入400 mL異丙醇(60 ℃)醇沉后，在3 000×g離心10 min，收集沉淀物溶解于純凈水中移至截留重均分子質(zhì)量為14 000 g/mol的透析袋(MD 44-14, Union Carbide Co., Seadrift, TX, 美國)中對自來水和純水各透析24 h。將透析內(nèi)液置于真空冷凍干燥機中(冷阱溫度-60 ℃，真空度100 Pa)干燥后備用。

1.3.1.1 反應時間對OSG取代度的影響

反應時間為0.5、1、2、4、6 h，其他反應條件為：燕麥β-葡聚糖濃度為2 mg/mL，反應溫度為45 ℃，OSA添加量為0.6 mL。

1.3.1.2 反應溫度對OSG取代度的影響

反應溫度為25、35、45、55、60 ℃，其他反應條件為：燕麥β-葡聚糖濃度為2 mg/mL，反應時間為2 h，OSA添加量為0.6 mL。

1.3.1.3 燕麥β-葡聚糖濃度對OSG取代度的影響

燕麥β-葡聚糖濃度為1、2、4、6、8 mg/mL，其他反應條件為：OSA添加量為0.6 mL，反應時間為2 h，反應溫度為45 ℃。

1.3.1.4 OSA添加量對OSG取代度的影響

OSA添加量為0.1、0.3、0.5、0.7、1 .0 mL，其他反應條件為：燕麥β-葡聚糖濃度為2 mg/mL，反應時間為2 h，反應溫度為45 ℃。

1.3.2 響應面試驗設計

采用Box-Behnken design (BBD)實驗設計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，考察反應時間(X1)、反應溫度(X2)、燕麥β-葡聚糖濃度(X3)對OSG取代度的影響。試驗因素的3個水平(-1，0，1)設置分別是：反應時間(X1)為2、4、6 h；反應溫度(X2) 為35、45、55 ℃；燕麥β-葡聚糖濃度(X3) 為1、2、3 mg/mL。

1.3.3 OSG取代度的測定

OSG取代度(以trans-OSA計)的測定采用高效液相色譜儀進行測定，參考QIU等[11]方法，稍作改變。

1.3.3.1 OSA標準曲線的測定

準確稱取0.100 0 g OSA置于25 mL試管中，并加入25 mL的NaOH溶液(4 mol/L)，于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌24 h。水解結(jié)束后，量取4 mL水解液加入到20 mL HCl溶液(1 mol/L)中，并磁力攪拌2 min。攪拌結(jié)束后，準確量取12、6、3、1.5、0.75 mL于25 mL具塞試管中，并添加乙腈至刻度。搖勻后靜置30 min，取上清液待測。經(jīng)HPLC測定，以trans-OSA濃度為橫坐標(mg/mL)，以峰面積(mAu)為縱坐標繪制標準曲線。HPLC條件：色譜柱：C18；流動相：1 g/L三氟乙酸(TFA)/乙腈體積比45∶55；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：200 nm；柱溫：30 ℃。根據(jù)文獻[11]，選取trans-OSA作為定量峰。標準曲線為y(g)=-9.6×10-3+7.2×109x(R2=0.985 7)。式中y為OSA質(zhì)量，x為trans-OSA在液相色譜圖中的峰面積。

1.3.3.2 游離OSA的測定

準確稱取干燥至恒重的OSG樣品0.100 0 g于10 mL試管中，加入5 mL甲醇，于磁力攪拌器上在室溫下攪拌1 h。然后，離心(3 000×g)并收集上清液1 mL。將1 mL 上清液與1 mL HCl溶液(pH=3)在漩渦混合器上混合1 min。取上清液測定。經(jīng)HPLC測定，根據(jù)標準曲線計算含量，并計算樣品中游離OSA的含量(OS游離%)，可按OS游離/%=(ρ1×10/m)×100計算，其中ρ1為經(jīng)標準曲線計算所得濃度(mg/mL)，m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3.3 樣品取代度的測定

準確稱取干燥至恒重的0.050 0 g OSG樣品于25 mL試管中，并加入10 mL NaOH溶液(4 mol/L)，于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌12 h。水解結(jié)束后，量取2 mL水解液加入到25 mL試管中，并加入10 mL HCl(1 mol/L)、13 mL乙腈，磁力攪拌2 min。攪拌均勻后靜置30 min，取上清液經(jīng)HPLC測定樣品中總的OSA含量(OS總%)，可按OS總/%=(ρ2×125/m)×100計算，其中ρ2為經(jīng)標準曲線計算所得濃度(mg/mL),m為樣品質(zhì)量(g)。由此可知由取代基團產(chǎn)生的OSA的含量(OS取代%)，即：OS取代/%=OS總(%) - OS游離(%)。OSG的取代度(DS)可按下式計算：DS=(162×OS取代%)/(100×210-209×OS取代%)。

1.3.4 核磁共振分析

將燕麥β-葡聚糖以及真空干燥的OSG溶于d6-DMSO后進行核磁共振分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。方差分析用Tukey’s HSD進行分析，數(shù)據(jù)以(平均值±標準偏差)表示。使用Design Expert 7.0進行響應面試驗設計及其方差分析。圖表中以不同大寫英文字母代表顯著性差異(P<0.05為顯著差異)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應時間對OSG取代度的影響

如圖1所示，當反應時間在0～4 h范圍內(nèi)，OSG的取代度隨時間的延長而迅速增加。這是因為時間的延長增加了β-葡聚糖與OSA的接觸機會。當反應時間從4 h延長至6 h時，取代度沒有明顯增加。這是因為在改性反應中β-葡聚糖酯化反應和OSG水解反應并存，且在改性初期(0～4 h)酯化反應占主導地位，而隨產(chǎn)物合成量的增大，水解反應不斷提升，最終二者在改性后期(4 h后)達到平衡[12]。

圖1 反應時間對OSG取代度的影響Fig.1 Effects of reaction time on DS of OSG注：帶有不同字母數(shù)值之間差異顯著，P<0.05。

2.2 反應溫度對OSG取代度的影響

如圖2所示，反應溫度在25～45 ℃之間時，隨著溫度的升高，取代度呈顯著上升趨勢。這主要是溫度的升高使反應底物運動加速，增加了碰撞機會，提升了酯化反應速率。當反應溫度繼續(xù)從45 ℃升高到60 ℃，OSG取代度不但沒有升高反而顯著下降。這可能是因為過高的溫度使OSG水解速率大幅提升并顯著高于β-葡聚糖酯化反應速率的結(jié)果[13]。

圖2 反應溫度對OSG取代度的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on DS of OSG注：帶有不同字母數(shù)值之間差異顯著，P<0.05。

2.3 燕麥β-葡聚糖濃度對OSG取代度的影響

如圖3所示，燕麥β-葡聚糖濃度在1～2 mg/mL，隨著燕麥β-葡聚糖濃度的升高，取代度呈上升趨勢。在這一階段，增加體系中β-葡聚糖濃度能夠提高二者反應的機率，促進產(chǎn)物的取代度升高。繼續(xù)增加燕麥β-葡聚糖濃度，取代度下降。這可能是因為增大燕麥β-葡聚糖濃度后，體系的粘度增大，OSA在體系中分散不均勻，使得酯化反應效率降低[12]。

圖3 燕麥β-葡聚糖的濃度對OSG取代度的影響Fig.3 Effects of the concentration of oat β-glucan on DS of OSG.注：帶有不同字母數(shù)值之間差異顯著，P<0.05。

2.4 OSA添加量對OSG取代度的影響

如圖4所示，隨著OSA添加量的增加，取代度呈上升趨勢。這可能是因為加大OSA的添加量使得燕麥β-葡聚糖與OSA的接觸機會增加，進而取代度增大[12]。但是，實驗中發(fā)現(xiàn)當OSA添加量超過0.6 mL后，就會造成產(chǎn)物的得率下降。雖然體系的pH能夠通過向反應體系滴加堿來平衡，但隨著OSA濃度的增加，體系中局部酸酐的濃度增大，可能使多糖鏈發(fā)生降解[13]。所以綜合考慮到產(chǎn)物的得率和取代度，后期優(yōu)化試驗添加量選取0.6 mL OSA。

圖4 辛烯基琥珀酸酐添加量對OSG取代度的影響Fig.4 Effects of the addition of OSA on DS of OSG.注：帶有不同字母數(shù)值之間差異顯著，P<0.05。

2.5 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

按照Box-Behnken試驗設計，分別選取不同反應時間處理(2、4、6 h) 、反應溫度處理(35、45、55 ℃)以及燕麥β-葡聚糖濃度(1、2、3 mg/mL)作為優(yōu)化試驗的因素和水平。試驗共實施17組，測得樣品取代度的實際值和預測值見表1。

表1 取代度的響應面試驗方案與結(jié)果

可以看出實際值與預測值間相差不大，證明模型擬合較好。對表1數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得取代度的二次多項回歸方程為：DS=-0.14+0.028 218X1+0.004 079X2+0.015 935X3+0.000 05X1X2+0.000 08X1X3-0.000 1X2X3-0.002 78X12-0.000 04X22-0.002 59X32。由方差分析可知，模型的P值極顯著。擬合不足(Lack of Fit)檢驗的P=0.183 8(P>0.05)，模型失擬不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾小，且R2=0.991 2說明模型擬合程度良好，試驗誤差小。

由表2的P值可知，反應時間、燕麥β-葡聚糖濃度、反應時間2、反應溫度2、燕麥β-葡聚糖濃度2對取代度的影響極顯著(P<0.05)，說明該設計中因素對響應值的影響不是線性關系。

表2 取代度的二次響應模型方差分析

A，反應溫度和反應時間；B，燕麥β-葡聚糖濃度和反應時間；C，燕麥β-葡聚糖濃度和反應溫度圖5 因素間交互作用等高線圖Fig.5 Interactive effects of reaction temperature, the concentration of oat β-glucan, and reaction time on DS of OSG.

如圖5-A所示，在反應溫度小于45 ℃時，隨著反應溫度的增加，產(chǎn)物取代度增加。反應溫度大于45 ℃以后，取代度隨著溫度增加有降低的趨勢。延長反應時間至5 h，產(chǎn)物取代度迅速升高。反應時間大于5 h后，產(chǎn)物取代度變化不大。如圖5-B所示，在燕麥β-葡聚糖濃度小于2 mg/mL時，隨著濃度的增加，產(chǎn)物取代度增加。進一步提高濃度則產(chǎn)物取代度下降。如圖5-C所示，隨著反應溫度的升高和燕麥β-葡聚糖濃度的增加，產(chǎn)物取代度都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

利用Design Expert 7.0軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化，獲得OSG合成的最佳參數(shù)條件為：反應時間為4.66 h，反應溫度45.6 ℃，燕麥β-葡聚糖濃度為2.18 mg/mL。在次條件下實施3次驗證試驗，實測產(chǎn)物的最大取代度為(0.038 2±0.002 3)，與預測值(0.037 7)近似(相對誤差1.3%)，無顯著差異，這再次驗證了優(yōu)化控制方程的可適用性。

2.6 核磁共振(1H譜)分析

燕麥β-葡聚糖以及OSG的1H-NMR譜圖如圖6所示。在3.33 ppm和2.49 ppm附近的特征峰屬于溶劑水分和DMSO。而在5.39，5.26以及4.65 ppm附近的特征峰分別屬于葡萄糖分子上2-，3-以及6-C碳原子位上的羥基化學位移。在0.84 ppm附近的特征峰屬于辛烯基中末尾碳原子上氫原子的化學位移[14]。在1.21 ppm附近的特征峰屬于辛烯基中靠近末尾碳原子的3個碳原子上的氫原子的化學位移[14]。在1.98 ppm附近的特征峰屬于靠近辛烯基中靠近雙鍵的碳原子上的氫原子的化學位移[14]。

A，燕麥β-葡聚糖；B，C，D分別是取代度為0.008 0，0.017 2，0.0387的OSG圖6 燕麥β-葡聚糖與OSG的核磁共振(1H)圖譜Fig.6 1H Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of oat β-glucan and OSG with various DS.

3 結(jié)論

通過辛烯基琥珀酸酐疏水修飾燕麥β-葡聚糖，可獲得攜帶辛烯基琥珀?；难帑湨?葡聚糖(OSG)。研究發(fā)現(xiàn)，OSG的取代度(但是)受酯化反應時間、燕麥β-葡聚糖濃度、辛烯基琥珀酸酐添加量、反應溫度的控制。就反應時間(X1)、反應溫度(X2)和燕麥β-葡聚糖濃度(X3)對DS的影響規(guī)律而言，遵循如下方程：DS=-0.14+0.028 218X1+0.004 07 9X2+0.0159 35X3+0.000 05X1X2+0.000 08X1X3-0.000 1X2X3-0.002 78X12-0.000 04X22-0.002 59X32。獲得合成OSG最優(yōu)化條件下為反應時間為4.66 h，反應溫度45.6 ℃，燕麥β-葡聚糖濃度為2.18 mg/mL。此條件下產(chǎn)物取代度可達到0.038 2。推測OSG的1H核磁共振圖譜在0.84、1.21 和1.98 ppm位置的特征峰應屬于辛烯基中末尾碳原子上氫原子、靠近末尾碳原子的3個碳原子上的氫原子以及靠近辛烯基中靠近雙鍵的碳原子上的氫原子的化學位移，這證實了OSG的成功合成。后續(xù)研究應加強OSG表面活性以及生物活性的評價，在此基礎上進一步完成其安全性研究，為其在食品工業(yè)中應用奠定基礎。

[1] NETA N S, TEIXEIRA J A, RODRIGUES L R. Sugar ester surfactants: enzymatic synthesis and applications in food industry[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015, 55(5): 595-610.

[2] BERGERON V, WALTERMO ?, CLAESSON P M. Disjoining pressure measurements for foam films stabilized by a nonionic sugar-based surfactant[J]. Langmuir, 1996, 12(5): 1 336-1 342.

[3] WANG C, HE X W, HUANG Q, et al. The mechanism of starch granule reacted with OSA by phase transition catalyst in aqueous medium[J]. Food Chemistry, 2013, 141(4): 3381-3385.

[4] LEI D, LIU J, YE F, et al. Synthesis, characterization and aqueous self-assembly of octenylsuccinic corn dextrin ester with high molecular weight[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 41(20): 250-256.

[5] PRASHANTH M R S, PARVATHY K S, SUSHEELAMMA N S, et al. Galactomannan esters-a simple, cost-effective method of preparation and characterization[J]. Food Hydrocolloids, 2006, 20(8): 1 198-1 205.

[6] SARKAR S, GUPTA S, VARIYAR P S, et al. Hydrophobic derivatives of guar gum hydrolyzate and gum arabic as matrices for microencapsulation of mint oil[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 95(1): 177-182.

[7] MAYOL L, BIONDI M, RUSSO L, et al. Amphiphilic hyaluronic acid derivatives toward the design of micelles for the sustained delivery of hydrophobic drugs[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 102(4): 110-116.

[8] MENG F, ZHENG L, WANG Y, et al. Preparation and properties of konjac glucomannan octenyl succinate modified by microwave method[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 38: 205-210.

[9] DAOU C, ZHANG H. Oat Beta-Glucan: Its role in health promotion and prevention of diseases[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2012, 11(4): 355-365.

[10] YUSOFF A, MURRAY B S Modified starch granules as particlestabilizers of oil-in-water emulsions[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25: 42-55.

[11] QIU D, BAI Y, SHI Y C. Identication of isomers and determination of octenylsuccinate in modied starch by HPLC and mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2012, 135: 665-671.

[12] HUI R, QI C. Preparation and properties of octenyl succinic anhydride modified potato starch[J]. Food Chemistry, 2009, 114(1): 81-86.

[13] WANG J P, SU L H, WANG S. Physicochemical properties of octenyl succinic anhydride-modified potato starch with different degrees of substitution[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(3): 424-429.

[14] TIZZOTTI M J, SWEEDMAN M C, TANG D, et al. New1H NMR procedure for the characterization of native and modified food-grade starches[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(13): 6 913-6 919.

Synthesis of octenylsuccinate oat β-glucan

LIU Jia1,2, DONG Nan2, YE Fa-yin1,3, ZHAO Guo-hua1,3*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Food Processing Institute of Guizhou Province, Guiyang 550006，China) 3(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, Chongqing 400715, China)

In recent years, the investigation on synthesis and functional properties of polysaccharide-based macromolecular surfactants became popular in the research field. In this study, octenylsuccinate oat β-glucan (OSG) was synthesized with bioactive oat β-glucan as substrate and 2-ocentyl succinic anhydride (OSA) as esterifying agent. The effects of reaction parameters on the degree of substitution (DS) of oat β-glucan were optimized successively by single-factor experiment and response surface methodology. The results of single-factor experiment revealed that DS of OSG increased with OSA amount and reaction time, and increase and then decrease with reaction temperature and concentration of oat β-glucan. Furthermore, the results of response surface methodology implied that reaction time (X1), concentration of oat β-glucan (X3) and quadratic?terms of reaction time (X12), reaction temperature (X22) and concentration of oat β-glucan (X32) showed significant impacts on DS of OSG (P<0.05). When reaction time, reaction temperature and concentration of oat β-glucan were settled as 4.66 h, 45.6 ℃ and 2.18 mg/mL, OSG with the highest DS (0.0382) was obtained. The1H-NMR spectra confirmed the successful synthesis of OGS.

oat β-glucan; modification; degree of substitution; response surface methodology; nuclear magnetic resonance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610016

博士，助理研究員(趙國華教授為通訊作者,E-mail：zhaoguohua1971@163.com)。

國家自然科學基金面上項目(31371737)；重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)

2016-01-07，改回日期：2016-04-11