尹永祺，王淑雯，宋吳昱，高 璐，饒勝其，楊振泉，方維明

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

NaCl脅迫下Ca2+調控發(fā)芽大豆生理代謝和γ-氨基丁酸含量變化

尹永祺，王淑雯，宋吳昱，高 璐，饒勝其，楊振泉，方維明*

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

為研究NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆主要生理指標和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）富集的調控作用，利用CaCl2和乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）處理發(fā)芽大豆，研究NaCl脅迫下外源和內源Ca2+對發(fā)芽大豆主要生理代謝和GABA含量的影響。結果顯示，發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl聯(lián)合CaCl2處理，其芽長和呼吸速率顯著增加，表明CaCl2緩解了NaCl對發(fā)芽大豆生長的抑制，同時過氧化氫酶及過氧化物酶活力顯著提高，說明CaCl2可能是通過提高抗氧化酶活力來緩解NaCl脅迫下發(fā)芽大豆的抑制效應，而施用EGTA則呈相反的變化趨勢；NaCl聯(lián)合CaCl2處理后發(fā)芽大豆中GABA含量與單獨NaCl處理無顯著差異，但顯著高于對照組；在NaCl聯(lián)合CaCl2或EGTA基礎上施用氨基胍，發(fā)芽大豆子葉中GABA含量分別下降17.1%和9.8%，胚中分別下降26.5%和8.5%，表明NaCl脅迫下施用CaCl2在促進發(fā)芽大豆中GABA富集的同時還可保證生物產量，且CaCl2和EGTA處理下多胺降解途徑對GABA富集貢獻降低。

大豆；發(fā)芽；γ-氨基丁酸；NaCl脅迫

大豆是全球性農作物，亦是我國7大糧食作物之一，其具有產量高和營養(yǎng)豐富等特點，是人類膳食中重要的蛋白質和氨基酸來源[1]。大豆中蛋白質含量高達30%～40%，其籽粒發(fā)芽后，內源酶系被激活，不僅可降低植酸和單寧等抗營養(yǎng)因子含量，且大豆蛋白質水解可為累積γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）提供充足的含氮物質[2-3]，而GABA已于2009年被國家衛(wèi)生部認定為新資源食品，因此大豆已被用于開發(fā)富含GABA的功能食品。

高等植物中已經(jīng)明確的GABA代謝途徑包括GABA支路和多胺降解途徑[4]。GABA支路中谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）作用下直接生成GABA；多胺降解途徑則通過多胺在胺氧化酶（二胺氧化酶、多胺氧化酶）和氨基醛脫氫酶作用下經(jīng)4-氨基丁醛中間產物而生成GABA。二胺氧化酶是GABA合成途徑中的限速酶，而氨基胍（amino guanidine，AG）作為其專性抑制劑，已被用于研究GABA支路和多胺降解途徑對于GABA累積的貢獻率[5-6]。

植物籽粒于NaCl脅迫條件下發(fā)芽是富集GABA的有效方式[7-8]，然而大豆作為一種鹽敏感型作物[9]，盡管NaCl脅迫下其GABA含量顯著提高，但其生長和生物產量受到嚴重抑制。因此，如何使大豆在NaCl脅迫發(fā)芽期間富集GABA的同時保證其生物量是當務之急。Ca2+已廣泛用于提高植物對鹽、干旱、重金屬和低溫等非生物脅迫的耐受性，促進植物生長[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，粟米[12]和大豆[13]于低氧脅迫發(fā)芽期間施用Ca2+均可促進GABA富集。Ca2+對NaCl脅迫下發(fā)芽大豆生理代謝的影響及其調節(jié)GABA代謝酶活力以維持兩途徑富集GABA的動態(tài)平衡機制尚不清楚。

本實驗利用外源添加CaCl2和乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）（Ca2+螯合劑）探討NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆生理生化和GABA富集的影響，分析Ca2+處理下發(fā)芽大豆生理生化代謝變化，并通過在各處理中添加AG以明確NaCl脅迫下Ca2+對GABA支路與多胺降解兩途徑富集GABA的動態(tài)平衡調節(jié)，以期為大豆保健功能性食品開發(fā)提供技術參考和理論依據(jù)，推動大豆深加工產業(yè)的科學化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆籽粒購于2015年，產自中國吉林省敦化市，封裝于密閉容器中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

GABA標準品、乙腈（色譜純） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1200 Series高效液相色譜儀 美國Agilent公司；UV-7504C型紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；BCD-257SL型冰箱 青島海爾股份有限公司；PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司；ZXDP-A2080電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆發(fā)芽處理

稱取20 g籽粒飽滿的大豆，經(jīng)去離子水沖洗后置于體積分數(shù)1% NaClO溶液中浸泡消毒15 min，消毒大豆用去離子水沖洗至pH值中性后于30 ℃條件下浸泡4 h；將浸泡后的大豆置于發(fā)芽機，于30 ℃避光發(fā)芽。分別設以下處理：1）對照（去離子水）；2）NaCl脅迫處理（50 mmol/L NaCl）；3）NaCl脅迫加AG處理（50 mmol/L NaCl+2.5 mmol/L AG）；4）NaCl脅迫加CaCl2處理（50 mmol/L NaCl+6 mmol/L CaCl2）；5）NaCl脅迫加CaCl2和AG處理（50 mmol/L NaCl+6 mmol/L CaCl2+ 2.5 mmol/L AG）；6）NaCl脅迫加EGTA處理（50 mmol/L NaCl+5 mmol/L EGTA）；7）NaCl脅迫加EGTA和AG處理（50 mmol/L NaCl+5 mmol/L EGTA+2.5 mmol/L AG）。發(fā)芽4 d，每隔1 d更換培養(yǎng)液至培養(yǎng)結束，期間定時取樣測定相關指標。

1.3.2 指標測定

芽長：隨機選取30 粒發(fā)芽大豆，用游標卡尺測定其芽長；呼吸速率：參照小籃子法[14]測定；過氧化氫酶（catalase，CAT）活力：參照Beers等[15]方法測定；過氧化物酶（peroxidase，POD）活力：按高福元等[16]方法測定；GABA含量：參照Bai Qingyun等[17]的方法測定。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆形態(tài)特征變化的影響

圖1 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆形態(tài)的影響Fig. 1 Effect of Ca2＋ treatment on the morphology of germinating soybean under NaCl stress

由圖1可知，較正常條件發(fā)芽的大豆，NaCl脅迫下大豆生長受到抑制，而外源CaCl2可解除這種抑制效應，發(fā)芽4 d后其生長狀況優(yōu)于對照，NaCl聯(lián)合EGTA處理與NaCl單獨處理的大豆生長無明顯差異。NaCl及其聯(lián)合CaCl2或EGTA處理的發(fā)芽大豆再經(jīng)AG處理其生長均被進一步抑制。

2.2 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆芽長變化的影響

圖2 Ca2＋處理下發(fā)芽大豆芽長的變化Fig. 2 Changes in sprout length of germinating soybean under Ca2＋treatment

由圖2可知，發(fā)芽期間各處理下的發(fā)芽大豆芽長均隨發(fā)芽時間延長呈增加趨勢，發(fā)芽4 d后各處理間芽長具有顯著差異（P＜0.05）。發(fā)芽期間NaCl脅迫處理大豆的芽長顯著低于對照處理，發(fā)芽4 d時其芽長僅為對照的40%；而CaCl2能夠緩解NaCl對大豆芽長生長的抑制，其大豆芽長顯著增加（P＜0.05），發(fā)芽4 d后其芽長分別為對照和NaCl脅迫的1.22、3.35 倍，與圖1所示一致。NaCl聯(lián)合EGTA處理的大豆籽粒發(fā)芽4 d后其芽長較單獨NaCl處理無顯著變化，此外，除CaCl2處理，其他處理再經(jīng)AG處理的發(fā)芽4 d的大豆芽長未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。

2.3 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆呼吸速率變化的影響

圖3 Ca2+處理下發(fā)芽大豆呼吸速率的變化Fig. 3 Changes in respiratory rate of germinating soybean under Ca2＋ treatment

由圖3可知，呼吸速率與芽長變化趨勢一致，各處理的大豆籽粒發(fā)芽期間其呼吸速率均呈增加趨勢，NaCl聯(lián)合CaCl2處理的呼吸速率顯著高于單獨NaCl處理及對照（P＜0.05）。NaCl脅迫下大豆呼吸速率亦受到抑制，經(jīng)EGTA處理后的大豆發(fā)芽4 d時呼吸速率顯著高于NaCl單獨脅迫處理（P＜0.05）。而AG處理的呼吸速率都低于同水平未經(jīng)AG處理的呼吸速率。

2.4 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆CAT活力變化的影響

圖4 Ca2+處理下發(fā)芽大豆CAT活力變化Fig. 4 Changes in CAT activity of germinating soybean under Ca2＋ treatment

NaCl脅迫4 d后發(fā)芽大豆子葉和胚中CAT活力與對照相比均顯著增加（P＜0.05）。NaCl聯(lián)合CaCl2處理4 d后，其子葉中CAT活力顯著高于單獨NaCl處理，而胚中CAT活力較單獨NaCl處理顯著下降（P＜0.05）。NaCl聯(lián)合EGTA處理4 d后，子葉中CAT活力與NaCl處理無顯著差異（P＞0.05），而胚中顯著下降（P＜0.05）。此外子葉中經(jīng)過AG處理的CAT活力，除NaCl聯(lián)合EGTA處理比未經(jīng)AG處理的顯著上升外，其余各處理均顯著降低；胚中除NaCl單獨處理的CAT活力比未經(jīng)AG處理的顯著降低外，其余均顯著上升。

2.5 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆POD活力變化的影響

圖5 Ca2+處理下發(fā)芽大豆POD活力變化Fig. 5 Changes in POD activity of germinating soybean under Ca2＋ treatment

如圖5所示，發(fā)芽期間各處理發(fā)芽大豆子葉中POD活力變化趨勢并不一致，而隨發(fā)芽時間延長，對照組胚中POD活力呈下降趨勢，NaCl聯(lián)合CaCl2處理及其AG共同處理的無明顯變化，其余處理組均呈增長趨勢，且其活力均顯著低于子葉。NaCl脅迫聯(lián)合CaCl2處理后，發(fā)芽4 d的大豆子葉中POD活力顯著高于單獨NaCl處理（P＜0.05），而胚中則顯著降低。發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl聯(lián)合EGTA處理后，其子葉與胚中POD活力較NaCl處理均顯著下降（P＜0.05）。此外子葉和胚中經(jīng)過AG處理后的POD活力，除NaCl聯(lián)合EGDA處理與同水平未經(jīng)AG的POD活力顯著升高外，其余各處理較同水平未經(jīng)AG處理的POD活力均顯著降低。

2.6 NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆GABA含量變化的影響

圖6 Ca2+處理下發(fā)芽大豆GABA含量的變化Fig. 6 Changes in GABA content of germinating soybean under Ca2＋ treatment

由圖6可知，各處理下發(fā)芽大豆子葉和胚中GABA含量都隨發(fā)芽時間延長顯著增加（P＜0.05）。發(fā)芽4 d，單純經(jīng)NaCl脅迫處理的發(fā)芽大豆子葉和胚中GABA的含量顯著高于對照組，子葉中為對照組的1.57倍，胚中則為對照組的1.88倍。NaCl聯(lián)合CaCl2處理的發(fā)芽大豆子葉和胚中的GABA含量均顯著高于對照組，與單純經(jīng)NaCl脅迫處理的大豆子葉和胚中的GABA含量無顯著差異（P＞0.05）。此外，經(jīng)AG處理后的大豆子葉和胚中的GABA含量均低于同水平下未經(jīng)AG處理的（P＜0.05），子葉中分別下降了35.9%、17.1%、9.8%，胚中分別下降了32.4%、26.5%、8.5%。

3 討 論

本研究顯示，施用Ca2+后發(fā)芽大豆由于NaCl脅迫對其造成的傷害有所緩解，其物質代謝加速，恢復正常生長。Bowler等[18]研究結果表明，非生物脅迫下植物細胞內Ca2+濃度與抗氧化酶活力變化在時間上存在順序性，空間上也具有一致性。相關研究也已證實，細胞內Ca2+濃度與活性氧含量以及抗氧化酶活力緊密相關[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl聯(lián)合CaCl2處理后其CAT和POD活力均顯著增加，發(fā)芽大豆芽長和呼吸速率較NaCl脅迫和對照（正常培養(yǎng)）均顯著增加，發(fā)芽大豆恢復正常生長，這與非生物脅迫下施用Ca2+對黃瓜[19]、水稻[20]、大豆幼苗[21]和西蘭花[22]等多種植物中抗氧化酶活力的影響一致。同時，與單獨NaCl脅迫相比，發(fā)芽大豆經(jīng)施用Ca2+螯合劑——EGTA后，其生長和代謝均受到嚴重抑制，其CAT和POD活力降低。這些結果表明，Ca2+可能調控發(fā)芽大豆中抗氧化酶活力，CaCl2可通過提高抗氧化酶活力緩解NaCl對發(fā)芽大豆造成的脅迫效應，提高生物產量，這與CaCl2緩解非生物脅迫對水稻和大豆等植物的脅迫效應研究結果一致[20-21,23-24]；而EGTA抑制了Ca2+對抗氧化酶所起的調控作用，從而嚴重抑制發(fā)芽大豆生長。

發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl聯(lián)合CaCl2處理后，其子葉和胚中GABA含量較單獨NaCl脅迫均無顯著變化，然而由于CaCl2解除了NaCl脅迫，其子葉和胚的干質量均顯著增加，因此單株發(fā)芽大豆子葉和胚中GABA含量亦增加，表明NaCl脅迫下施用Ca2+不僅可增加發(fā)芽大豆生物產量，還可促進GABA富集。而這種促進作用可被Ca2+螯合劑所抑制，NaCl脅迫聯(lián)合EGTA處理后，發(fā)芽大豆生長嚴重受抑，且GABA積累量顯著下降，表明發(fā)芽大豆中Ca2+直接參與GABA的調節(jié)。這可能是由于GABA代謝是由GABA支路與多胺降解途徑所構成，GAD作為GABA支路中限速酶，是一種Ca2+/CaM依賴型酶，具有一個鈣調蛋白結合區(qū)。在本研究的NaCl脅迫下，施用外源CaCl2可使Ca2+濃度顯著增加，從而顯著提高GAD活力以達到富集GABA的目的。有研究表明，鹽脅迫添加Ca2+后，粟谷中GAD活力增加，而抑制劑則顯著抑制GAD活力[12]。同時，施用Ca2+亦可顯著提高低氧聯(lián)合NaCl脅迫下發(fā)芽蠶豆[5]和發(fā)芽大豆[25]中GAD活力。此外，利用AG抑制多胺降解途徑后顯示，NaCl脅迫下發(fā)芽大豆中多胺降解途徑對GABA的富集貢獻率大于30%，這與Xing Suguo等[6]研究結果一致。然而，NaCl脅迫下發(fā)芽大豆施用Ca2+或抑制劑EGTA后，各部位中多胺降解途徑對GABA的富集貢獻有所不同，CaCl2處理和EGTA處理的大豆子葉中分別降低17.1%和9.8%，而胚中分別下降26.5%和8.5%，低于單獨NaCl脅迫下的抑制量，表明CaCl2處理和EGTA處理下多胺降解途徑對GABA富集的貢獻率較單獨NaCl脅迫降低。

本研究表明NaCl脅迫下施用Ca2+可以解除NaCl對于發(fā)芽大豆生長的抑制作用，促使發(fā)芽大豆恢復生長，從而提高生物產量，這種恢復作用可能與Ca2+提高發(fā)芽大豆體內相關抗氧化酶活力有關，而EGTA處理抑制了Ca2+對抗氧化酶所起的調控作用，從而進一步抑制了發(fā)芽大豆生長。同時，NaCl脅迫下施用Ca2+后，發(fā)芽大豆中GABA含量相較單獨NaCl處理無顯著差異，但是GABA富集的兩條途徑的貢獻發(fā)生變化，Ca2+處理下多胺降解途徑對于GABA富集的貢獻率下降。

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Calcium Regulates the Main Physiological Indicators and Gamma-Aminobutyric Acid Accumulation in Germinating Soybean under NaCl Stress

YIN Yongqi, WANG Shuwen, SONG Wuyu, GAO Lu, RAO Shengqi, YANG Zhenquan, FANG Weiming*
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

In the present study, the effect of CaCl2and ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) on the main physiological indicators and gamma-aminobutyric acid (GABA) accumulation in germinating soybean under NaCl stress was investigated. Compared with NaCl stress alone, the sprout length and respiratory rate increased significantly under NaCl stress combined with CaCl2treatment, indicating that exogenous CaCl2mitigated the negative effect of NaCl stress. Meanwhile, CaCl2led to a significant increase in catalase (CAT) and peroxidase (POD) activities and could therefore alleviate the harmful effect of NaCl stress on the growth of germinating soybean. In contrast, the above effects were reversed by combination with EGTA. Under the supplemental CaCl2treatment, there was no significant difference in GABA content in the cotyledon and embryo of germinating soybean compared with NaCl stress treatment alone but it was significantly higher than the control. Furthermore, when aminoguanidine (AG), an amine oxidase inhibitor, was added under NaCl plus CaCl2treatment, GABA content in the cotyledon and embryo was decreased by 17.1% and 26.5%, respectively. In addition, AG added under NaCl combined with EGTA treatment resulted in a decrease in GABA content in cotyledon and embryo by 9.8% and 8.5%, respectively. The present study indicates that exogenous calcium countered the harmful effect of salt stress and increased the biomass and GABA content of germinating soybeans. Moreover, CaCl2or EGTA addition decreased the contribution of polyamine degradation pathway to GABA accumulation compared to NaCl stress.

soybean; germination; gamma-aminobutyric acid; NaCl stress

10.7506/spkx1002-6630-201621005

TS210.1

A

1002-6630（2016）21-0026-05

尹永祺, 王淑雯, 宋吳昱, 等. NaCl脅迫下Ca2+調控發(fā)芽大豆生理代謝和γ-氨基丁酸含量變化[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 26-30. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621005. http://www.spkx.net.cn

YIN Yongqi, WANG Shuweng, SONG Wuyu, et al. Calcium regulates the main physiological indicators and gammaaminobutyric acid accumulation in germinating soybean under NaCl stress[J]. Food Science, 2016, 37(21): 26-30. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621005. http://www.spkx.net.cn

2016-01-12

國家自然科學基金青年科學基金項目（31501401）；江蘇省自然科學基金青年基金項目（BK20150448）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（15KJB550010）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（SJLX16_0606）

尹永祺（1988—），男，講師，博士，研究方向為植物功能物質富集機理及技術。E-mail：yqyin@yzu.edu.cn

*通信作者：方維明（1965—），男，教授，博士，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：wmfang@yzu.edu.cn