， ， ， ， ， (.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 6600； .桓仁縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 遼寧 本溪 700；.遼寧省中醫(yī)藥研究院， 遼寧 沈陽 004 )

·種子檢驗(yàn)·

基于多元統(tǒng)計(jì)分析的黃芩種子質(zhì)量分級(jí)方法研究

李云靜1，梁芳2，張建逵1，趙越3，何婉婉1，王冰1
(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600； 2.桓仁縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 遼寧 本溪 117200；3.遼寧省中醫(yī)藥研究院， 遼寧 沈陽 110034 )

目的：建立黃芩種子的質(zhì)量分級(jí)方法。方法：對(duì)14個(gè)不同產(chǎn)地的黃芩種子進(jìn)行凈度、重量、含水量、生活力、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、長度、寬度、厚度等指標(biāo)的測定，運(yùn)用主成分分析、聚類分析、綜合加權(quán)評(píng)分等方法，確定黃芩種子質(zhì)量分級(jí)方法。結(jié)果：以500粒重量、發(fā)芽勢、生活力、發(fā)芽率、含水量為參考指標(biāo)，將黃芩種子分為2級(jí)。結(jié)論：基于多元統(tǒng)計(jì)分析的方法，建立了黃芩種子質(zhì)量分級(jí)方法，為黃芩種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

黃芩； 種子； 分級(jí)方法；

中藥黃芩為唇形科植物黃芩(ScutallariabaicalensisGeorgi)的干燥根。味苦、寒[1]。具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎之功效。臨床上用于治療上呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、菌痢、肝炎、高血壓等病癥。黃芩的主要有效成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等黃酮類化合物。隨著黃芩需求量的不斷增加，栽培黃芩的面積也日趨擴(kuò)大；因此出現(xiàn)了不同地域間黃芩藥材質(zhì)量差異較大、質(zhì)量均一性較差等問題，原因之一是黃芩藥材的種子質(zhì)量差異較大。故須制定科學(xué)有效的黃芩種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將黃芩分等級(jí)進(jìn)行培育，以提高黃芩藥材質(zhì)量的均一性，減少降低質(zhì)量差異。目前已有柴胡、大黃、桔梗、黃芪、木香、三七、王不留行、烏拉爾甘草、益母草等[2-10]中藥的種子通過聚類分析的方法進(jìn)行了分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的研究。孫志蓉等[16]采用方孔標(biāo)準(zhǔn)篩，按黃芩種子的粒徑大小將黃芩種子進(jìn)行分級(jí)；本文所采用的方法是先對(duì)不同產(chǎn)地的黃芩種子發(fā)芽率、生活力、發(fā)芽勢、重量、凈度、含水量、長度、寬度、厚度等指標(biāo)進(jìn)行測定，其次對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析，對(duì)篩選的指標(biāo)進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分，最后用聚類分析對(duì)不同產(chǎn)地的黃芩種子進(jìn)行等級(jí)的劃分。此分級(jí)方法為黃芩的栽培育種及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供指導(dǎo)。

1 儀器、試劑與樣品

1.1 儀 器

LHP-300型智能人工氣候箱(上海三發(fā)儀器有限公司)，DH 4000 AB電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，DHG-9145 A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，011163型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)。

1.2 試 劑

純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限責(zé)任公司)，TTC(北京索萊寶科技有限公司)，次氯酸鈉溶液(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 藥 材

收集不同產(chǎn)地的14批種子均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為唇形科植物黃芩(ScutallariabaicalensisGeorgi)的種子(見表1)。

表1 黃芩種子產(chǎn)地

編號(hào)產(chǎn)地編號(hào)產(chǎn)地1山東省沂水縣8山西省絳縣2陜西省澄城縣9甘肅省張掖市3河北省蔚縣10山西省長治縣4山東省莒縣11甘肅省隴西縣5陜西省渭南市12云南省東川縣6河北省承德市13山西省萬榮縣7安徽省亳州市14河北省張家口市張北縣

2 方 法

2.1 扦 樣

參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543. 2)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[17]，種子批的最大重量為10 000 kg，送檢樣品最少為50 g，凈度分析試樣最少為5 g(不少于2 500粒)。

2.2 凈度分析

依照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543.3)種子凈度分析執(zhí)行[17]。將扦樣得到的種子，分別稱取5 g，置于潔凈的玻璃板上，在不損傷種子的基礎(chǔ)上，用鑷子將凈種子與雜質(zhì)及其他種子區(qū)分開，并分別稱重，重復(fù)3次。

2.3真實(shí)性鑒定

觀察種子外觀形態(tài)表面特征及顏色，每個(gè)產(chǎn)地隨機(jī)數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，用游標(biāo)卡尺對(duì)種子的長度、寬度與厚度進(jìn)行逐粒測量，并對(duì)測量結(jié)果進(jìn)行記錄，計(jì)算其平均值。

2.4 重量測定[17]

采用500粒法對(duì)14個(gè)不同產(chǎn)地的黃芩種子進(jìn)行重量測定，從凈種子中隨機(jī)數(shù)取500粒，每個(gè)產(chǎn)地重復(fù)3次，并計(jì)算平均質(zhì)量。

2.5 水分測定[17]

參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543.6)水分測定執(zhí)行。分別采用高溫烘干法，(133±2)℃高溫條件下烘干4 h測定14批種子樣品的含水量。以上測定每產(chǎn)地3次重復(fù)，每重復(fù)(5±0.001)g。

2.6 生活力測定

采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)對(duì)14份不同產(chǎn)地的種子樣品進(jìn)行生活力測定，TTC溶液濃度為1%，于40 ℃恒溫條件下染色6 h。

2.7發(fā)芽試驗(yàn)

14批不同產(chǎn)地的黃芩種子均經(jīng)過1%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，并用蒸餾水常溫浸泡吸脹后，均置于紗布底下墊2層濾紙的發(fā)芽床上；25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每產(chǎn)地重復(fù)3次，每重復(fù)100粒種子。

2.8 分析方法

采用SPSS 16.0版本統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)黃芩種子凈度、含水量、千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、生活力等數(shù)據(jù)，采用相關(guān)性分析進(jìn)行指標(biāo)篩選，用主成分分析法對(duì)主指標(biāo)成分進(jìn)行提取，采用聚類分析的方法進(jìn)行聚類，采用綜合加權(quán)評(píng)分法與系統(tǒng)聚類分析相結(jié)合的方法將黃芩種子分為不同等級(jí)。

3 結(jié)果與分析

3.1 各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果分析

對(duì)收集的14批不同產(chǎn)地的黃芩種子進(jìn)行凈度、長度、寬度、厚度、含水量、生活力、千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢等指標(biāo)測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，甘肅省張掖市的種子凈度較低，在80%以下。山東省沂水縣、陜西省澄城縣、河北省蔚縣、河北省張家口市張北縣、山東省莒縣等地區(qū)黃芩種子凈度較高，均在95%以上。含水量在5.31%～9.82%之間，均在10%以下。500粒重量在0.68～0.97 g之間，河北省張家口市張北縣、河北省承德市、山西省絳縣的種子500粒重量較低，均在0.75 g以下；陜西省澄城縣、山西省長治縣、安徽省亳州市、云南省東川縣、甘肅省張掖市、山西省萬榮縣、河北省蔚縣的種子500粒重量較高，在0.78～0.88 g之間；其中山東省沂水縣、甘肅省隴西縣、山東省莒縣、陜西省渭南市的種子500粒重最高，均在0.9 g以上。不同產(chǎn)地的黃芩種子發(fā)芽率、生活力差異較大，發(fā)芽率在36.33%～73.67%之間，生活力在8.00%～74.67%之間；長度在1.69～1.94 mm之間；寬度在1.05～1.22 mm之間；厚度在0.87～1.36 mm之間。

3.2 種子分級(jí)結(jié)果與分析

3.2.1 相關(guān)性分析

對(duì)黃芩種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的各指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性，進(jìn)而進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3，確定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)的優(yōu)先級(jí)別。

由表3可知,黃芩種子的500粒重量與發(fā)芽率、長度、寬度均呈顯著相關(guān)；發(fā)芽勢與發(fā)芽率、生活力呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.744，0.834，發(fā)芽率與生活力呈顯著相關(guān)；種子長度與寬度、厚度呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.707，0.777；厚度與寬度呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.791；種子含水量與其他指標(biāo)均無相關(guān)性。

表2 不同產(chǎn)地黃芩種子各指標(biāo)測定結(jié)果

產(chǎn)地凈度(%)含水量(%)500粒重量(g)發(fā)芽率(%)生活力(%)發(fā)芽勢(%)長度(mm)寬度(mm)厚度(mm)山東省沂水縣95．809．580．9273．6774．6771．671．841．141．02河北省承德市89．335．820．7349．3359．3337．671．861．191．27陜西省澄城縣98．028．950．8965．3364．6762．331．921．201．36山西省長治縣91．407．020．8446．6744．3347．331．941．171．20安徽省亳州市91．788．410．7836．3341．3331．331．691．131．09甘肅省隴西縣94．007．890．9457．008．0014．001．911．191．17山西省絳縣92．378．530．7242．3354．3336．001．761．050．93云南省東川縣93．167．570．8744．0029．3324．671．841．151．12甘肅省張掖市72．975．310．8344．6720．6743．001．811．071．03山西省萬榮縣84．727．910．8050．6765．0046．001．821．090．97河北省蔚縣96．327．740．8369．6762．6760．671．741．100．92河北省張北縣95．868．040．6853．0059．3351．671．721．070．87山東省莒縣96．149．820．9769．6774．6770．331．831．221．03陜西省渭南市91．138．980．9062．0065．0060．331．931．211．32

表3 黃芩種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)相關(guān)性分析

含水量500粒重量發(fā)芽率生活力長度寬度厚度發(fā)芽勢含水量1500粒重量0．3131發(fā)芽率0．4540．581?1生活力0．499-0．0530．560?1長度-0．1850．572?0．281-0．0781寬度0．1210．660?0．4060．1120．707??1厚度-0．2990．3600．053-0．0920．777??0．791??1發(fā)芽勢0．4140．2440．744??0．834??0．0650．155-0．0611

注：“**”表示在0.01水平上極顯著相關(guān)；“*”表示在0.05水平上顯著相關(guān)。

3.2.2 主成分分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)表2中測定的9項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析(KMO統(tǒng)計(jì)量值為0.555；Bartlett球形檢驗(yàn)結(jié)果為plt;0.05，滿足進(jìn)行主成分分析的條件)，結(jié)果如表4所示，前3個(gè)特征值累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82.435%，說明前3個(gè)主成分基本包含了全部的指標(biāo)信息。取前3個(gè)主成分的特征值，并計(jì)算相應(yīng)的特征向量。前3個(gè)主成分為：

F1=0.169X1+0.149X2+0.190X3+0.232X4-0.158X5+0.143X6+0.203X7+0.111X8+0.184X9；

F2=-0.109X1-0.214X2+0.132X3-0.090X4-0.222X5+0.272X6+0.207X7+0.294X8-0.177X9；

F3=0.511X1+0.459X2+0.191X3-0.129X4-0.370X5-0.160X6+0.116X7-0.111X8-0.492X9。

注：X1為凈度；X2為含水量；X3為500粒重量；X4為發(fā)芽率；X5為生活力；X6長度；X7為寬度；X8為厚度；X9為發(fā)芽勢。

表4 主成分分析方差貢獻(xiàn)

主成分方差貢獻(xiàn)貢獻(xiàn)率(%)累積貢獻(xiàn)(%)13．65340．58840．58822．71930．21270．80031．04711．63582．43541．58217．565100．000

利用提取出的3個(gè)公因子作圖，結(jié)果如圖1所示，14批樣品數(shù)據(jù)在三維立體空間中可被分成兩類：

圖1 主成分分析3 D圖

級(jí)別500粒重量(g)發(fā)芽率(%)生活力(%)發(fā)芽勢(%)含水量(%)10．90±0．0568．07±4．4968．33±5．8565．07±5．498．46±1．0420．80±0．0847．11±6．1742．41±19．5536．85±12．017．68±0．72

表6 不同等級(jí)種子各指標(biāo)置信區(qū)間

級(jí)別500粒重量(g)發(fā)芽率(%)生活力(%)發(fā)芽勢(%)含水量(%)10．80～1．0059．26～76．8856．86～79．8054．31～75．836．42～10．5020．64～0．9635．02～59．204．09～80．7323．32～60．386．26～9．09

3.2.3 聚類分析

根據(jù)表3相關(guān)性分析結(jié)果可知，種子的厚度與長度、寬度相關(guān)性顯著，種子的長度、寬度與500粒重量相關(guān)性顯著，可用500粒重量代替以上3個(gè)指標(biāo)，故以500粒重量、發(fā)芽率、生活力、發(fā)芽勢作為種子質(zhì)量分級(jí)的依據(jù)；結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，種子含水量亦作為分級(jí)的依據(jù)。根據(jù)表2各指標(biāo)測定結(jié)果，使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用系統(tǒng)聚類分析方法，將14批種子在閾值為20處劃分為兩級(jí)，見圖2。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。其中一級(jí)種子有5批，二級(jí)種子有9批。其分級(jí)結(jié)果與3.2.2的結(jié)果一致，說明這種分級(jí)方法是合理的。

圖2 黃芩種子系統(tǒng)聚類分析樹狀圖

分級(jí)方法采用最低標(biāo)準(zhǔn)原則，即任何一項(xiàng)指標(biāo)不達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不是相應(yīng)等級(jí)的種子。

結(jié)合系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果以及實(shí)際生產(chǎn)的可操作性，初步將14批黃芩種子進(jìn)行了等級(jí)劃分，并將各等級(jí)不同指標(biāo)的置信區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表6。

對(duì)表6結(jié)果進(jìn)行分析。從各指標(biāo)置信區(qū)間結(jié)果可知，一級(jí)品500粒重量的范圍為0.80～1.00 g，二級(jí)品500粒重量的范圍為0.64～0.96；一級(jí)品生活力的范圍為56.86%～79.80%，二級(jí)品生活力的范圍為4.09%～80.73%；一級(jí)品發(fā)芽勢的范圍為54.31%～75.83%，二級(jí)品生活力的范圍為23.32%～60.38%；一級(jí)品含水量的范圍為6.42%～10.50%，二級(jí)品含水量的范圍為6.26%～9.09%。500粒重量、生活力、發(fā)芽勢、含水量等指標(biāo)的取值范圍在一級(jí)品與二級(jí)品之間存在重疊，不能通過以上4個(gè)指標(biāo)將一級(jí)品與二級(jí)品區(qū)分開，若想通過以上4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)，則需要進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，具體方法如下。

對(duì)500粒重量、發(fā)芽率、生活力、發(fā)芽勢、含水量等指標(biāo)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù)表3的相關(guān)性分析結(jié)果，對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化后的指標(biāo)進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分[18]，因?yàn)?00粒重量與發(fā)芽率、長度及厚度3個(gè)指標(biāo)呈顯著相關(guān)，故500粒重量的權(quán)重系數(shù)為0.30；發(fā)芽勢與發(fā)芽率、生活力2個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，故發(fā)芽勢的權(quán)重系數(shù)亦為0.30；發(fā)芽率與生活力這2個(gè)指標(biāo)與其他指標(biāo)的相關(guān)性相對(duì)較低，故發(fā)芽率與生活力兩個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均定為0.15；含水量與其他指標(biāo)雖無相關(guān)性，但根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要，將含水量的加權(quán)系數(shù)定為0.10。具體綜合加權(quán)評(píng)分結(jié)果如表7所示。

表7 綜合加權(quán)評(píng)分結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果含水量(%)500粒重量(g)發(fā)芽率(%)生活力(%)發(fā)芽勢(%)綜合評(píng)分1．260．971．621．131．441．26-1．68-1．22-0．450．38-0．54-0．710．770．630．910．640．900．77-0．740．05-0．67-0．360．02-0．210．34-0．64-1．55-0．51-0．91-0．74-0．061．200．20-2．15-1．92-0．510．44-1．34-1．040．13-0．64-0．68-0．310．40-0．90-1．10-1．30-0．60-2．08-0．07-0．84-1．53-0．23-0．65-0．05-0．41-0．330．66-0．05-0．10-0．18-0．071．280．540．800．480．06-1．80-0．140．380．28-0．411．441．551．281．131．361．380．790．740．630．660．780．73

將綜合加權(quán)評(píng)分的結(jié)果重新進(jìn)行系統(tǒng)聚類，聚類結(jié)果如圖3所示，將14批黃芩種子在閾值為10處聚成了兩類，其結(jié)果與圖1、圖2的分類結(jié)果相同。根據(jù)綜合加權(quán)評(píng)分的結(jié)果，對(duì)每一級(jí)種子的置信區(qū)間進(jìn)行確定，一級(jí)黃芩種子的置信區(qū)間范圍為0.172～1.683，二級(jí)黃芩種子的置信區(qū)間范圍-0.963～-0.063。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法，對(duì)兩級(jí)綜合加權(quán)評(píng)分后的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明兩級(jí)黃芩種子的加權(quán)評(píng)分值具有極顯著差異(plt;0.01)，故該方法可用來進(jìn)行黃芩種子等級(jí)的劃分(樣品批次應(yīng)大于等于2)。

圖3 綜合加權(quán)評(píng)分系統(tǒng)聚類結(jié)果

4 結(jié)論與討論

4.1在黃芩種子質(zhì)量分級(jí)的指標(biāo)中，種子的500粒重量對(duì)種子的飽滿程度以及長度、寬度、厚度均有較大影響，故500粒重量為主要參考指標(biāo)；種子的生活力決定種子潛在的發(fā)芽能力，種子的發(fā)芽率決定種子在田間的出苗率，種子的發(fā)芽勢決定今后田間種苗質(zhì)量是否均一，故黃芩種子的生活力、發(fā)芽勢、發(fā)芽率均應(yīng)作為黃芩種子質(zhì)量分級(jí)的重要參考指標(biāo)；而種子的含水量對(duì)種子的壽命有影響[19]，所以含水量也應(yīng)作為黃芩種子質(zhì)量分級(jí)的參考指標(biāo)。

4.2在計(jì)算每一級(jí)種子的置信區(qū)間范圍時(shí)，有4個(gè)指標(biāo)的置信區(qū)間在兩級(jí)之間出現(xiàn)了重疊。為解決置信區(qū)間范圍重疊問題，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評(píng)分后，再對(duì)黃芩種子質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。此方法中各項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的大小，是根據(jù)各指標(biāo)間的相關(guān)性系數(shù)高低與實(shí)際生產(chǎn)需要相結(jié)合來確定的。對(duì)綜合加權(quán)評(píng)分的結(jié)果重新進(jìn)行系統(tǒng)聚類，計(jì)算2個(gè)等級(jí)種子的置信區(qū)間無重疊。故說明綜合加權(quán)評(píng)分的方法的必要性和科學(xué)性。目前關(guān)于中藥材種子質(zhì)量分級(jí)的研究中，未見到該方法的報(bào)道[2-15]。

4.3藥材質(zhì)量的優(yōu)劣、產(chǎn)量的高低與中藥材種子質(zhì)量的好壞息息相關(guān)。要提高中藥材質(zhì)量，首先應(yīng)該保證中藥材種子的質(zhì)量，因此種子質(zhì)量分級(jí)的研究工作必不可少。因?yàn)橹挥薪⒘朔N子質(zhì)量的分級(jí)方法，才可能制定種子的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而對(duì)市場上的藥材種子質(zhì)量進(jìn)一步地規(guī)范，從而提高中藥材生產(chǎn)的規(guī)范化水平。本研究通過收集不同批次不同產(chǎn)地的黃芩種子，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，初步制定了黃芩種子質(zhì)量分級(jí)方法，為黃芩種子質(zhì)量評(píng)價(jià)以及生產(chǎn)規(guī)范化提供理論依據(jù)。

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(本欄目責(zé)任編輯：申 曉)

Study on the Classification Method for Seed Quality ofScutallariabaicalensis
Based on Multivariate Statistical Analysis

LIYunjing1,LIANGFang2,ZHANGJiankui1,ZHAOYue3,HEWanwan1,WANGBing1

2016-05-26

國家中醫(yī)藥管理局遼寧省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心建設(shè)項(xiàng)目；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(編號(hào)：201407002)。

李云靜(1990—)，女，遼寧朝陽人；碩士研究生，主要從事中藥種質(zhì)資源及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究；E-mail:1602677763@qq.com。

張建逵(1980—)，男，遼寧大連人；副教授，主要從事中藥種質(zhì)資源及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究；E-mail:heinrich1980@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.10.114

S 567

A

1001-4705(2016)10-0114-05