宋 英， 許西西， 丁 維， 茅東升

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 杭州 310014)

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神經(jīng)節(jié)苷脂對脂多糖損傷大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的保護(hù)作用*

宋 英△， 許西西， 丁 維， 茅東升

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 杭州 310014)

目的：研究內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12)脂多糖(LPS)損傷后的作用及機(jī)制。方法：培養(yǎng)PC12細(xì)胞，建立LPS損傷模型，采用MTT法檢測不同濃度LPS對PC12細(xì)胞存活率的改變、葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑D(D-PDMP)耗竭內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂時LPS對PC12細(xì)胞存活率的改變以及添加外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1后對PC12細(xì)胞存活率的保護(hù)作用；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)；RT-PCR檢測NF-κB的相對表達(dá)含量。結(jié)果：LPS能導(dǎo)致PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變及存活率下降，且隨著LPS濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸降低；神經(jīng)節(jié)苷脂GM1能明顯改善LPS所致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及存活率的改變；工具藥D-PDMP耗竭內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂后，LPS對PC12細(xì)胞的損傷更嚴(yán)重，添加外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，細(xì)胞形態(tài)學(xué)及存活率得到明顯改善，細(xì)胞存活率上升；LPS損傷時細(xì)胞內(nèi)NF-κB含量增加；D-PDMP預(yù)先耗竭內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂時NF-κB含量增加更多；添加外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1后NF-κB含量降低。結(jié)論：內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對PC12細(xì)胞LPS損傷具有保護(hù)作用, 可能是通過NF-κB信號通路來發(fā)揮作用的。

神經(jīng)節(jié)苷脂GM1；大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株；脂多糖；NF-κB

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.006

神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，即單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂，是最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂之一，廣泛存在于脊椎動物組織中，在生物質(zhì)膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中尤為豐富。研究表明，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1在一些信號復(fù)合體系統(tǒng)中起到至關(guān)重要的作用，其中較典型的是其位于膜筏時，能與含有糖脂結(jié)合域的特殊蛋白相互作用。

這也就是說，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1可能與調(diào)控離子轉(zhuǎn)運、神經(jīng)元分化、G蛋白偶聯(lián)受體、免疫系統(tǒng)反應(yīng)、神經(jīng)信號等機(jī)制的蛋白相互作用[1-3]。雖然目前在臨床上已經(jīng)開始使用外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1來治療神經(jīng)退行性疾病，但有關(guān)內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用卻鮮有報道。近年來一些研究提示，葡萄糖神經(jīng)酰胺合成抑制劑D(D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol，D-PDMP)能競爭性抑制葡糖苷酰鞘氨的合成從而耗竭內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂，進(jìn)而為內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂的研究開辟了新領(lǐng)域。我們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1能通過調(diào)控PKC信號通路從而對神經(jīng)細(xì)胞損傷后的凋亡起保護(hù)作用，但其對于脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)炎癥損傷所致的細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用，仍不可知[4]。本實驗中，首先采用D-PDMP耗竭PC12細(xì)胞的內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂，然后通過LPS損傷細(xì)胞，進(jìn)而研究內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂在細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮的作用，并闡明作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

D-PDMP、神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、LPS、碘化丙啶(propidiumiodide，PI)和Hoechst 33342(Sigma公司，美國)；二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(上海生物技術(shù)有限公司)；高糖培養(yǎng)基(DMEM)和馬血清(Gibco，美國)；胎牛血清(杭州四季青)；大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12)(上海中科院細(xì)胞所)。

1.2 D-PDMP細(xì)胞毒性考察

將PC12細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)。設(shè)定正常對照組、D-PDMP處理組(D-PDMP濃度為0.005～50 nmol/l)，培養(yǎng)6 d后采用MTT法測定各組的吸光度值。以正常組細(xì)胞存活率為100%，觀察D-PDMP的細(xì)胞毒性。

1.3 PC12細(xì)胞LPS損傷模型的建立

將PC12細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)。設(shè)立正常對照組、LPS損傷組(LPS濃度為0.1～1 000 nmol/L)，培養(yǎng)24 h后采用MTT法測定各組的吸光度值。以正常組細(xì)胞存活率為100%，確定LPS最佳損傷濃度。

1.4 內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

將PC12細(xì)胞接種，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)立正常對照組、LPS損傷組、D-PDMP+LPS損傷組和GM1干預(yù)治療組。正常對照組：常規(guī)培養(yǎng)，作為對照；LPS損傷組：不加D-PDMP，培養(yǎng)6 d，第7天加入LPS；D-PDMP+LPS損傷組：加入D-PDMP，培養(yǎng)6 d，第7天加入LPS；GM1干預(yù)治療組：加入D-PDMP，培養(yǎng)6 d，第7天加入LPS的同時加入不同濃度的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(0.001～10 μmol/L)。24 h后測定各組MTT吸光度值。確定神經(jīng)節(jié)苷脂GM1最佳治療濃度。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察PC12細(xì)胞的形態(tài)

將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，同1.4設(shè)立正常對照組、LPS損傷組、D-PDMP+LPS損傷組和GM1干預(yù)治療組(此處神經(jīng)節(jié)苷脂GM1濃度選實驗得出最佳神經(jīng)節(jié)苷脂GM1濃度)。24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.6 熒光雙重染色觀察

將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，實驗分組同上。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入終濃度為10 μg/ml的Hoechst 33342和PI進(jìn)行雙重染色，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡和壞死的情況，以明確PC12細(xì)胞損傷后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.7 RT-PCR檢測NF-κB相對表達(dá)含量

將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，實驗分組同上。培養(yǎng)24 h后分別提取各組RNA，采用RT-PCR技術(shù)測定各組NF-κB含量(F:CTTCTGGGCCATATGTGGAGAT;R: TCGCACTTGTAACGGAAACG)，內(nèi)參為GAPDH(F:GGTGGACCTCATGGCCTACAT;R: GCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATCCT)。其中引物序列采用Primer Express 2.0和Beacondesigner熒光引物設(shè)計軟件進(jìn)行設(shè)計，由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 D-PDMP對細(xì)胞的毒性作用

用MTT法檢測經(jīng)D-PDMP處理6 d后的PC12細(xì)胞的存活率，以正常組細(xì)胞存活率為100%，與正常組相比，各組隨著內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂被D-PDMP耗竭細(xì)胞存活率沒有明顯的變化(存活率分別為(99.0±7.4)%、(97.0±7.2)%、(94.9±5.1)%、(95.2±6.4)%、(93.3±4.1)%。

D-PDMP: D-threo-1-1-phenyl-2-decanoylamin-3-morpholino-propanol

2.2 LPS損傷PC12細(xì)胞模型的建立

隨著LPS濃度的升高，PC12細(xì)胞的存活率逐漸降低，當(dāng)LPS的濃度為0.1 nmol/L時，細(xì)胞存活率可達(dá)(76.2±5.7)%。當(dāng)LPS的濃度為1 000 nmol/L時，細(xì)胞存活率僅有(50.0±4.2)%，差異有顯著性(P<0.01)。參考文獻(xiàn)及預(yù)實驗, 我們選擇100 nmol/L作為損傷模型。

Con: Control; LPS： Lipopolysaccharide

**P<0.01vscontrol group

2.3 內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

以正常組細(xì)胞存活率為100%，與正常組相比，LPS損傷組存活率為(77.0%±5.4%)和D-PDMP+LPS損傷組存活率為(72.0%±4.2%)細(xì)胞均有一定程度的損傷，且D-PDMP+LPS損傷組細(xì)胞損傷更嚴(yán)重(P<0.01)，當(dāng)加入外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1后，損傷情況均有所改善(P<0.01)當(dāng)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1濃度由0.001 μmol/L增加至0.1 μmol/L時，細(xì)胞存活率逐漸增高(存活率分別為83.9%±5.1%、88.3%±3.4%、92.2%±4.1%)；當(dāng)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1濃度高于0.1 μmol/L時，細(xì)胞存活率反而下降(存活率分別為87.5%±5.1%、85.6%±3.7%)。即神經(jīng)節(jié)苷脂GM1濃度為0.1 μmol/L時，細(xì)胞存活率最高，參考文獻(xiàn)以及預(yù)實驗, 選擇0.1 μmol/l作為GM1最佳保護(hù)濃度。

Con: Control; LPS: Lipopolysaccharide; D-PDMP: D-threo-1-1-phenyl-2-decanoylamin-3-morpholino-propanol

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsD-PDMP+LPS

2.4 倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞的形態(tài)

使用倒置顯微鏡對各組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，正常對照組：(1)PC12細(xì)胞胞體輪廓清晰，呈現(xiàn)簇狀，有生長突起；LPS損傷組；(2)細(xì)胞扁平、皺縮、突起折斷或消失；D-PDMP+LPS損傷組；(3)細(xì)胞的損傷比LPS損傷組更為嚴(yán)重，細(xì)胞明顯皺縮，突起基本全部消失；GM1干預(yù)治療組；(4)損傷明顯有所減輕，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則，可見突起生長(圖4，圖4見彩圖頁Ⅺ)。

2.5 熒光雙重染色觀察細(xì)胞凋亡、壞死情況

熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的凋亡情況，正常的PC12細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核凝聚、深染，呈深藍(lán)色，壞死細(xì)胞著色為粉紅色。正常對照組細(xì)胞生長狀況好，幾乎未發(fā)生死亡；LPS損傷組細(xì)胞狀態(tài)不佳，出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象；D-PDMP+LPS損傷組細(xì)胞凋亡、壞死現(xiàn)象均增多；而GM1干預(yù)治療組細(xì)胞狀態(tài)得到改善，細(xì)胞凋亡、壞死現(xiàn)象均有所減輕(圖5，圖5見彩圖頁Ⅺ)。

2.6 RT-PCR檢測NF-κB相對表達(dá)含量

采用SYBRGreenRT-PCR法進(jìn)行檢測，根據(jù)公式2-△△Ct，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。與正常組相比，損傷組細(xì)胞中的NF-κB的表達(dá)明顯增高，且D-PDMP+LPS損傷組高于LPS損傷組(P<0.05)，這說明可能是由于D-PDMP的抑制作用使LPS對PC12細(xì)胞的損傷加劇，所以D-PDMP+LPS損傷組NF-κB的表達(dá)多于LPS損傷組；而對于GM1干預(yù)治療組，NF-κB的表達(dá)則明顯低于損傷組(P<0.05)，這表明內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂可能通過抑制NF-κB信號通路的活化，來實現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)作用的(表1)。

3 討論

內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及腦組織保護(hù)之間關(guān)系十分復(fù)雜。近年來，關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂GM1及其相關(guān)蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)越來越引起人們的重視。眾多研究表明，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1能影響中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、參與神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長與再生以及保護(hù)腦缺血所造成的腦損傷作用[5-7]，也可能與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[8-11]。但是由于內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂的研究缺乏工具藥，其作用及作用機(jī)制仍有待被闡明。

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，因其有可傳代特點，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究。本實驗中選取PC12細(xì)胞建立LPS損傷模型，來證明內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對細(xì)胞LPS損傷的保護(hù)作用。實驗數(shù)據(jù)顯示，長時間以D-PDMP處理PC12細(xì)胞并不引起細(xì)胞存活率的改變，這說明D-PDMP本身不具有細(xì)胞毒性，耗竭內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂并不造成細(xì)胞生長障礙，而使用D-PDMP競爭性抑制內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂后，會加重LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，這間接表明內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂在LPS損傷時，具有一定的細(xì)胞保護(hù)作用。添加外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對LPS的損傷具有保護(hù)作用，當(dāng)D-PDMP耗竭內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂時神經(jīng)節(jié)苷脂GM1可以逆轉(zhuǎn)由于內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂不足而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷加重。實驗中發(fā)現(xiàn)NF-κB含量與各組細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)關(guān)系。由于NF-κB是介導(dǎo)很多免疫及炎癥反應(yīng)的中心物質(zhì)，同時也是細(xì)胞凋亡信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。因此，我們猜想內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對PC12細(xì)胞LPS損傷的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控NF-κB信號通路的活化來發(fā)揮作用的。

Tab. 1 Apoptosis and necrosis cells and relative expression of ±s， n=3)

LPS: Lipopolysaccharide; D-PDMP: D-threo-1-1-phenyl-2-decanoylamin-3-morpholino-propanol

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsD-PDMP+LPS

本實驗證明了內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂對細(xì)胞LPS損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號通路的活化來實現(xiàn)的，這將為內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂在神經(jīng)損傷方面的作用研究提供一定的理論依據(jù)。

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The protective effects of gangliosides on LPS-induced PC12 cells injury

SONG Ying△, XU Xi-xi, DING Wei, MAO Dong-sheng

(Technology of Zhejiang University, Hangzhou 310014, China)

Objective: To investigate the protective effects of endogenous gangliosides on LPS-induced PC12 cells injury and its possible mechanism. Methods: PC12 cells were cultured, and lipopolysaccharide(LPS) injury model was established. We detected the changes in survival rate of different concentrations of LPS on PC12 cells, and the changes in survival rate of LPS when endogenous gangliosides were exhausted by D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol(D-PDMP), and the protective effects of monosialoganglioside (GM1) on LPS-induced PC12 cells injury. Meanwhile, we observed the morphological changes of GM1 on PC12 cells induced after LPS injury by inverted microscope and fluorescence microscope, and then we detected the relative expression of NF-κB. Results: LPS could decrease the survival rate of cells in a concentration-dependent manner, and GM1 could significantly protect the cells against the changes in survival rate and morphological damages induced by LPS; After depletion of endogenous gangliosides by D-PDMP, LPS had more injury to PC12 cells, which could be improved by adding GM1; RT-PCR results showed that the relative expression of NF-κB in PC12 cells was increased in LPS group, while relative expression of NF-κB increased much higher when endogenous gangliosides were exhausted by D-PDMP, and the relative expression of NF-κB was decreased after GM1 being added. Conclusion: The endogenous gangliosides might through NF-κB signal pathway to protect PC12 cells against LPS-induced injury.

monosialoganglioside(GM1); PC12 cells; LPS; NF-κB

浙江省自然基金(LY13H090006)；全國臨床藥學(xué)研究基金(L2011079)

2015-12-07

2016-02-16

R741

A

1000-6834(2016)04-310-05

△【通訊作者】Tel： 0571-88320535； E-mail： songying@zjut.edu.cn