黎敏

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

MACC1和CIP2A蛋白表達的相關(guān)性及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系

黎敏

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

目的檢測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）蛋白在胃癌病變組織及癌旁正常組織中的表達，以及與胃癌各臨床病理特征的關(guān)系，進一步分析MACC1與蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）蛋白表達是否具有相關(guān)性，評估胃癌預(yù)后，并為治療提供思路。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測胃癌組織和癌旁正常組織中MACC1蛋白的表達，分析其表達差異性。免疫組織化學(xué)法測定30例胃癌組織和癌旁正常組織中MACC1和CIP2A蛋白的表達，分析MACC1蛋白與胃癌臨床不同病理特征的關(guān)系，同時分析MACC1和CIP2A蛋白的相關(guān)性。結(jié)果MACC1蛋白在癌旁正常組織和胃癌組織中的陽性表達率分別為16.7%和76.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CIP2A蛋白在癌旁正常組織和胃癌組織中的陽性表達率分別為23.3%和73.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同性別、年齡、組織類型的MACC1蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不同組織分化程度、腫瘤侵潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期的的MACC1蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；MACC1與CIP2A蛋白表達呈正相關(guān)。結(jié)論MACC1與CIP2A蛋白呈正相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測可以判斷患者的預(yù)后。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1蛋白；蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子蛋白；胃癌；預(yù)后

胃癌在消化道腫瘤的發(fā)病率中居首位，患病率高，生存期短，預(yù)后差，總體療效不佳。其預(yù)后與很多因素相關(guān)，如性別、年齡、Borrmann分型、腫瘤細胞的分化程度、腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、手術(shù)的根治情況、術(shù)后化療的方案及次數(shù)、患者本身對化療的敏感程度等綜合因素有關(guān)。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）蛋白是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/C-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的連接蛋白，起紐帶作用。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的MACC1蛋白表達高，可作為獨立的預(yù)后評價指標(biāo)。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）蛋白通過穩(wěn)定c-Myc，促進細胞增殖和錨定獨立生長，阻滯衰老和分化來促進體內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。本研究旨在尋找MACC1蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達，以及與CIP2A基因表達的相關(guān)性及其意義，為識別與尋找診斷靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本收集

選取2013年4月-2013年10月于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切取的胃癌組織，配對距癌組織邊緣＞5 cm的正常組織，所有組織經(jīng)病理科蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色證實，每組30例。樣本離體后一份立即裝入凍存管，30 min內(nèi)迅速放置入-80℃冰箱冷凍保存，另一份石蠟包埋。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實驗試劑

鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）免疫組織化學(xué)二抗試劑盒（SP-0023，美國Zymed公司），bs-5948R兔抗人CIP2A多克隆抗體、bs-4293R兔抗人MACC1多克隆抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，超純RNA提取試劑盒、引物設(shè)計為北京德元國際生物公司。

1.3實驗方法

1.3.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)提取組織總RNA， RNA電泳，RNA消化，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)，結(jié)果判定依照實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)最先檢測的數(shù)據(jù)，按2-△△ct相對定量公式計算，各反應(yīng)管Ct值進行相關(guān)換算，得到mRNA相對表達量。即以正常組織為對照樣本，求出每種被試目的基因?qū)?yīng)定量值，以便找出目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

F=2-[（待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均值Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值）]

1.3.2免疫組織化學(xué)法本實驗采用免疫組織化學(xué)SP染色法，即過氧化物酶標(biāo)記的鏈菌卵白素染色法。根據(jù)顯色程度：細胞無著色計0分，弱陽性（+）（淡黃色）1分，中度陽性（++）（棕黃色）2分，強陽性（+++）（棕黑色）3分。根據(jù)陽性細胞在細胞中所占比例：弱陽性（+），陽性細胞數(shù)＜25%+；中度陽性（++），陽性細胞數(shù)為25%～50%；強陽性（+++），陽性細胞數(shù)＞50%。綜合計量=弱陽性百分比×1+中度陽性百分比×2+強陽性百分比×3。最終結(jié)果（隨機觀察≥10個高倍視野）：0分為陰性（-）；總分值＜1分（+）；總分值1.0～1.5分（++）；總分值＞1.5分（+++）。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，兩組無序計數(shù)資料比較用χ2檢驗，兩組等級計數(shù)資料等級強度比較用秩和檢驗；用Pearson修正系數(shù)檢驗MACC1與CIP2A蛋白的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

胃癌組織MACCl蛋白的相對表達量為（10.75± 0.06），癌旁組織為（1.00±0.06），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=627.996，P=0.000）。

2.2免疫組織化學(xué)法

2.2.1不同組織中MACC1蛋白的表達MACC1蛋白多表達于細胞漿，細胞核內(nèi)有少量表達。胃癌組織MACC1蛋白表達陽性率為76.7%（23/30），癌旁組織為16.7%（5/30），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.696，P=0.000）。兩組MACCA蛋白表達強度比較，經(jīng)秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-4.970，P= 0.000），等級強度差別明顯。結(jié)果證實MACC1蛋白在胃癌組織中表達強度強，在癌旁正常組織中表達強度弱。見表1和圖1、2。

表1　不同組織中MACC1蛋白的表達強度（n=30，例）

圖1　MACC1蛋白在胃癌組織中的表達（Elivision×400）

圖2　MACC1蛋白在正常組織中的表達（Elivision×400）

2.2.2不同組織中CIP2A蛋白的表達CIP2A蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達，CIP2A蛋白多表達于細胞核，細胞漿中有少量表達。胃癌組織CIP2A蛋白陽性表達率為73.3%（22/30），癌旁組織為23.3%（7/30），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 15.017，P=0.000）。兩組間CIP2A蛋白表達強度比較，經(jīng)秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-4.381，P= 0.000），等級強度差異明顯，表明CIP2A蛋白在胃癌組中的表達由低到高呈等級遞增關(guān)系，而在癌旁正常組織中表達強度由高到低呈等級遞減關(guān)系。結(jié)果證實MACC1蛋白在胃癌組織中表達強，在癌旁正常組織中表達弱。見表2和圖3、4。

表2　不同組織中CIP2A蛋白的表達強度（n=30，例）

圖3　CIP2A蛋白在胃癌組織中的表達（Elivision×400）

圖4　CIP2A蛋白在正常組織中的表達（Elivision×400）

2.2.3不同病理特征組織中MACC1的表達根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2010年第7版），收集同期手術(shù)切取的胃癌組織及對應(yīng)的距離癌組織＞5 cm的癌旁組織各30例，收集臨床資料，對所收集的胃癌進行分期，對患者臨床資料進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，男性18例，平均年齡56.5歲；女性12例，平均年齡58.2歲，兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但男性發(fā)病率高于女性。其中，Ⅳ期6例患者已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅲ期12例中有10例患者伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅰ期5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，T4組7例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，T1組2例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。通過對各臨床因素與MACC1蛋白的陽性表達進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，胃癌的臨床分期、浸潤深度、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化的MACC1蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明胃癌組織內(nèi)的MACC1蛋白高表達，MACC1蛋白表達陽性率與腫瘤的惡性程度相關(guān)，而不同性別、年齡、組織類型組的MACC1蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明腫瘤的發(fā)展與性別、年齡、組織類型無關(guān)，MACC1蛋白高表達的患者提示預(yù)后差。見表3。

表3　不同臨床病理特征組織中MACC1的表達

2.2.4胃癌組織中MACC1與CIP2A蛋白表達的相關(guān)性CIP2A蛋白與胃癌的關(guān)系比較明確，CIP2A蛋白與胃癌的惡性程度相關(guān)，在臨床分期晚、組織分化低、有轉(zhuǎn)移的患者癌組織內(nèi)呈高表達，而在正常組織中不表達或低表達，惡性程度越高表達越高。本實驗證實MACC1蛋白在胃癌組織中同樣高表達，且與胃癌的惡性程度密切相關(guān)。本實驗30例胃癌組織中，83.3%（25/30）MACC1蛋白和CIP2A蛋白表達相同。其中，19例MACC1和CIP2A蛋白表達都為顯性，5例MACC1和CIP2A蛋白表達都為隱性，通過Pearson修正系數(shù)檢驗胃癌組織中MACC1與CIP2A蛋白表達的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.478，P= 0.013）。見表4。

表4　胃癌組織中MACC1與CIP2A蛋白表達的相關(guān)性例

3 討論

CIP2A位于人類3號染色體上，是蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的抑癌基因，能夠抑制PP2A對c-Myc蛋白S62位的去磷酸化作用。c-Myc蛋白是一種癌基因蛋白，位于細胞核內(nèi)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，會導(dǎo)致細胞快速的繁衍、數(shù)量劇增，參與細胞生長、分裂至衰老的整個歷程。CIP2A抑制機體內(nèi)PP2A的抑癌作用，穩(wěn)定的c-Myc蛋白表達增強可以促進細胞惡變，最后導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[2]。c-Myc可直接影響CIP2A的轉(zhuǎn)錄。CIP2A參與Ras對c-Myc的穩(wěn)定作用，促進c-Myc的表達。Ras可激活細胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK），使S62磷酸化，同時激活磷脂酰肌醇-3-激酶，通過抑制糖原合成激酶-3β抑制T58磷酸化，將c-Myc維持在S62磷酸化和T58去磷酸化狀態(tài)，從而阻斷c-Myc降解，穩(wěn)定c-Myc蛋白。但該過程中需要CIP2A的共同作用，因為僅有ERK不足以穩(wěn)定c-Myc。另外，CIP2A與EGFR-MEK1/2-ERK1/2通路、HGF/c-Met信號通路均有密切聯(lián)系[3]。有研究表明，CIP2A在人體各種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài)，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的進程中起重要作用[4]。CIP2A蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評估預(yù)后的指標(biāo)[5]，針對轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向治療研究也越來越多[6-8]，未來可能為癌癥帶來希望。

MACC1蛋白又名為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1，位于人類7號染色體[9]。MACC1蛋白是HGF/C-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的連接蛋白，起重要的橋梁作用，MACC1蛋白通過激活c-Met，協(xié)同調(diào)節(jié)控制HGF/c-Met信息傳輸，產(chǎn)生MACC1、HGF/c-Met信號路線的交互饋環(huán)路，促進腫瘤細胞惡變、侵襲、轉(zhuǎn)移的進展[10-11]。實驗證明在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶中，MACC1蛋白異常高表達，其調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞增殖、分化、遷移，與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。本實驗通過對30例胃癌組織和癌旁組織進行免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測MACC1蛋白表達，結(jié)果表明，MACC1蛋白在胃癌組織中同樣高表達，而在正常組織中不表達或低表達，與胃癌各臨床病理特征的關(guān)系中，MACC1蛋白與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度等因素密切相關(guān)，而與性別、年齡、組織類別無關(guān)，而在MACC1蛋白高表達的患者中，多數(shù)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，提示MACC1蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用，表明MACC1蛋白可以作為評估胃癌預(yù)后的獨立指標(biāo)。

MACC1和CIP2A兩種蛋白對胃癌都有突出的表現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)，如果對兩種蛋白所占比例做出確切檢測，將可以判斷出病情的惡性程度，并以此判斷患者的預(yù)后。

[1]郭慶,程凱.蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及與腫瘤關(guān)系的研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2014,27(2): 211-215.

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[4]張同軍,薛棟,李新軍,等.胰腺癌中CIP2A、PI3K和Survivin的表達及臨床意義[J].中國醫(yī)師雜志,2015,17(2):198-201.

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[12]祝倩倩,朱正秋.MACC1、HGF/c-Met和EMT在促進惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制中的相關(guān)性研究[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,33(11): 792-794.

（童穎丹 編輯）

Expressions of MACC1 and CIP2A proteins and their correlations with prognosis of gastric carcinoma

Min Li
(Department of Digestive Diseases,the First Affiliated Hospital Of Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia 014010,China)

Objective To investigate the expression of metastasis-associated in colon cancer 1(MACC1) protein in gastric cancerous tissue and adjacent noncancerous tissue and its relationships with the clinical pathological factors and the cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A(CIP2A)protein expression,and evaluate the prognosis so as to provide the train of thought for the treatment of gastric cancer.Methods RTPCR was used to assay the expression of MACC1 protein in gastric cancerous tissue and adjacent noncancerous tissue.Immunohistochemical assay was used to detect the expressions of MACC1 and CIP2A proteins in gastric cancerous tissue and adjacent noncancerous tissue of 30 cases.The relationships of the expression of MACC1 protein with clinical pathological factors and CIP2A protein were analyzed.Results The positive rate of MACC1 in the gastric cancerous tissue and the adjacent noncancerous tissue was 16.7%and 76.7%respectively,the difference was statistically significant.The positive rate of CIP2A protein expression in the gastric cancerous tissue and the adjacent noncancerous tissue was 23.3%and 73.3%respectively with significant difference.The expression of MACC1 protein was not significantly different between the patients with different gender,different age or different histological types of gastric cancers.However,the patients with different depth of tumor invasion,different degree of cancer differentiation,different degree of lymph node metastasis and different clinical stage had significant differences in MACC1 expression.MACC1 and CIP2A protein ex－pressions were positively correlated.Conclusions MACC1 protein expression is positively correlated with CIP2A protein expression,combined detection of both can help to determine the prognosis of the patients.

metastasis-associated in colon cancer 1 protein;cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A protein;gastric carcinoma;prognosis

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.005

1005-8982（2016）21-0025-05

2016-01-25