張雪青， 邵鄰相， 吳文才， 邵文麗， 趙鐵軍， 徐玲玲

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

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白術(shù)揮發(fā)油抑菌及抗腫瘤作用研究*

張雪青， 邵鄰相， 吳文才， 邵文麗， 趙鐵軍， 徐玲玲

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

選用浙江磐安產(chǎn)白術(shù)，用水蒸氣蒸餾法提取白術(shù)揮發(fā)油，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測出27種化學(xué)組分，其中主要是烯類化合物，含量最大的為莪術(shù)烯.比濁法檢測發(fā)現(xiàn)，白術(shù)揮發(fā)油對多種細菌具有較好的抑菌活性；噻唑藍(MTT)法檢測表明，白術(shù)揮發(fā)油對肺癌A549和宮頸癌Hela細胞生長皆有極明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);單細胞凝膠電泳結(jié)果表明，白術(shù)揮發(fā)油對腫瘤細胞DNA具有損傷作用.

白術(shù)；揮發(fā)油；抑菌活性；抗腫瘤作用

中藥白術(shù)為菊科多年生草本植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根莖，其性溫、味甘苦，具有健胃、益脾、補氣、利尿、和中等功效.白術(shù)為我國傳統(tǒng)中草藥，被列為“浙八味”中藥之一，主產(chǎn)于浙江、安徽、湖北和湖南等地，以浙江磐安、新昌地區(qū)產(chǎn)量最大[1-2].白術(shù)作為大宗常用藥材，藥用價值較高，國內(nèi)外需求量均較大.2013年我國白術(shù)出口量約為1.65萬t，較上年同比增加約50%；出口額達到6 417.16萬美元，同比上漲近174%[3].臨床上，白術(shù)具有較廣泛的用途和療效，為治療和改善腫瘤的常用中藥，可用于食管癌、胃癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤及肺癌的治療.此外，研究還表明，白術(shù)具有強壯、提高機體免疫力、改善胃腸功能和抑菌等作用[4-10].研究表明，白術(shù)主要成分為揮發(fā)油、內(nèi)酯及多糖化合物[11-13].近年來，對白術(shù)揮發(fā)油的生物活性研究逐漸成為研究的熱點.

目前，已有不少的實驗表明白術(shù)揮發(fā)油對動物腫瘤生長具有抑制作用.王翕等[14]、沈國慶等[15]及邱根全等[16]的研究表明，白術(shù)揮發(fā)油對小鼠移植性腫瘤肝癌H22及肉瘤S180有顯著的抑制作用.孫燁等[17]發(fā)現(xiàn)，白術(shù)揮發(fā)油對小鼠肺腺癌有明顯的抗癌性惡病質(zhì)作用.張宗等[18]發(fā)現(xiàn)，白術(shù)揮發(fā)油對小鼠艾氏腹水癌也有一定的抑制作用.文獻[19]的研究表明，含白術(shù)成分的四君子湯能夠抑制小鼠移植性胃癌的生長.然而，這些實驗主要集中于研究白術(shù)揮發(fā)油對動物實體瘤增長的抑制作用，有關(guān)體外相關(guān)實驗，特別是人源腫瘤的研究相對較少.另外，對白術(shù)基礎(chǔ)藥理分子作用機制方面的研究比較粗糙，仍需更深入的比較研究，這使白術(shù)作用于離體腫瘤細胞的研究工作顯得尤為重要，成為白術(shù)研究領(lǐng)域的焦點方向之一.本實驗旨在分析白術(shù)揮發(fā)油的主要成分，研究其對體外菌株和人肺癌和宮頸癌細胞增殖的影響，為傳統(tǒng)中藥白術(shù)的進一步開發(fā)利用提供一定的實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細菌、藥物和細胞

供試菌：鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、摩氏摩根菌、溶血性鏈球菌均來自浙江金華市中心醫(yī)院.

白術(shù)：浙江磐安地區(qū)產(chǎn)白術(shù)根莖.

細胞：人肺癌細胞株A549、人宮頸癌細胞株Hela，購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所.

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國Gibco.BRL公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季青生物公司；吐溫-80、二甲基四氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)，均為Sigma公司產(chǎn)品.

QP5050A型氣相色譜-質(zhì)譜儀：日本島津公司；3111型CO2培養(yǎng)箱、1500型全自動酶聯(lián)免疫檢測儀：美國熱電公司；熒光顯微鏡eclipse e600：日本尼康公司.

1.3 細胞培養(yǎng)和藥物處理

人肺癌細胞株A549和人宮頸癌細胞株Hela培養(yǎng)于含10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)基和雙抗(青霉素和鏈霉素，100 IU/mL)的完全培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2,飽和濕度環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng).

1.4 白術(shù)揮發(fā)油提取

選用浙江磐安地區(qū)產(chǎn)白術(shù)根莖，水蒸氣蒸餾法提取白術(shù)揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥，過濾滅菌后配制成5%白術(shù)揮發(fā)油乳劑，含3%吐溫-80，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.5 白術(shù)揮發(fā)油成分分析

以氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)分析白術(shù)揮發(fā)油成分.

色譜柱：VF-Wax石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μmol/L)；初始溫度為60 ℃(保持2 min)，升至250 ℃(保持10 min)，升溫速度為15 ℃/min；汽化溫度為230 ℃；載氣為He，流量為1.0 mL/min；分流比為200∶1；進樣量為1.0 μL.

質(zhì)譜檢測器：EI電離源,源溫為200 ℃，電離電壓為70 eV.質(zhì)譜標準庫為美國國家科學(xué)技術(shù)研究所出版的NIST庫.

1.6 揮發(fā)油抑菌活性測定

揮發(fā)油的抑菌活性測定采用比濁法.菌液濃度為2×104/mL，以100 μL/孔接種于96孔板上，然后加入揮發(fā)油100 μL，使其最終質(zhì)量濃度分別為1.25，2.50和5.00 mg/mL.以只加同體積培養(yǎng)基的為調(diào)零孔，并設(shè)置溶劑吐溫-80組.每組設(shè)4個復(fù)孔.置于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，利用全自動酶標儀在600 nm波長測定吸光度，按下式計算抑菌率：

1.7 細胞活力檢測

采用MTT法檢測細胞活力.取對數(shù)生長期的細胞，按90 μL/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)12 h后加入10 μL白術(shù)揮發(fā)油，使其最終質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，200，500和1 000 μg/mL.分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,待反應(yīng)4 h后棄去上清液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，排槍混勻至沉淀完全溶解，避光15 min后酶標儀在570 nm波長測定吸光度.同時設(shè)置培養(yǎng)基空白對照組和溶劑吐溫-80陰性對照組.每組設(shè)置4個復(fù)孔.如下計算抑制率:

1.8 DNA損傷檢測

以堿性單細胞凝膠電泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE)檢測DNA損傷程度.將載玻片浸泡0.2%瓊脂糖溶液后取出，37 ℃過夜干燥.在鍍過膜的載玻片上搭建蓋玻片，使之形成22 mm×10 mm×0.17 mm的狹縫.取待測細胞懸液與等量1%低熔點瓊脂糖溶液混勻，將細胞懸液灌入窄縫中，在瓊脂糖凝固后小心移去蓋玻片.用裂解緩沖液(2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，200 mmol/L NaOH，1%肌苷酸鈉，臨用前加入1%Triton和10%二甲基亞砜，pH 10)裂解細胞60 min,蒸餾水漂洗后置于電泳液(1 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13)中解旋20 min，隨后在0.86 V/cm強度下電泳20 min.電泳后，用中和液(0.4 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)清洗3次.從裂解至中和,溫度控制在4 ℃.依次用70%和100%乙醇液各脫水5 min，溴化乙錠溶液(20 μg/mL)染色15 min.用熒光顯微鏡eclipse e600拍照成像；用CASP軟件進行數(shù)據(jù)分析.

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗，OriginProPorable8.5軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

圖1 白術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分總離子流圖

2.1 白術(shù)揮發(fā)油的成分分析

氣相色譜-質(zhì)譜法分析得到白術(shù)揮發(fā)油的總離子流圖如圖1所示,共檢測出27種成分，主要為烯類化合物，占總峰面積的73%.表1顯示:莪術(shù)烯為白術(shù)揮發(fā)油的主要成分，含量達65.74%；5-異丙基-3,8-二甲基-1，2，4，5，6，7-六氫薁占總峰的10.46%；1,2,3,3a，4,5,6,7-八氫-1,4-二甲基-7-(1-甲乙基)-[1R-(1α,3aβ,4α,7β)]-甘菊環(huán)占7.11%；其余含量大于1%的有β-瑟林烯、(4aR,5S)-4a,5-二甲基-3-丙烷-2-亞基-5,6,7,8-四氫化-4H-2-萘亞甲基、4,4-二甲基-3-(3-甲基-3-亞丁烯基)-2-亞甲基二環(huán)[4.1.0]庚烷、石竹烯和1,3-異丙基三環(huán)[4,3.1.1(2,5)]十一碳-10-酮.

表1 白術(shù)揮發(fā)油的化學(xué)成分及其相對含量

表2 白術(shù)揮發(fā)油作用24 h對細菌生長的抑制作用

2.2 白術(shù)揮發(fā)油的抑菌效果

為了證實白術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性，本實驗采用比濁法檢測揮發(fā)油對細菌生長的影響.表2顯示,一定濃度的白術(shù)揮發(fā)油作用于細菌24 h后，各供試菌的生長均受到了顯著抑制.其中：白術(shù)揮發(fā)油對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌的抑制作用較明顯，抑菌率達95%以上；而對大腸桿菌、表皮葡萄球菌、摩氏摩根菌和溶血性鏈球菌的抑制作用相對較弱，在揮發(fā)油含量為5 mg/mL作用24 h后的抑菌率分別為29.74%，24.84%，27.10%和26.28%；1.25 mg/mL揮發(fā)油作用于肺炎克雷伯菌24 h后的抑制率為47.54%.

2.3 白術(shù)揮發(fā)油對癌細胞增殖的影響

為了檢測白術(shù)揮發(fā)油的抗腫瘤活性，本實驗利用MTT法檢測腫瘤細胞的生長，結(jié)果顯示：白術(shù)揮發(fā)油可以明顯地抑制人肺癌A549細胞和人宮頸癌Hela細胞的活性；而且，隨著揮發(fā)油劑量的增加，對腫瘤細胞生長的抑制作用增強，呈劑量依賴性.如圖2(a)所示，白術(shù)揮發(fā)油在10，20，50，100，200，500和1 000 μg/mL時作用于A549細胞24 h后，細胞生長抑制率分別為0.42%，4.07%，32.99%，49.16%，67.85%，80.38%和95.93%，隨著揮發(fā)油劑量的增加,腫瘤細胞生長抑制率增大.如圖2(b)所示，白術(shù)揮發(fā)油作用于Hela細胞時呈現(xiàn)同樣的抑制效果，在揮發(fā)油劑量為10，20，50，100，200和500 μg/mL時，Hela細胞生長的抑制率分別為6.95%，24.97%，30.06%，76.73%，88.2%和97.49%.以上結(jié)果表明，白術(shù)揮發(fā)油能夠明顯地抑制人肺癌A549和宮頸癌Hela細胞的增殖，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性.

(a)對人肺癌A549細胞 (b)對人宮頸癌Hela細胞圖2 MTT法檢測白術(shù)揮發(fā)油對腫瘤細胞增殖的抑制作用

圖3 彗星電泳法檢測白術(shù)揮發(fā)油對腫瘤細胞DNA的損傷

2.4 白術(shù)揮發(fā)油對腫瘤細胞DNA的損傷

為了進一步探究白術(shù)揮發(fā)油抑制腫瘤細胞生長的細胞生物學(xué)機制，本實驗采用單細胞凝膠電泳法檢測了腫瘤細胞DNA的受損情況.如圖3所示：50 μg/mL白術(shù)揮發(fā)油作用于A549細胞24 h后，與對照組相比，白術(shù)揮發(fā)油處理組細胞尾部DNA碎片明顯增多，“彗尾”也明顯增長(P<0.01)；20 μg/mL白術(shù)揮發(fā)油作用于Hela細胞24 h后，細胞尾部DNA碎片和“彗尾”也較對照組有極明顯的增加(P<0.01).這些結(jié)果均表明，白術(shù)揮發(fā)油以50,20 μg/mL分別作用于細胞24 h后，A549和Hela腫瘤細胞內(nèi)DNA明顯受損傷，可能引起細胞凋亡的發(fā)生.

3 討 論

文獻報道白術(shù)揮發(fā)油主要成分為蒼術(shù)醇、蒼術(shù)酮和萜烯類化合物，這與本實驗的氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果基本一致.然而，關(guān)于白術(shù)揮發(fā)油的具體成分及含量，不同的文獻報道有所差異，這些差異主要與白術(shù)的產(chǎn)地、揮發(fā)油的提取工藝及成分分析方法有關(guān).本實驗對白術(shù)揮發(fā)油成分的分析表明，在所有組分中，莪術(shù)烯的含量最高，占65.74%.這與彭萬仁等[20]報道的河南白術(shù)揮發(fā)油中含量最高的成分一致，但其含量相對較低.這可能與本實驗選用品質(zhì)較優(yōu)的浙江白術(shù)有關(guān).

目前，有關(guān)植物揮發(fā)油抑菌作用的研究報道比較多，但有關(guān)白術(shù)揮發(fā)油抑菌作用的研究鮮有報道.本實驗研究表明，白術(shù)揮發(fā)油具有抑制多種菌株生長的作用，且抑制效果具有菌種差異性.這為白術(shù)揮發(fā)油抑菌效果的研究提供了一定的實驗依據(jù).

本文重點分析了白術(shù)揮發(fā)油對人腫瘤細胞體外增殖的影響.結(jié)果表明，白術(shù)揮發(fā)油可明顯抑制人宮頸癌HeLa和肺癌A549細胞的增殖，從離體實驗的角度證實了白術(shù)的抗腫瘤作用，為后續(xù)研究白術(shù)抑制腫瘤細胞生長的機制提供了一定的參考.隨著白術(shù)抗腫瘤作用的進一步揭示，研究者對白術(shù)抗腫瘤的相關(guān)機制進行了一些初步的探討，主要有以下幾個方面：1)引起細胞凋亡或壞死.文獻[21-22]的研究表明，白術(shù)通過調(diào)控凋亡抑制基因bcl-2、突變型P53基因的表達而誘導(dǎo)小鼠S180肉瘤細胞的凋亡；文獻[23]發(fā)現(xiàn),白術(shù)內(nèi)酯能夠抑制細胞自我更新并通過阻止Notch信號通路影響胃癌細胞生長.2)阻遏細胞周期.鄭芳等[24]發(fā)現(xiàn),白術(shù)阻遏大鼠小腸隱窩細胞IEC-6于G1/M期；文獻[25]研究表明,白術(shù)內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)小鼠B16黑色瘤細胞G1期阻滯.3)抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移.王郁金等[26]研究表明,白術(shù)揮發(fā)油可能通過抑制MMP-9的分泌起到抗小鼠H22肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的作用.4)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié).文獻[16-17,27]發(fā)現(xiàn)，白術(shù)揮發(fā)油通過調(diào)節(jié)血清細胞因子TNF-α，IL-6和IL-2的異常表達抑制癌性惡病質(zhì)，并可提高免疫球蛋白G，M和A的水平；文獻[10]研究表明，白術(shù)可以有效提高小豬血清中IgG和IL-1的表達水平，從而提高機體免疫力.然而，這些研究主要集中于動物在體實驗，具體機制研究比較淺顯，還需要更深入地進行分子機制的探索.對于白術(shù)抗腫瘤成分的研究，目前多數(shù)文獻報道已證實白術(shù)揮發(fā)油為抗腫瘤的主要成分，但其中具體成分仍不是很清楚.沈國慶等[15]的實驗結(jié)果表明，白術(shù)揮發(fā)油的抗腫瘤成分可能存在于白術(shù)揮發(fā)油中極性小的部分，這為分析分離白術(shù)揮發(fā)油中抗腫瘤活性成分給出了一定的提示.然而，也有少數(shù)文獻對白術(shù)中的多糖及一些氨基酸成分進行了研究報道.文獻[28]研究表明，白術(shù)多糖可通過提高CD4+和CD8+T細胞的表達水平，改善免疫力;張小平等[29]發(fā)現(xiàn),白術(shù)多糖對人白血病細胞K562有明顯的抑制作用，這將引起研究者對白術(shù)的另一類有效成分——多糖生物活性的關(guān)注.此外，以后的研究可以考慮一些復(fù)方制劑，如白術(shù)和其他抗癌藥物的聯(lián)用.

白術(shù)作為我國傳統(tǒng)的中草藥，已有報道顯示白術(shù)揮發(fā)油有多種生物活性，但由于其成分復(fù)雜、化學(xué)穩(wěn)定性差，對于白術(shù)揮發(fā)油的生物活性所對應(yīng)的具體成分的研究有一定的困難.此外，白術(shù)產(chǎn)地、提取工藝的不同導(dǎo)致成分分析結(jié)果存有一定的差異，因此，還需要統(tǒng)一可靠的藥材鑒定分析手段.這些問題的解決將對白術(shù)抗腫瘤作用的具體分子機制的分析有著重大的意義，為白術(shù)的進一步開發(fā)利用提供可靠依據(jù).

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

On the anti-bacterial and anti-tumor functions ofAtractylodesmacrocephalaKoidz volatile oil

ZHANG Xueqing， SHAO Lingxiang， WU Wencai， SHAO Wenli， ZHAO Tiejun， XU Lingling

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

AtractylodesmacrocephalaKoidz, a traditional Chinese medicine, was dried roots of compositae.Atractylodesmacrocephalafrom Pan′an, Zhejiang Provice was used in this study. The essential oil from atractylodes was extracted by steam distillation, the chemical constituents were analyzed by GC/MS. Twenty-seven compositions were identified and most of the compounds were Alkenes. The anti-bacterial effect of essential oil was observed in a nephelometry assay. In addition, the essential oil could suppress the growth of two human cancer cell lines, A549 cells and Hela cells, in a dose dependent manner. After treating the tumor cells withAtractylodesmacrocephalaKoidz volatile oil, DNA damage was detected by single cell gel electrophoresis assay.

Atractylodesmacrocephala; volatile oil; antibacterial; antitumor

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.04.013

2015-09-02；

2015-12-25

國家自然科學(xué)基金面上項目(31470262)；浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目(2015C33149)；浙江省重中之重學(xué)科“生物學(xué)”2014年度開放基金資助項目(KFJJ2014003)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新暨新苗人才計劃項目(2015R404011)

張雪青(1990-)，女，陜西富平人，碩士研究生.研究方向：分子細胞生物學(xué).

徐玲玲.E-mail: xll0518@zjnu.cn

Q949.95

A

1001-5051(2016)04-0436-07