黃征+張紅醫(yī)

摘要 建立了柱前衍生-酸誘導(dǎo)瞬時(shí)等速堆積柱上富集毛細(xì)管電泳測(cè)定巰基化合物的方法。在Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.15）中， 巰基化合物與2-氯-1-甲基碘化吡啶在室溫條件下反應(yīng)10 min；隨后，將反應(yīng)混合物引入到充滿40 mmol/L甲酸鹽背景電解質(zhì)溶液（pH=3.96）的毛細(xì)管柱內(nèi)；最后，向毛細(xì)管柱中引入適量稀H2SO4溶液。當(dāng)在毛細(xì)管柱兩端施加正向電壓時(shí)，衍生的巰基化合物就會(huì)經(jīng)瞬時(shí)等速堆積電泳過程而發(fā)生富集，其中前導(dǎo)和尾隨離子分別為H+和Tris+。以半胱氨酸和巰基乙酸為分析對(duì)象，檢測(cè)波長設(shè)為312 nm，優(yōu)化了酸誘導(dǎo)瞬時(shí)等速堆積柱上富集的各種實(shí)驗(yàn)條件。在最佳條件下，半胱氨酸和巰基乙酸的線性范圍分別為10～100 mg/L和4～100 mg/L，檢出限分別為0.2和0.4 mg/L。本方法用于脫毛膏中巰基乙酸的測(cè)定， 結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 巰基化合物； 半胱氨酸； 巰基乙酸鈉； 柱前衍生； 柱上富集； 毛細(xì)管電泳

2015-12-28投稿；2016-04-22接受

本文系河北省自然科學(xué)基金（No. B2013201234）資助

E-mail： hyzhang@hbu.edu.cn

1 引 言

巰基化合物在生理學(xué)和病理學(xué)[1～6]、化工生產(chǎn)[7，8]和食品生產(chǎn)[9]等方面具有重要價(jià)值。對(duì)于缺少生色團(tuán)的低分子量巰基化合物，在紫外區(qū)的摩爾吸光系數(shù)較小，其信號(hào)常被樣品中共存組分的吸收信號(hào)淹沒，因此檢測(cè)這類無生色團(tuán)的巰基化合物通常采用色譜類方法將其與共存物分離后再檢測(cè)，諸如反相高效液相色譜[10，11]、毛細(xì)管電泳法（CE）[12]等。

毛細(xì)管電泳-紫外分析法（CE-UV）已用于化妝品中巰基乙酸的檢測(cè)[12]，但巰基乙酸常與其它成分相伴出現(xiàn)在電泳圖中，對(duì)巰基乙酸的測(cè)定會(huì)有一定程度的影響。金納米粒子可選擇性地與巰基化合物發(fā)生相互作用，所以經(jīng)金納米懸浮液處理后，樣品中的巰基化合物可得到有效凈化，避免了共存組分對(duì)巰基化合物CE-UV檢測(cè)的干擾[13，14]。但該法吸附和解吸附巰基化合物均要耗時(shí)1 h以上。文獻(xiàn)報(bào)道了一種基于2-氯-1-甲基喹啉四氟硼酸鹽衍生反應(yīng)的瞬時(shí)等速電泳測(cè)定巰基化合物的方法，但該試劑需自行合成并提純[15～17]。

本研究選擇巰基乙酸和半胱氨酸作為目標(biāo)分子，將巰基化合物的柱前衍生和柱上富集毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)結(jié)合，建立了巰基化合物的高靈敏度快速測(cè)定方法。2-氯-1-甲基碘化吡啶（CMPI）與巰基化合物可在室溫及pH=8.15的Tris-HCl緩沖溶液中快速反應(yīng)[18]，該產(chǎn)物可與酸誘導(dǎo)柱上富集毛細(xì)管電泳方法相契合。巰基乙酸是脫毛膏化妝品的重要成分，利用本方法對(duì)脫毛膏樣品中巰基乙酸含量進(jìn)行了測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（Beckman， Fullerton， CA，USA）。紫外檢測(cè)器及32karat色譜工作站。石英毛細(xì)管（60.2 cm×75 μm ×10 cm，河北邯鄲瑞豐色譜配件廠）。紫外可見分光光度計(jì)（上海優(yōu)尼柯公司）。

除2-氯-1-甲基碘化吡啶（CMPI， >98%，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）以外，其它試劑均為分析純。巰基乙酸鈉 （TGA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），L-半胱氨酸 （Cys，Amresco分裝）。脫毛膏購自本地超市。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中依次加入2 mL Tris-HCl緩沖液（pH=8.15）、2 mL Cys和TGA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（或樣品溶液）、1 mL CMPI（10 mmol/L）溶液，然后渦旋30 s，并在室溫下放置10 min。該溶液供毛細(xì)管電泳分析使用。

0.25 g脫毛膏與10 mL水超聲提取15 min，依次經(jīng)過離心、過膜、稀釋10倍處理后，進(jìn)行上述衍生反應(yīng)。

2.3 電泳條件及HPLC條件

毛細(xì)管柱在使用前，依次用0.1 mol/L HCl、蒸餾水、0.1 mmol/L NaOH和背景電解質(zhì)沖洗。兩次運(yùn)行間，分別用0.1 mol/L NaOH沖洗2 min和背景電解質(zhì)沖洗4 min。分離電壓10 kV，檢測(cè)波長312 nm，溫度為25℃，運(yùn)行緩沖溶液為40 mmol/L甲酸鹽溶液（pH=3.96）。壓力進(jìn)樣（0.5 psi×20 s），誘導(dǎo)酸的導(dǎo)入（0.5 psi×11 s）。

HPLC條件： 色譜儀： LC-20A HPLC（Shimadzu， Japan）； 耐酸色譜柱： Diamonsil C18 HPLC柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，迪馬公司）； 流動(dòng)相： 乙腈 + 0.01 mol/L KH2PO4（10∶90， V/V， pH 2.5）； 流速： 1.0 mL/min； 檢測(cè)波長： 215 nm； 柱溫： 30℃； 進(jìn)樣量： 20 。

分 析 化 學(xué)第44卷

第7期黃 征等： 柱前衍生-酸誘導(dǎo)瞬時(shí)等速堆積柱上富集毛細(xì)管電泳法測(cè)定巰基化合物

3 結(jié)果與討論

3.1 衍生反應(yīng)及檢測(cè)波長

CMPI與巰基化合物在弱堿性條件下反應(yīng)生成硫醚類衍生物[19]。據(jù)此，TGA和Cys與CMPI存在如下化學(xué)反應(yīng)：

圖1為TGA、Cys、衍生試劑CMPI、TGA-R+過量CMPI以及Cys-R+過量CMPI的紫外光譜圖（均以水為參比）。未經(jīng)衍生反應(yīng)處理的TGA和Cys，在200～400 nm范圍內(nèi)沒有明顯吸收峰。衍生試劑CMPI在227和 272 nm附近存在明顯吸收。TGA-R+過量CMPI和Cys-R+過量CMPI分別有兩個(gè)吸收峰，分別位于227和312 nm附近，且衍生試劑和未衍生的TGA 和Cys三者均在312 nm沒有吸收信號(hào)。因此，最佳檢測(cè)波長為312 nm。

3.2 酸誘導(dǎo)柱上富集毛細(xì)管電泳條件優(yōu)化

3.2.1 酸誘導(dǎo)柱上富集的流程 在樣品引入到毛細(xì)管柱前[20]或后[21～23]引入適量酸，是毛細(xì)管柱富集的兩種方式，為此考察了直接進(jìn)樣（如圖2b）、先引入適量H2SO4再進(jìn)樣（如圖2c）、以及先進(jìn)樣再引入適量H2SO4（圖2a）3種情況下，TGA和Cys的分離情況。

由圖2a可見，通過酸誘導(dǎo)柱上富集， TGA和Cys被成功的分離富集。圖3給出這種富集過程的一般流程： 第一步（如圖3A），背景電解質(zhì)充滿毛細(xì)管柱； 第二步（圖3B），壓力進(jìn)樣法將Cys-R與TGA-R引入到毛細(xì)管中； 第三步（圖3C），壓力進(jìn)樣法引入適量H2SO4； 第四步（圖3D），施加一定的電壓實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)等速富集和分離； 第五步，瞬時(shí)等速和分離（圖3E）。由于H+的遷移速度快，可掃過樣品區(qū)帶，因此剩余的H+起到了前導(dǎo)電解質(zhì)作用， 而被H+質(zhì)子化的Tris+起尾隨電解質(zhì)作用，衍生試劑、Cys-R、TGA-R的淌度均在二者之間，從而達(dá)到瞬時(shí)等速電泳的效果，實(shí)現(xiàn)柱上富集與分離。

3.2.2 酸的種類的影響 為了比較不同種類誘導(dǎo)酸的分離效果，分別選擇了150 mmol/L HCl， H3PO4和H2SO4作為誘導(dǎo)酸進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。由圖4可見，HCl和H3PO4作為誘導(dǎo)酸時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)Cys-R與TGA-R的分離； 誘導(dǎo)酸為稀H2SO4時(shí)，可實(shí)現(xiàn)Cys-R與TGA-R的分離，且分離度有顯著提高。

由于誘導(dǎo)酸中H+移動(dòng)速度快，所以可快速進(jìn)入到樣品區(qū)發(fā)生中和反應(yīng)。

過剩的H+既起到前導(dǎo)電解質(zhì)的作用，又可降低樣品區(qū)的pH值，使分析物呈正電荷形式。誘導(dǎo)酸的緩沖容量和可提供的H+數(shù)量，是決定富集和分離的重要因素。本研究選擇稀H2SO4為誘導(dǎo)酸。

3.2.3 酸引入時(shí)間及酸濃度的影響 保持樣品進(jìn)樣量（0.5 psi × 20 s）和分離電壓（10 kV）恒定，考察了稀H2SO4（150 mmol/L）的不同引入時(shí)間對(duì)分離度（R=2[t（TGA-R）-t（Cys-R）]/（W（TGA-R）+W（Cys-R）））的影響。當(dāng)稀H2SO4引入時(shí)間在7.5～11.0 s內(nèi)變化時(shí)，Cys-R與TGA-R兩峰的分離度隨酸引入量的增加而增大； 當(dāng)稀H2SO4的引入時(shí)間在11.0～15.0 s內(nèi)變化時(shí)，兩峰的分離度基本上保持不變。當(dāng)酸引入時(shí)間較短時(shí)，滴定樣品區(qū)后過剩的H+也會(huì)使樣品區(qū)的酸度提高，但還不足以使兩分析物呈現(xiàn)完全質(zhì)子化的形式； 隨著酸引入時(shí)間的進(jìn)一步延長，樣品區(qū)酸度進(jìn)一步加大，分析物呈完全質(zhì)子化的形式，分離度達(dá)到最大。以下實(shí)驗(yàn)稀H2SO4的引入時(shí)間均為11 s。

在其它分析條件保持不變的前提下，考察了誘導(dǎo)酸稀H2SO4濃度對(duì)分離度的影響。當(dāng)H2SO4濃度小于130 mmol/L時(shí)，Cys-R與TGA-R的分離度為零； 當(dāng)H2SO4濃度在130～180 mmol/L范圍內(nèi)變化時(shí)，Cys-R與TGA-R分離度在2.0～2.5范圍內(nèi)變化，且當(dāng)H2SO4濃度為150 mmol/L時(shí)，兩峰的對(duì)稱性均很好。H2SO4濃度過低時(shí)，由于不能提供過剩的H+，不滿足柱上富集的條件； 而H2SO4濃度過高時(shí)，會(huì)增加中和反應(yīng)的速度，加劇運(yùn)行過程中熱量的產(chǎn)生，局部湍流而使峰展寬。因此，H2SO4濃度選擇為150 mmol/L。

3.3 方法評(píng)價(jià)和樣品測(cè)定

表1為TGA和Cys的線性范圍、檢出限及精密度等評(píng)價(jià)指標(biāo)。以工作曲線法進(jìn)行定量測(cè)定，校正峰面積（峰面積與遷移時(shí)間的比值，A/t）與分析物濃度TGA（4～100 mg/L）和Cys（10～100 mg/L）之間呈良好的線性關(guān)系（r=0.998），TGA和Cys的精密度在1.3%～4.8%之間，檢出限分別是0.4和0.2 mg/L。

應(yīng)用本法測(cè)定了3種脫毛膏樣品中TGA，結(jié)果見表2。測(cè)得處理后的樣品溶液中TGA濃度在8.9～17.7 mg/L之間，折合為脫毛膏樣品中巰基乙酸鈣含量為1.2%，3.6%，2.7%，符合TGA含量小于5%的要求[24]。加標(biāo)回收率在90%～104%之間。圖5A為應(yīng)用本方法測(cè)定TGA和Cys標(biāo)準(zhǔn)混合物的電泳圖、脫毛膏的電泳圖及添加TGA后脫毛膏的電泳圖； 圖5B為按文獻(xiàn)[25]測(cè)定脫毛膏中TGA的HPLC圖。本方法分析時(shí)間短、電泳圖更簡(jiǎn)單； 而HPLC法分析時(shí)間長，且TGA峰會(huì)受到共存物干擾而影響測(cè)定。這表明本方法在巰基化合物檢測(cè)方面具有一定的應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

建立了CMPI柱前衍生-酸誘導(dǎo)毛細(xì)管瞬時(shí)等速富集法測(cè)定巰基化合物的方法。本方法所選用的商用衍生試劑價(jià)格低、反應(yīng)條件溫和、室溫下快速定量反應(yīng)，衍生產(chǎn)物為陽離子，故易于與后續(xù)電泳條件相契合實(shí)現(xiàn)酸誘導(dǎo)柱上富集。本方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品的分析。

References

1 Go Y M， Jones D P. Free Radical Bio. Med.， 2011， 50（4）： 495-509

2 Millea P J. Am. Fam. Physician， 2009， 80（3）： 265-269

3 Tang M C， Cheng L， Qiu L， Jia R G， Sun R Q， Wang X P， Hu G Y， Zhao Y. Eur. Rev. Med. Pharmaco. Sci.， 2014， 18（2）： 160-164

4 Tan S T， Itinteang T， Day D J， O′Donnell C， Mathy J A， Leadbitter P. Brit. J. Dermatol.， 2012， 167（3）： 619-624

5 Besouw M， Masereeuw R， Van den heuvel L， Levtchenko. Drug Discov. Today， 2013， 18（15）： 785-792

6 Chakor R T， Bharote H， Eklare N， Tamboli K. Ann. Indian Acad. Neur.， 2015， 18（1）： 115-116

7 YANG Xin-Ling， MA Li-Jun， NIU Jia-Rong， WANG Xiao-Yuan. Wool Text. J.， 2015， 43（5）： 22-25

楊心玲， 馬麗君， 牛家?guī)V， 王曉淵. 毛紡科技， 2015， 43（5）： 22-25

8 XIE Chan， JIA Zhi-Xin， LUO Yuan-Fang， JIA De-Min. Acta Polymerica Sinica， 2011， （3）： 320-326

謝 嬋， 賈志欣， 羅遠(yuǎn)芳， 賈德民. 高分子學(xué)報(bào)， 2011， （3）： 320-326

9 Elkhalifa A E O， EI-Tinay A H. Food Chem.， 2002， 77（2）： 133-137

10 Huang K J， Han C H， Han C Q， Li J， Wu Z W， Liu Y M. Microchim Acta， 2011， 174（3-4）： 421-427

11 Cavrini V， Andrisano V， Gatti R， Scapini G. Int. J. Cosmetic. Sci.， 1990， 12（4）： 141-150

12 Xie N， Ding X， Wang X， Wang P， Zhao S， Wang Z. J. Pharmaceut. Biomed. Anal.， 2014， 88： 509-512

13 Li M D， Cheng T L， Tseng W L. Electrophoresis， 2009， 30（2）： 388-395

14 Chang C W， Tseng W L. Anal. Chem.， 2010， 82（7）： 2696-2702

15 Kubalczyk P， Bald E， Furmaniak P， Glowacki R. Anal. Methods， 2014， 6（12）： 4138-4143

16 Kubalczyk P， Bald E. Electrophoresis， 2009， 30（13）： 2280-2283

17 Kubalczyk P， Chwatko G， Bald E. Curr. Anal. Chem.， 2014， 10（3）： 375-380

18 Bald E， Kaniowska E， Chwatko G， Glowacki R. Talanta， 2000， 50（6）： 1233-1243

19 Chwatko G， Bald E. Talanta， 2000， 52（3）： 509-515

20 Wang X， Chen Y. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（43）： 7324-7328

21 Quirino J P， Breadmore M C. J. Sep. Sci.， 2012， 35（1）： 60-65

22 Arribas A S， Moreno M， Bermejo E， Zapardiel A， Chicharro M. Electrophoresis， 2011， 32（2）： 275-283

23 Lu Y， Bai H， Kong C， Zhang H， Breadmore M C. Electrophoresis， 2013， 34（24）： 3326-3332

24 Hygienic Standard for Cosmetics. Documents of Ministry of Health People′s Republic of China 2007： 68-68

化妝品衛(wèi)生規(guī)范. 中國人民共和國衛(wèi)生部. 2007： 68-68

25 Methods for Determination of Thioglycolic Acid in Cosmetics. Documents of China′s Food and Drug Administration. Accessory Four， 2012： 17-19

Abstract A new method was developed for the determination of mercapto compounds by pre-column derivatization combined with acid-induced transient isotachophoretic stacking capillary electrophoresis. Mercapto compounds were derivatized with 2-chloro-1-methylpyridinium iodide （CMPI） in Tris-HCl buffer solution at pH 8.15 at room temperature. The derivatized mercapto compounds were introduced into the capillary filled up with 40 mmol/L formate buffer （pH=3.96）， followed by injection of diluted sulfuric acid. Upon application of voltage at normal polarity， the derivatized mercapto compounds were preconcentrated due to transient isotachophoresis stacking electrophoresis with H+ as the leading ion and Tris+ as the terminating ion. The detection wavelength was set at 312 nm. Cysteine and sodium thioglycolate were chosen as the models of mercapto compounds to be detected. Various experimental factors influencing transient isotachophoresis stacking were investigated. Under the optimal conditions， the linear relation between peak area and concentration was obtained in the range from 10 mg/L to 100 mg/L for cysteine， and from 4 mg/L to 100 mg/L for sodium thioglycolate. The LODs were 0.2 mg/L and 0.4 mg/L for cysteine and sodium thioglycolate， respectively. The developed method was successfully applied to the determination of thioglycolate in depilatory cream samples.

Keywords Mercapto compounds； Cysteine； Sodium thioglycolate； Pre-column derivation； On-column enrichment； Capillary electrophoresis